DE19755302A1 - Neuer Transkriptionsfaktor CPCR1 zur Regulation des Isopenicillin N-Synthetase-Gens (pcbC) und des AC-/ACV-Synthetase-Gens (pcbAB) - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein DNA bindendes Protein, welches an doppelsträngige DNA der Sequenz GTTGCCGGGCCAATCCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 4) aus dem intergenischen Bereich des pcbAB und pcbC-Gens von Acmmonium chrysogenum bindet und in der Lage ist, die Transkription des pcbAB und/oder pcbC-Gens zu beeinflussen.

1. Regulation der Genexpression mittels Transkriptionsfaktoren bei Pilzen

Die Genexpression wird u. a. über die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation reguliert. Das Vorhandensein von sogenannten Transkriptionsfaktoren kann dabei einen positiven oder einen negativen Einfluß haben. Transkriptionsfaktoren sind trans-wirkende DNA-Bindeproteine, die zum Beispiel an DNA-Elemente innerhalb der regulatorischen Sequenzen eines Gens binden können. Die Spezifität der DNA-Protein-Interaktion wird durch Kontakte zwischen den beteiligten Nukleotiden, bzw. dem DNA-Rückgrad und den Aminosäuren und ihren Seitenketten erreicht (Zusammenfassung bei Pabo und Sauer 1992).

Transkriptionsfaktoren werden nach den strukturellen Eigenschaften ihrer DNA-Bin­ dedomänen in verschiedenen Klassen eingeteilt. So kennt man zum Beispiel Helix-Turn-Helix-, Homeodomain-, Zinkfinger oder auch Leucin-Zipper-Proteine (Zusammenfassung bei Pabo und Sauer 1992). Die meisten Klassen von Transkriptionsfaktoren wurden auch bei Hyphenpilzen entdeckt und charakteristische Beispiele werden in Tabelle 1 genannt. Insgesamt wurden etwa 50 Transkriptionsfaktoren von Hyphenpilzen molekular charakterisiert. Mit circa 20 klonierten Transkriptionsfaktoren gehört Aspergillus nidulans unter den Hyphenpilzen zu den Organismen, über deren transkriptionelle Regulation der Genexpression am meisten bekannt ist. Bei Neurospora crassa liegen detaillierte Kenntnisse zum Beispiel über die Regulation der Gene für die Verwertung von Nitrat zur Deckung des Stickstoffbedarfs vor (Marzluff 1993). Das nit-3 Gen kodiert für die Nitratreduktase und stellt das erste Gen des Stoffwechselweges für die Nitratassimilation dar. Die Expression dieses Gens wird von zwei regulatorischen Proteinen (NIT2 und NIT4) gesteuert. Wobei es sich bei NIT2 um ein allgemeines regulatorisches Protein und bei NIT4 um einen Stoffwechselweg-spezifischen Transkriptionsfaktor handelt (Chiang und Marzluff 1995). NIT4 gehört zur Klasse der Zn(II)₂Cys₆-Zinkfingerproteine, die bislang nur bei Pilzen gefunden wurden (Schjerling und Holmberg 1996). Ein anderes sehr gut analysiertes Beispiel dieser Klasse ist das GAL4-Protein der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Aus dem β-Lactam-Produzenten Acmmonium chrysogenum wurden bisher keine Transkriptionsfaktoren isoliert. Es wurden lediglich biochemische Charakterisierungen von DNA-Bindeproteinen vorgenommen, die mit Cephalosporin C-Biosynthese-Genen in Wechselwirkung treten (Radzio 1996, Then Bergh et al. 1996).

2. Produktion von β-Lactamantibiotika durch Mikroorganismen

Die β-Lactame sind seit der Entdeckung des Penicillins durch Alexander Fleming im Jahre 1929 eine der erfolgreichsten Wirkstoffgruppen mit antibakterieller Potenz. Ursprünglich als eine Kontamination auf einer Petrischale mit Staphylococcen aufgrund seiner wachstumshemmenden Eigenschaften entdeckt, konnte der Pilz Penicillium notatum zur ersten biotechnologischen Produktion eines Medikamentes genutzt werden. Chain und Florey isolierten 1940 den Wirkstoff Penicillin und setzten ihn klinisch ein. Das chemische Grundgerüst der Penicilline, die 6-Aminopenicillansäure (6-APA), kann verschiedene Substituenten tragen, was die große Vielfalt der β-Lactame bedingt. Penicilline zeigen sich äußerst wirksam gegen Gram-positive Bakterien wie Staphylococcus aureus. Allerdings haben viele Bakterienstämme im Laufe der Zeit Resistenzen entwickelt.

Bei der Entwicklung neuer Penicillin-Derivate wurden z. B. halbsynthetische Antibiotika eingesetzt, bei denen eine fermentativ produzierte Vorstufe, das Penicillin G, chemisch oder enzymatisch zu 6-APA umgesetzt wird. Diese kann anschließend zu den Wirksubstanzen weiterverarbeitet werden. Zum anderen wurde schon frühzeitig damit begonnen, nach weiteren natürlichen β-Lactamen zu suchen.

1953 konnte aus dem Kulturfiltrat des Hyphenpilzes Acremonium chrysogenum (syn. Cephalosporium acremonium) neben dem bereits bekannten Penicillin N eine weitere β-Lactam-Stammverbindung, das Cephalosporin C isoliert werden. A. chrysogenum zählt wie Penicillium chrysogenum zu den filamentös wachsenden Pilzen, die sich morphologisch deutlich von Hefen oder einzelligen Bakterien abgrenzen lassen.

Cephalosporine unterscheiden sich von den Penicillinen durch ein modifiziertes Grundgerüst. Sie werden im Gegensatz zu den Penicillinen außer von Hyphenpilzen auch von Bakterien synthetisiert.

