DE69734669T2

DE69734669T2 - Enzymatische cofaktor-regeneration unter verwendung von pyridin-nucleotid transhydrogenase

Info

Publication number: DE69734669T2
Application number: DE69734669T
Authority: DE
Inventors: Neil Charles Bruce; Christopher French
Original assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Current assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Priority date: 1996-10-29
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2017-10-30
Also published as: ES2251735T3; DE69734669D1; AU4788897A; WO1998018909A1; ATE310079T1; CA2269640A1; EP0939799B1; GB9622516D0; JP2001502910A; EP0939799A1; CA2269640C; AU709463B2; US6440688B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines Enzyms zur Oxidation oder Reduktion von Pyridin-Nucleotid-Cofaktoren während Enzymreaktionen in vivo oder in vitro, zum Beispiel bei enzymatischen oder Ganzzellbiotransformationen oder enzymatischanalytischen Verfahren.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Durch Biotransformationsverfahren mit natürlichen oder genetisch veränderten Mikroorganismen oder isolierten Enzymen werden Verfahren zur Synthese vieler nützlicher Erzeugnisse bereitgestellt. Biotransformationen weisen gegenüber chemischsynthetischen Verfahren mehrere Vorteile auf, insbesondere Regiospezifizität und Stereospezifizität der enzymkatalysierten Reaktionen, Einsatz schonender Reaktionsbedingungen und dass keine giftigen Lösungsmittel verwendet werden müssen.
Um wirksam zu sein, sind bei Oxidoreduktasen häufig redoxaktive Cofaktoren erforderlich. Zu den häufigsten dieser Cofaktoren zählen die Pyridin-Nucleotid-Cofaktoren Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NAD: oxidierte Form NAD⁺, reduzierte Form NADH) und Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP: oxidierte Form NADP⁺, reduzierte Form NADPH). Diese Cofaktoren sind teuer und können, außer bei besonders wertvollen Erzeugnissen, nicht in stöchiometrischen Mengen bereitgestellt werden. Dies ist ein Umstand, durch den die Verwendung vieler Oxidoreduktasen für Biotransformationsreaktionen eingeschränkt ist.
Der Bedarf an Cofaktoren in einem Biotransformationsvorgang kann durch Bereitstellung eines Mittels zur Regeneration der gewünschten Form des Cofaktors verringert werden. Das bedeutet, dass der Cofaktor nur in katalytischen Mengen bereitgestellt werden muss. Wenn bei der interessierenden Reaktion beispielsweise NAD⁺ benötigt wird, das bei der Reaktion zu NADH reduziert wird, kann NADH durch ein weiteres Enzymsystem zu NAD⁺ rückoxidiert werden, beispielsweise durch die NAD⁺-abhängige Ameisensäuredehydrogenase in Gegenwart von Formiat. Dies wird als Cofaktor-Regeneration bezeichnet. Ameisensäuredehydrogenase ist für diesen Zweck besonders gut geeignet, da die Reaktion, die sie katalysiert, im Wesentlichen irreversibel ist.
Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass bei den meisten Enzymen, bei denen NAD benötigt wird, NADP nicht als Cofaktor verwendet werden kann und umgekehrt. Beispielsweise könnte Ameisensäuredehydrogenase nicht zur Regeneration von NADPH aus NADP⁺ verwendet werden.
Ein Sonderfall tritt ein, wenn bei einem Biotransformationsvorgang zwei Oxidoreduktasen benötigt werden, für die verschiedene Cofaktoren erforderlich sind. Beispielsweise erfordert ein kürzlich vorgeschlagener Biotransformationsvorgang zur Umwandlung von Morphin in das starke Schmerzmittel Hydromorphon die aufeinander folgende Wirkung der NADP⁺-abhängigen Morphindehydrogenase und der NADH-abhängigen Morphinonreduktase (French et al. (1995) Bio/Technology 13:674–676). In der ersten Reaktion wird Morphin unter Reduktion von NADP⁺ zu NADPH in Morphinon umgewandelt und in der zweiten Reaktion wird Morphinon unter Oxidation von NADH zu NAD⁺ in Hydromorphon umgewandelt. Deshalb müssen sowohl NADP⁺ als auch NADH bereitgestellt werden. Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass Morphindehydrogenase das Produkt Hydromorphon in Gegenwart von NADPH, das bei der ersten Reaktion entstanden ist, unter Rückoxidation von NADPH zu NADP⁺ zu dem unerwünschten Produkt Dihydromorphin reduziert. Diese Reaktionen sind in der zugehörigen 1A gezeigt.
Pyridin-Nucleotid-abhängige Enzyme können auch bei bestimmten enzymatischen Analyseverfahren eingesetzt werden, wobei die Menge des Analyten anhand des Oxidations- oder Reduktionsgrads des Cofaktors bestimmt wird. Oxidation und Reduktion von NAD und NADP können mit verschiedenen Verfahren gemessen werden; zum Beispiel mit der Spektralphotometrie und der Fluorometrie. Es kann jedoch sein, dass besonders empfindliche Verfahren zum Nachweis der Oxidation oder Reduktion nur für NAD oder NADP verfügbar sind, nicht jedoch für beide. Zum Beispiel kann die Oxidation von NADH zu NAD⁺ mit hoher Empfindlichkeit mit den Enzymen Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und Phosphoglyceratkinase (PGK) zur Phosphorylierung von Adenosindiphosphat (ADP) zu Adenosintriphosphat (ATP) in einer Reaktion nachgewiesen werden, die von der Gegenwart von NAD⁺ abhängt, und das entstehende ATP anschließend mit der ATP-abhängigen Leuchtreaktion der Firefly-Luziferase nachgewiesen werden. Dieses Verfahren kann nicht zum Nachweis der Oxidation von NADPH zu NADP⁺ eingesetzt werden, da das handelsübliche GAPDH spezifisch für NAD⁺ ist.
Mehrere der oben genannten Aufgaben können mithilfe