Ähnlich wie bei den Penicillinen werden in der Pharmakologie im wesentlichen halbsynthetische Cephalosporine eingesetzt, die ausgehend von der 7-Aminocephalosporansäure (7-ACS) synthetisiert werden. Die heute verwendete "dritte Generation" der Cephalosporine zeichnet sich durch ein breites Aktivitätsspektrum auch gegen Gram-negative Bakterien, von denen viele Resistenzen gegen Antibiotika zeigen, geringe Humantoxizität und gute Stabilität gegen bakterielle β-Lactamasen aus. A. chrysogenum ist bis heute der wichtigste Produzent der entsprechenden Vorstufen. Der Biosyntheseweg und die äußeren Faktoren, die auf die Synthese wirken, sind im Prinzip bekannt. Durch konventionelle Mutagenseverfahren und Auswahl hat man Hochleistungsstämme erzeugt, die Antibiotika in großen Mengen synthetisieren. Produzierte der von Fleming isolierte Stamm noch 0,0012 g Penicillin pro Liter Kultur, so erzielt man in heutigen Prozessen ca. 50 g Penicillin oder über 20 g Cephalosporin C pro Liter Kulturmedium. Eine notwendige weitere Verbesserung der Selektivität und Produktivität erfordert jedoch immer bessere Produktionsstämme. Dieses ist nicht mehr allein durch Zufallsmutagenese zu erreichen, sondern erfordert alternative Methoden. Der Einsatz molekulargenetischer Techniken zur gezielten Beeinflussung der Biosyntheseenzyme erscheint deshalb vielversprechend zu sein.

3. Physikalische Organisation des pcbAB/pcbC intergenischen Bereichs von Acremonium chrysogenum

Beim Versuch, aus Streptomyces coelicolor Gene zu klonieren, die an der Biosynthese des Antibiotikums Actinorhodin beteiligt sind, wurde zunächst festgestellt, daß die gesamte Information, die zur Biosynthese notwendig war, auf einem 33 000 Basenpaare langen DNA-Fragment lag. Nach Transformation dieses Fragmentes in einen anderen Stamm von Streptomyces, welcher diese Gene nicht enthielt, konnte dieser Actinorhodin synthetisieren. Dieses war der erste Hinweis auf eine Vielzahl von Antibiotikasynthesegenen auf einem relativ kurzen DNA-Abschnitt in einem Prokaryonten. Später konnte gezeigt werden, daß die Kopplung der Biosynthesegene für ein anderes Antibiotikum, das Cephamycin, bei Streptomyces soweit geht, daß die Information aus zwei verschiedenen Genen, dem für die Epimerase (cefD) und dem für die Expandase (cefEF), gemeinsam in RNA umgeschrieben wird. Parallel dazu wurde untersucht, ob in Eukaryonten ähnliche Verhältnisse vorliegen. Experimente mit Penicillium zeigten, daß das penDE-Gen, das für eine Isopenicillin-N-Acyltransferase kodiert, unmittelbar stromabwärts des pcbC-Gens lag. Das entgegengesetzt transkribierte pcbAB-Gen ist ebenfalls dem pcbC-Gen unmittelbar benachbart. Damit wurde gezeigt, daß die Gene für den Biosyntheseweg der Penicilline als "Cluster" organisiert sind.

In A. nidulans findet sich die gleiche Anordnung der Pernicillinbiosynthesegene wie bei P. chrysogenum. Untersuchungen an A. chrysogenum oder beim Actinomyceten Nocardia Lactamdurans zeigten, daß hier ebenfalls die für die generellen Schritte der Penicillinbiosynthese verantwortlichen Gene in gleicher Weise organisiert sind. Bei den bakteriellen β-Lactamproduzenten, welche die Biosynthese über den Cephamring fortsetzen, liegen die Gene für die darauffolgenden Schritte ebenfalls nebeneinander, in Acremonium dagegeben in einem separaten "Gen-cluster" auf dem Chromosom II. Interessant sind Untersuchungen an Hochleistungsstämmen von P. chrysogenum bezüglich ihrer Gendosis. In einem Stamm mit erhöhter Penicillinproduktion liegt das pcbC-Gen in mehreren Kopien und im Hochleistungsstamm As-P-78 der gesamte "Clüster" der Gene fünffach vor. Durch die Genvervielfachung kommt es zu einer erhöhten Biosynthese der Genprodukte, da mehrere Kopien gleichzeitig exprimiert werden können.

Das β-Lactamantibiotikum Cephalosporin C wird durch die enzymatische Aktivität mehrerer Proteine in A. chrysogenum synthetisiert. Die ersten beiden Syntheseschritte werden durch die AC-/ACV-Synthetase und die Isopenicillin N-Synthetase katalysiert. Beide Enzyme werden durch das pcbAB- bzw. das pcbC-Gen kodiert, welche im Genom benachbart und divergent angeordnet sind. Die Transkription beginnt im gemeinsamen intergenischen Promotorbereich der beiden Gene.

4. Das Hefe ONE-HYBRID-SYSTEM als Methode zur Isolation von Transkriptionsfaktoren

Das ONE-HYBRID-SYSTEM (Clontech 1995) bietet die Möglichkeit, Interaktionen zwischen DNA-Sequenzen und Proteinen zu untersuchen. Die Analyse der DNA-Protein-Interaktion wird ähnlich wie bei dem analogen TWO-HYBRID-SYSTEM (Protein-Protein-Interaktion, Fields und Song 1989) mit Hilfe eines Reportergens in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt. Das Verfahren wurde von Wang und Reed (1993) entwickelt und erstmals erfolgreich bei der Klonierung eines olfaktorischen Transkriptionsfaktors eingesetzt.

Sowohl die analysierte DNA-Sequenz als auch die präsumptiven DNA-bindenden Proteine des untersuchten Organismus werden in einen Hefestamm eingebracht (gehe Fig. 1). Das DNA-bindende Protein wird als Fusionsprotein mit der transkriptionsaktivierenden Domäne des GAL4-Proteins der Hefe exprimiert. Eine Interaktion des DNA-bindenden Polypeptids mit der analysierten DNA-Sequenz, welche stromaufwärts eines Reportergens integriert wird, ermöglicht die Transkriptionsinitiation des Reportergens durch die fusionierte GAL4-Domäne. Diese transkriptionsaktivierende Proteindomäne gelangt bei der beschriebenen DNA-Protein-Interaktion in räumliche Nähe des Transkriptionsstartpunktes. Als Reportergene werden das HIS3-Gen (in dem Vektor pHISi) und das lacZ-Gen (in dem Vektor pLACZi) eingesetzt. Das HIS3-Gen ermöglicht die direkte Selektion auf solche Hefezellen, bei denen die beschriebene DNA-Protein-Interaktion stattfindet. Das lacZ-Gen erlaubt die Quantifizierung der Reportergenaktivität und damit die Messung der Bindungsaffinität zwischen Protein und analysierter DNA-Sequenz. Neben dem Nachweis der DNA-Protein-Interaktion zwischen zwei bekannten Komponenten kann das ONE-HYBRID-SYSTEM auch zur Isolation bislang unbekannter trans-wirkender Faktoren einer DNA-Sequenz eingesetzt werden. Hierbei wird mit einer Expressionsgenbank (cDNA-Bank) des untersuchten Organismus gearbeitet. Die cDNA-Bank wird in dem Hefe-Expressionsvektor pGAD424 angelegt, so daß die klonierten cDNAs zusammen mit der GAL4-Domäne in der Hefe exprimiert werden können. Durch die Selektion auf die Expression von Reportergenen können solche cDNAs identifiziert werden, deren Proteinprodukte in diesem in vivo-System eine funktionelle DNA-Bindeaktivität besitzen.

Aus dem 1,2 kb umfassenden Promotor wurde eine DNA-Sequenz von 24 Nukleotiden (Position -447 bis -423) ausgewählt und als Zielelement im ONE-HYBRID-SYSTEM zur Isolation eines spezifischen Transkriptionsfaktors eingesetzt (Fig. 2). Die Sequenz enthält eine sogenannte CCAAT-Box, die in den Promotoren und Enhancer-Regionen vieler eukaryontischer Gene gefunden wurde (z. B. Nussinov R 1992). Es existieren mehrere unterschiedliche Transkriptionsfaktoren, die an dieses Motiv binden (z. B. Raymondjean et al. 1988). Z.B. wurde das Am Alpha Binding-Protein (AAB) von Neurospora crassa aufgrund seiner Affinität zu einem CCAAT-enthaltendem Promotorfragment kloniert. Durch Mutagenese des CCAAT-Motivs konnte die Spezifität des AAB-Transkriptionsfaktors für diese Sequenz gezeigt werden (Chen und Kinsey 1995). Bei Aspergillus nidulans konnte eine DNA-Protein-Interaktion im Bereich einer solchen CCAAT-Box nachgewiesen werden (Then Bergh et al. 1996).

Die Synthese des Antibiotikums in A. chrysogenum unterliegt einer Reihe von Faktoren (Kohlenstoffquellen, pH-Wert und Sauerstoffgehalt des Mediums, usw.), deren Umsetzung auf die molekulare Regulation der Genexpression unbekannt ist (Übersicht bei Nosek et al. 1997). Transkriptionsfaktoren mit spezifischen Affinitäten für DNA-Sequenzen des regulatorischen Bereichs der pcbAB/pcbC-Gene sind Mittel der molekularen Regulation. Bei Kenntnis und Verfügbarkeit solcher Transkriptionsfaktoren und der entsprechenden Gene erschließen sich neue Möglichkeiten, die Regulation der Cephalosporin C-Biosynthese zu untersuchen und die gewonnenen Erkenntnisse auf die Antibiotika-Produktion zu übertragen.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist demgemäß das Auffinden von Genen für Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation der Biosynthesegene von Cephalosporin C beteiligt sind, um letztlich eine Ausbeutesteigerung an Cephalosporin C in entsprechenden Fermentationsprozessen zu erreichen.

Überraschenderweise wurde bei der Lösung dieser Aufgabe mittels des Hefe ONE-HYBRIDSYSTEMS das Gen eines DNA-bindenden Proteins (cpcR1-Gen) entdeckt, dessen Gen-Produkt (CPCR1) im intergenischen Bereich der pcbAB und pcbC-Gene von A. chrysogenum bindet und der Familie der RFX-proteine (Emery et al., 1996) zuzurechnen ist. Dies ist um so überraschender, als daß man aufgrund des Vorliegens einer CCAAT-Box im zum Screening benutzten DNA-Fragment eigentlich ein Protein aus einer Protein-Familie erwartet hätte, welche aus Mitgliedern besteht, die spezifisch an das Sequenzmotiv "CCAAT-Box" binden. Eine mögliche Erklärung für diesen überraschenden Befund ist die Struktur der erfindungsgemäßen DNA Bindestelle: GTTGCCGGGCCAATCCCTGAGCTT (SEQ ID No.: 4). Die Sequenz enthält ein palindromisches Sequenzmotiv, welches wohl die Bindungsstelle für das CPCR1-Protein darstellt; die CCAAT-Box überlappt lediglich teilweise mit dieser Sequenz.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-bindendes Protein, welches als Monomer, Homodimer oder Teil eines Heterodimer an doppelsträngige DNA der Sequenz GTTGCCGGGCCAATCCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 4) aus dem intergenischen Bereich des pcbAB und pcbC-Gens von Acremonium chrysogenum bindet und in der Lage ist, die Transkription des pcbAB und/oder pcbC-Gens zu beeinflussen, insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz des CPCR1-Proteins gemäß Tabelle 7 (SEQ ID NO.: 20) oder Teile davon enthält.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Fusionsprotein, enthaltend die Aminosäuresequenz des CPCR1-Proteins gemäß Tabelle 7 (SEQ ID NO.: 21) oder Teile davon und eine Transaktivierungsdomäne, welche in der Lage ist, die Transkription des pcbAB und/oder pcbC-Gens zu beeinflussen.

Insbesondere ist das Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Teile des CPCR1 Proteins der DNA-Bindungsdomäne (Aminosäuren 180 bis 254 gemäß Tabelle 7) und der Dimerisierungsdomäne (Aminosäuren 502 bis 660 gemäß Tabelle 7) entsprechen und/oder die Transaktivierungsdomäne vom Transkriptionsfaktor GAL4 (Aminosäuren 768 bis 881) stammt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-Molekül, kodierend für ein Protein wie vorgehend beschrieben. Dieses DNA-Molekül ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß

• (a) es eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 6 (SEQ ID NO.: 20) oder Teile davon enthält;
• (b) es eine DNA-Sequenz enthält, die in der Lage ist, mit dem DNA-Molekül gemäß (a) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, oder Teile davon;
• (c) es eine DNA-Sequenz enthält, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den DNA-Molekülen gemäß (a) und (b) verschieden ist, jedoch die Expression der entsprechend mit den DNA-Molekülen gemäß (a) und (b) exprimierbaren Proteinen ermöglicht, oder Teile davon.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, enthaltend eine DNA wie vorhergehend beschrieben. Insbesondere ist dieser Vektor dadurch gekennzeichnet, daß es ein Vektor geeignet zur Expression in Acremonium chrysogenum oder Saccharomyces cerevisiae ist.

Bevorzugt ausgewählt wird der Vektor aus der Gruppe enthaltend die Vektoren pGC1 und pGC1ΔDIM1.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, enthaltend eine oder mehrere Kopien eines Vektors oder einer DNA wie vorhergehend beschrieben, insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Acremonium chrysogenum und Saccharomyces cerevisiae.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-bindenden Proteins wie vorhergehend beschrieben, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA wie vorhergehend beschrieben mittels eines Vektors wie vorhergehend beschrieben in einer Wirtszelle wie vorhergehend beschrieben exprimiert und isoliert wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der Cephalosporin C-Ausbeute in Acremonium chrysogenum, bei dem die Expression des cpcR1-Genprodukts variiert wird, insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß die variierte Expression durch Einbringen einer oder mehrerer Kopien des cpcR1-Gens in den Wirtsorganismus zusätzlich zum endogenen cpcR1-Gen, erreicht wird oder auch dadurch gekennzeichnet, daß die variierte Expression durch Integration einer oder mehrerer zusätzlicher DNA-Bindesequenzen UGCCGGGCCAAT (SEQ ID NO.: 1) oder Varianten gleicher Funktion des DNA-bindenden Proteins wie vorhergehend beschrieben, im pcbAB/pcbC-Promotors erreicht wird.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung eine DNA-Bindungsstelle für ein DNA-bindendes Protein wie vorhergehend beschrieben, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend die doppelsträngigen Sequenzen GTTGCCGGGCCAATCCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 3), TTGCCGGGCCAAT (SEQ ID NO.: 1) und GTTGCCGGGCGTATCCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 8).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor wie vorhergehend beschrieben, enthaltend eine oder mehrere Kopien der DNA-Bindesequenzen des erfindungsgemäßen DNA-bindenden Proteins wie vorhergehend beschrieben.

Die Erfindung wird nun anhand der Beispiele, Figuren und Tabellen beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1 Isolation der cpcR1-cDNA von Acremonium chrysogenum mit Hilfe des ONE-HYBRID-SYSTEMS

Die im vorausgegangenen beschriebene DNA-Sequenz aus dem pcbAB/pcbC-Pro­ motorbereich wurde eingesetzt um mittels des ONE-HYBRID-SYSTEMS cDNA-Klone von A. chrysogenum zu isolieren, die für DNA-Bindeproteine kodieren. Es wurde grundsätzlich so vorgegangen, wie im "Matchmaker One Hybrid System protocol" von Clontech beschrieben. Es wurde ein Oligonukleotid mit einer Länge von 80 Nukleotiden (nt) synthetisiert, welches die DNA-Sequenz (Position -447 bis -423 im pcbAB/pcbC-Promotor) in dreifacher Kopie enthält (Tabelle 3). Am 5'-Ende wurden die Nukleotide AATTC zugefügt, um einen EcoRI-Überhang zu erzeugen. Am 3'-Ende besitzt das Oligonukleotid die Nukleotide CCC, die zur Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Smal gehören. Zudem wurde ein Oligonukleotid von 76 nt synthetisiert, dessen Sequenz komplementär zum ersten Oligonukleotid ist. Das 3'-Ende dieses Oligonukleotids schließt mit einem G, so daß bei der Hybridisierung der beiden Oligonukleotide ein doppelsträngiges DNA-Molekül entsteht, dessen 5'-Ende durch einen EcoRI-Überhang charakterisiert ist. Dieses doppelsträngige DNA-Molekül (BSII) wurde in die Reportergenplasmide pHISi und pLACZi (Clontech) integriert. Die Plasmide wurden zuvor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Smal geschnitten. Die erhaltenen Plasmide pHISi-BSII und pLACZi-BSII (siehe Tabelle 4) wurden mittels DNA-Transformation in das Genom des Rezipientenstammes integriert.

Der resultierende Hefestamm (siehe Tabelle 5) wurde zur Transformationen einer cDNA-Bank von A. chrysogenum eingesetzt. Als Ausgangsmaterial für die cDNA-Syn­ these diente mRNA des A. chrysogenum-Stammes A312 (Radzio und Kück, 1997; DSM 11878) und für die Konstruktion der cDNA-Bank wurde der Hefevektor pGAD424 (Clontech) verwendet.

Es wurden zwei identische Klone identifiziert, die auch in wiederholten in vivo-Ex­ perimenten zu einer nachweisbaren DNA-Protein-Interaktion mit dem Zielelement führten. Die DNA-Sequenz der isolierten cDNA von A. chrysogenum ist in Tabelle 6 dargestellt. Der isolierte Klon umfaßt ein cDNA-Fragment von 2541 bp und zusätzlich ein PolyA-Ende von ca. 80 Nukleotiden.

Beispiel 2 Homologie des CPCR1-Proteins zu Transkriptionsfaktoren der RFX-Familie

Die DNA-Sequenz der beschriebenen aus A. chrysogenum isolierten cDNA enthält einen offenen Leserahmen für 786 Aminosäuren (Tabelle 7). Ein Computervergleich der Proteinsequenz des cpcR1-Gens mit der EMBL-Datenbank ergab Homologien von 28 bis 22 Prozent zu verschiedenen Mitgliedern der Familie der RFX-Proteine.

Die höchste Homologie besteht mit 28% zum SAK1-Protein von Schizosaccharomyces pombe. Das humane RFX1-Protein ist von allen Mitgliedern der Familie am besten charakterisiert und besitzt zum CPCR1-Protein eine Homologie von 23,9% über einen Bereich von 476 Aminosäuren. Die Homologien innerhalb der konservierten Proteindomänen liegen deutlich höher (Abb. 3 und Tabellen 8 und 9). Die Transkriptionsfaktoren der RFX-Familie sind durch eine Reihe von konservierten Proteindomänen gekennzeichnet (Übersicht bei Emery et al. 1996). Die Proteine besitzen eine 76 Aminosäuren umfassende sogenannte RFX-DNA-Bindedomäne, deren Konsensus-Sequenz keine Homologie zu anderen bekannten DNA-Bindedomänen aufweist. Daneben enthalten die meisten Mitglieder der Proteinfamilie eine putative Dimerisationsdomäne, die weniger stark konserviert ist. Durch Homologievergleiche der RFX-Proteine konnten weitere konservierte Proteinregionen (A, B und C) lokalisiert werden, deren Funktion unbekannt ist. Außerdem enthalten einige Mitglieder der Familie Bereiche, in denen bestimmte Aminosäuren besonders häufig vorkommen. Das CPCR1-Protein besitzt die konservierten Regionen B und C, sowie im N-terminalen Bereich eine Prolin- und Glutamin-reiche und im C-terminalen Teil eine Asparaginsäure- und Glutaminsäure­ reiche Region (Abb. 3).

Die Deletion der C-terminalen 1,3 kb des CPCR1-Proteins in dem Vektor pGC1 führt zu dem Plasmid pGC1ΔDIM1. Bei dieser Deletionsmutante sind die Nukleotide 1213 bis 2372 gemäß Tabelle 6 deletiert. Dies bedeutet, daß das mit dem Plasmid pGC1ΔDIM1 exprimierbare Protein die Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 402 gemäß Tabelle 6 hat.

Hefezellen des Stammes BSII (siehe Tabelle 2) mit dem Plasmid pGC1ΔDIM1 sind im Gegensatz zu solchen mit dem Ausgansplasmid pGC1 nicht mehr in der Lage auf HIS-Selektionsplatten mit 55 mM 3-Aminotriazol zu wachsen. Dies deutet darauf hin, daß die DNA-Bindeaktivität des CPCR1-Proteins von der Dimerisationsdomäne abhängt. Möglicherweise bindet der Transkriptionsfaktor in diesem in vivo-Ex­ periment nur als Homodimer an die DNA-Zielsequenz und führt somit zur Expression des HIS3-Reportergens.

Beispiel 3 In vivo-Analysen zur Spezifität der DNA-Protein-Interaktion des CPCR1-Proteins

Transkriptionsfaktoren sind DNA-Bindeproteine, die in den meisten Fällen durch eine spezifische Interaktion mit DNA-Sequenzen eines Promotors an der transkriptionellen Regulation der Genexpression beteiligt sind. Zur exakten Bestimmung der Nukleotide, die für die spezifische Interaktion des CPCR1-Proteins mit Bereichen des pcbAB/pcbC-Promotors notwendig sind, wurden Mutationen in die präsumptive Bindestelle eingebracht. Es wurden hierzu Oligonukleotide synthetisiert (BSIIm 1-3), deren Sequenz jeweils an einer Stelle über einen Bereich von 2 bis 5 Nukleotiden von der Ausgangssequenz (BSII) abweicht. In der Tabelle 2 sind die Sequenzen der mutierten Oligonukleotide angegeben. Die dargestellen Sequenzen wurden in dreifacher Kopie synthetisiert und wie in Beispiel 1 beschrieben in das Hefegenom integriert. Die Reportergenaktivität des lacZ-Gens bei Expression des CPCR1-Proteins in den resultierenden Hefestämmen ist in der Tabelle 2 angegeben. Die Substitution der Nukleotide CCAAT zu GGTTA in dem Oligonukleotid BSIIm1 führt zu einem Verlust der lacZ-Aktivität des entsprechenden Hefestammes. Die Nukleotide CAA bilden möglicherweise die rechte Hälfte einer palindromischen Erkennungssequenz für den Faktor CPCR1. Bei einer Substitution der entsprechenden Nukleotide (TTG zu AAC) in der putativen linken Hälfte des Palindroms ist ebenfalls ein Verlust der lacZ-Aktivität festzustellen (siehe BSIIm3).

Diese Ergebnisse sprechen dafür, daß die Erkennungssequenz des Transkriptionsfaktors CPCR1 eine palindromische Struktur aufweist. Eine Substitution der Nukleotide GT in dem Oligonukleotid BSIIm2 zerstört das Palindrom nicht vollständig und bewirkt auch keinen Verlust der lacZ-Aktivität.

Beispiel 4 Nachweis des cpcR1-Gens in Acremonium chrysogenum durch DNA-Hy­ bridisierungen

10 In der Fig. 4 ist eine Southern-Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit genomischer DNA des Acremonium chrysogenum Stammes A312 dargestellt. Die DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI bzw. HindIII geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Als Sonde diente ein 2,4 kb-Fragment der cpcR1-cDNA, welches mit ³²Phosphor radioaktiv markiert wurde. Bei dem 2,4 kb großen Hybridisierungsfragment handelt es sich um ein Pstl-Fragment, welches innerhalb des rekombinanten Plasmids pGC1 folgende Position einnimmt: das Fragment erstreckt sich von der Pstl Erkennungsstelle an der Nukleotidposition 129 innerhalb des offenen Leserahmens des cpcRI-Gens bis zur Pstl-Erkennungsstelle innerhalb der multiplen Klonierungsstelle des rekombinanten Plasmids. Die multiple Klonierungsstelle stammt von dem Ausgangsvektor pGAD424. Somit sind in dem Hybridisierungsfragment alle Genbereiche enthalten, mit Ausnahme der ersten 129 Nukleotide. Da in der genomischen DNA jeweils nur 1 Fragment markiert wird (7 bis ca. 15 kb), liegt das cpcR1-Gen wahrscheinlich in Einzelkopie im Genom von A. chrysogenum vor.

Hybridisierungspuffer: 50% Formamid; 5 × SSPE; 0,2% SDS; 100 µg/ml Heringssperma-DNA; Hybridisierungsbedingungen: 1 h Vorhybridisierung bei 37°C; 12 h Hybridisierung mit radioaktiv (³²P)-markierter Sonde; Waschpuffer: 5 × SSPE, 0,2% SDS; Waschbedingungen: 10 min bei 60°C.

Beispiel 5 Nachweis des cpcR1-Gentranskripts in Acremonium chrysogenum durch RNA-Hy­ bridisierungen

Die Expression des cpcR1-Gens in 3 verschiedenen Acremonium chrysogenum Stämmen wurde mittels einer Northern-Hybridisierung untersucht (Fig. 5). Das als Sonde eingesetzte radioaktiv-markierte Fragment des cpcR1-Gens (s. o.) markiert in der Gesamt-RNA von A. chrysogenum ein RNA-Molekül von etwa 3,5 kb. Die Unterschiede in der Intensität der Hybridisierung zwischen den 3 Pilzstämmen (A. c. ATCC 14553, A3/2 und Ac1) deuten auf eine unterschiedlich starke Expression des cpcR1-Gens hin. Eine höhere Expression des Transkriptionsfaktors CPCR1 in den beiden Semi-Produzentenstämmen A3/2 und Ac1 korreliert mit der erhöhten Cephalosporin-Syntheseleistung dieser Stämme. Dieses Ergebnis weist auf die mögliche regulatorische Wirkung des CPCRI-Proteins für die Cephalosporin C-Biosynthese hin. Hybridisierungspuffer: 50% Formamid; 5 × SSPE; 0,2% SDS; 200 µg/ml Heringssperma-DNA; Hybridisierungsbedingungen: 2 h Vorhybridisierung bei 37°C; 12 h Hybridisierung mit radioaktiv (³²P)-markierter Sonde; Waschpuffer: 5 × SSPE, 0,2% SDS; Waschbedingungen: 10 min bei 60°C.

Beispiel 6 Konstruktion von Expressionsvektoren für Acremonium chrysogenum

Im folgenden werden die Expressionsvektoren plR11, plR12, plRl3, plR21, plR22, plR23, plR31, plR32 und plR33 beschrieben. Die Konstruktion der Vektoren wurde nach Standardmethoden der molekularen Genetik vorgenommen (Sambrook et al. 1989). Die Nukleotidsequenz der Vektoren ist aus Tabelle 10 abzuleiten.

Allgemeine Beschreibung der Vektoren:

• 1. Alle Vektoren basieren auf dem bakteriellen Plasmid PCRScript+AmpSK(+) (Stratagene, Heidelberg) und erhalten für die Vermehrung in E. coll einen Replikationsursprung, welcher in E. collwirksam ist. Außerdem tragen sie ein Ampicillin-Resistenzgen, welches für eine β-Lactamase kodiert. Die Selektion in E. coll wird durch das Resistenzgen ermöglicht. In Tabelle 10 wird der PCRScript+AmpSK(+)-Anteil als "bakterieller Anteil" bezeichnet.
• 2. Alle Vektoren enthalten den Promotorbereich des pcbC-Gens (Samson et al. 1985, Menne et al. 1994).
• 3. Alle Vektoren enthalten die Transkriptions-Terminationssignale des pcbC-Gens (Samson et al. 1985)
• 4. Die Vektoren enthalten variable Klonierungsinsertionsschnittstellen, die durch die Linker der Tabelle 11 bestimmt werden.
  Die drei unterschiedlichen Klonierungsinsertionsstellen unterscheiden sich lediglich durch einzelne Nukleotide (unterstrichen in der Tabelle 11). Dadurch ist eine Translationsfusion von zwei Gensequenzen in den drei möglichen Leserahmen eines Protein-kodierenden Gens möglich.
• 5. Die Vektoren plR21, plR22, plR23 und plR31, plR32, plR33 enthalten Sekretions-Signalsequenzen für Translationsfusionen.
  Um eine effiziente Expression und eine möglichst einfache Reinigung des heterologen Genprodukts zu ermöglichen, wurden unmittelbar vor der Klonierungsinsertionsstelle sogenannte Sekretions-Signalsequenzen eingefügt, die einen Transport des exprimierten Proteins in das endoplasmatische Reticulum und schließlich eine Sekretion aus den Zellen bewirken. Das Genprodukt sollte somit in den Kulturüberständen der entsprechenden Pilztransformanten vorliegen. Es wurden zwei verschiedene Export-Signalsequenzen verwendet:
• a) Zum einen handelt es sich um eine Sequenz mit einer Länge von 42 bp, die Teil eines Gens ist, das für eine alkalische Protease aus dem Pilz Fusarium sp. kodiert. Das kodierte Signalpeptid hat eine Länge von 14 Aminosäuren und wurde bereits in Saccharomyces cerevisiae und in A. chrysogenum auf seine Funktionalität getestet, jedoch nicht in Verbindung mit einem heterologen Gen (Kitano et al. 1992). Die Signalsequenz ist in den Vektoren plR21, plR22 und plR23 enthalten.
• b) Die zweite verwendete Signalsequenz stammt aus A. chrysogenum und ist ebenfalls Teil eines Gens, das für eine alkalische Protease kodiert. Diese Sequenz hat eine Länge von 60 bp, wobei das resultierende Signalpeptid, dessen Funktionalität gleichfalls in S. cerevisiae und A. chrysogenum verifiziert wurde, eine Länge von 20 Aminosäuren hat (Isogai et al. 1991). Die Signalsequenz aus A. chrysogenum ist in den Vektoren plR31, plR32, plR33 enthalten.

Zusammenfasend werden die Übergangssequenzen der neun Expressionsvektoren in der Tabelle 12 angegeben.

Beispiel 7 Expression des CPCR1 Proteins in A. chrysogenum

Die im Beispiel 6 beschreibenen Vektoren können benutzt werden, um das CPCR1 Protein in A. chrysogenum zu exprimieren.

Zu diesem Zweck kann das cpcR1-Gen aus dem Plasmid pGC1 durch PCR-Am­ plifikation (Sambrook et al. 1989) synthetisiert werden. Bei dieser Amplifikation werden die folgenden zwei Primer eingesetzt (in Klammern sind die Positionen der Oligonukleotide innerhalb der Nukleotidsequenz gemäß Tabelle 6 genannt).

• 1. 5'CCT GCT ATG TAC GGA CAA GGG3' (10-30) (SEQ ID NO.: 54)
• 2. 5'CC TCG TCA TGC AGG AGC CGC CC3' (2351-2372) (SEQ ID NO.: 55)

Durch die Amplifikation erhält man ein 2362 bp großes DNA-Fragment, das durch DNA-Sequenzierung auf seine Korrektheit hin überprüft wird. Dieses Fragment wird in die Nrul-Restriktionsstelle des Plasmids plR11 kloniert. Durch das Enzym Nrul wird ein sogenanntes "stumpfes Ende" hergestellt, mit dem die Klonierung des PCR-Fragments ohne vorausgegangene Restriktrion möglich wird. Durch die Ligation des Vektors und des PCR-Fragments entsteht ein rekombinantes Plasmid mit der Bezeichnung plRS11, das anschließend in E. coll kloniert und vermehrt werden kann.

Durch anschließende DNA-Kotransformationsexperimente (Menne et al. 1994) wird das Plasmid in A. chryso gen um eingebracht. In der Regel erfolgt eine ektopische Integration des Plasmids in mehreren Kopien in das pilzliche Genom. Es können also pilzliche Transformanten mit mehreren Kopien des cpcR1-Gens unter der Kontrolle des pcbC-Promotors erhalten werden. Die anschließende molekulare Analyse der Pilztransformanten erlaubt die Selektion geeigneter Stämme. Diese sollten das CPCR¹-Protein übersynthetisieren und somit eine erhöhte Expression der Cephalosporin C-Biosynthesegene aufgrund der CPCR¹-Wirkung zur Folge haben.

Figurlegenden

Fig. 1 Schema des ONE-HYBRID-SYSTEMS. Ein Hefe-Reportergenstamm wird mit einer Expressionsgenbank von A. chrysogenum transformiert. Bei einer DNA-Pro­ tein-Interaktion zwischen dem heterologen Anteil des Fusionsproteins und dem analysierten DNA-Element (E) kommt es zur Expression des Reportergens (HIS3). Dieses Prinzip der Selektion auf Histidin-Auxotrophie erlaubt die direkte Identifizierung von Transformanden, deren Expressionsplasmid für einen möglichen trans-Faktor kodiert. Abkürzungen: AD: transkriptionsaktivierende GAL4-Domäne, BP: DNA-Bindeprotein, E: analysiertes DNA-Element, HIS3: Histidin-Bio­ synthesegen, P: Promotor

Fig. 2 Schematische Darstellung des intergenischen Promotorbereiches der pcbAB/pcbC-Gene von Acremonium chrysogenum. Der Promotorbereich ist schraffiert, die Translationsstartpunkte der beiden divergenten Gene sind durch Pfeile markiert. Dargestellt ist die Sequenz (Position -447 bis -423) des Promotors, welche in dem ONE-HYBRID-SYSTEM zur Selektion spezischer Transkriptionsfaktoren eingesetzt wurde.

Fig. 3 Schematische Darstellung des CPCR1-Proteins. Die DNA-Bindedomäne (DBD) und die Dimerisationsdomäne (DIM) sind durch einen fettgedruckten Rahmen gekennzeichnet. Außerdem sind die innerhalb der RFX-Familie konservierten Regionen B und C eingezeichnet. Proteinregionen, die einen erhöhten Anteil bestimmter Aminosäuren enthalten sind mit PQ (Prolin und Glutamin) bzw. mit DE (Asparaginsäure und Glutaminsäure) markiert.

Fig. 4 Southern-Hybridisierung von Gesamt-DNA des A. chrysogenum-Stammes Ac1. Die Gesamt-DNA wurde mit Restriktionsenzymen wie angegeben geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Als Sonde wurde ein radioaktiv-markiertes Pstl-Fragment des cpcR1-Gens mit einer Größe von 2,4 kb eingesetzt. Als Positivkontrolle für die Hybridisierung diente das Plasmid pGC1, welches die cpcR1-cDNA enthält.

Fig. 5 Northern-Hybridisierung mit Gesamt-RNA der A. chrysogenum-Stämme ATCC 14553 (Spur1), A312 (Spur2) und Ac1 (Spur3). Als Sonde wurde ein radioaktiv-markiertes Pstl-Fragment des cpcR1-Gens mit einer Größe von 2,4 kb eingesetzt.

Literatur

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Tabellen

Tab. 1. Exemplarische Auswahl von Transkriptionsfaktoren bei Hyphenpilzen

Abkürzungen: bZIP: basic Leucin-Zipper, bHLH: basic Helix-Loop-Helix,
Transfaktor: transaktivierender Faktor

Tab. 2. Monomere Teilsequenzen von Oligonukleotiden, die im ONE-HYBRID-SYS­ TEM eingesetzt wurden. Die Sequenz BSII entspricht dem Bereich von -447 bis -423 des pcbAB/pcbC-Promotors von A. chrysogenum. Die mutierten Oligonukleotide BSIIm1-3 wurden zur Bestimmung der Bindesequenz des CPCR1-Pro­ teins eingesetzt. Die von der Ausgangssequenz abweichenden Nukleotide sind in Fettdruck angegeben. Neben den Ergebnissen der Reportergenanalysen ist auch die Konsensus-Sequenz der Bindestellen des humanen RFX1-Proteins angegeben.

Unterstrichen sind solche Nukleotide innerhalb der Sequenzen, die an der Bildung eines Palindroms beteiligt sein könnten.

Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Hefeplasmide. Der Teil A der Tabelle enthält Hefeplasmide mit Integrationen der in Tabelle 3 aufgeführten Oligonukleotide. Es handelt sich um integrative Hefeplasmide. Der Teil B der Tabelle enthält Hefe-Ex­ pressionsplasmide, welche in die erzeugten Hefestämmen transformiert wurden und dort als autonom replizierende Plasmide vorliegen.

Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Hefestämme. Die transgenen Hefestämme wurden durch die Transformation mit integrativen und/oder frei replizierenden Hefeplasmiden (siehe Tabelle 4) erzeugt.

Tab. 6: DNA-Sequenz des isolierten cDNA-Klons (cpcR1) von Acremonium chrysogenum. Die angegebene Sequenz umfaßt 2546 bp (SEQ ID NO.: 20) und ist als einzelsträngiges, linearen DNA-Molekül in 5'-3'-Richtung dargestellt.

Tab. 7: Aminosäuresequenz, abgeleitet vom ORF 786 aus dem cDNA-Klon (cpcR1) von Acremonium chrysogenum. Der offenen Leserahmen kodiert für 786 Aminosäuren (SEQ ID NO.: 21)

Tab. 11: Die charakteristischen Klonierungsstellen der neun Vektoren und die davon abgeleiteten Restriktionsschnittstellen, welche für Klonierungen geeignet sind. Zu beachten ist, daß sich die drei Klonierungsstellen nur durch ein bzw. zwei Basenpaare unterscheiden.

1. Leseraster (Oligonukleotide Nr. 1+2)

2. Leseraster (Oligonukleotide Nr. 3 + 4)

3. Leseraster (Oligonukleotide Nr. 5 + 6)

Tab. 12: Übergangssequenzen im Bereich der multiplen Klonierungsstelle (eingerahmt) in den angegebenen Expressionsvektoren. In den Sequenzen wurden solche Nukleotide unterstrichen, die gegenüber dem erstgenannten Plasmid verschieden sind.

A. Vektoren ohne Signalsequenz

pIR11

1. Leseraster

pIR12

2. Leseraster

pIR13

3. Leseraster

B. Vektoren mit Signalsequenz aus Fusarium

pIR21

1. Leseraster

pIR22

2. Leseraster

pIR23

3. Leseraster

C. Vektoren mit Signalsequenz aus Acremonium chrysogenum

pIR31

1. Leseraster

pIR32

2. Leseraster

pIR33

3. Leseraster

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. DNA-bindendes Protein, welches als Monomer, Homodimer oder Teil eines Heterodimer an doppelsträngige DNA der Sequenz GTTGCCGGGCCAAT CCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 4) aus dem intergenischen Bereich des pcbAB und pcbC-Gens von Acremonium chrysogenum bindet und in der Lage ist, die Transkription des pcbAB und/oder pcbC-Gens zu beeinflussen.

2. DNA-bindendes Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz des CPCR1-Proteins gemäß Tab. 7 (SEQ ID NO.: 21) oder Teile davon enthält.

3. Fusionsprotein, enthaltend die Aminosäuresequenz des CPCR1-Proteins gemäß Tab. 7 (SEQ ID NO.: 21) oder Teile davon und eine Transaktivierungs­ domäne, welches in der Lage ist, die Transkription des pcbAB und/oder pcbC-Gens zu beeinflussen.

4. Fusionsprotein gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Teile des CPCR1 Proteins der DNA-Bindungsdomäne (Aminosäuren 180 bis 254 gemäß Tab. 7) und/oder der Dimerisierungsdomäne (Aminosäuren 502 bis 660 gemäß Tabelle 7) entsprechen und die Transaktivierungsdomäne vom Transkriptionsfaktor GAL4 (Aminosäuren 768 bis 881) stammt.

5. DNA-Molekül, kodierend für ein Protein gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4.

6. DNA-Molekül gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß

• (a) es eine DNA-Sequenz gemäß Tabelle 6 (SEQ ID NO.: 20) oder Teile davon enthält
• (b) es eine DNA-Sequenz enthält, die in der Lage ist, mit dem DNA-Molekül gemäß (a) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, oder Teile davon;
• (c) es eine DNA-Sequenz enthält, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den DNA-Molekülen gemäß (a) und (b) verschieden ist, jedoch die Expression der entsprechend mit den DNA-Molekülen gemäß (a) und (b) exprimierbaren Proteinen ermöglicht, oder Teile davon.

7. Vektor, enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 5 oder 6.

8. Vektor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Vektor geeignet zur Expression in Acremonium chrysogenum oder Saccharomyces cerevisiae ist.

9. Vektor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend die Vektoren pGC1 und pGC1ΔDIM1.

10. Wirtszelle, enthaltend eine oder mehrere Kopien eines Vektors gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9 oder eine DNA gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.

11. Wirtszelle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Acremonium chrysogenum und Saccharomyces cerevisiae.

12. Verfahren zur Herstellung eines DNA-bindenden Proteins gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 mittels eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 in einer Wirtszelle gemäß Anspruch 10 oder 11 exprimiert und isoliert wird.

13. Verfahren zur Steigerung der Cephalosporin C-Ausbeute in Acremonium chrysogenum, bei dem die Expression des cpcR1-Genprodukts mit gentechnischen Mitteln variiert wird und das Cephalosporin C isoliert wird.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die variierte Expression durch Einbringen einer oder mehrerer Kopien des cpcR1-Gens in den Wirtsorganismus zusätzlich zum endogenen cpcR1-Gen erreicht wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die variierte Expression durch Integration einer oder mehrerer zusätzlicher DNA-Bin­ desequenzen TTGCCGGGCCAAT (SEQ ID NO.: 1) des DNA-bindenden Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 im pcbAB/pcbC-Promotor erreicht wird.

16. DNA-Bindungsstelle für ein DNA-bindendes Protein gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend die doppelsträngigen Sequenzen GTTGCCGGGCCAATCCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 4), TTGCCGGGCCAAT (SEQ ID NO.: 1) und GTTGCCGGGCGTATCCCTGAGCTT (SEQ ID NO.: 8).

17. Vektor gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, enthaltend eine oder mehrere Kopien der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 16.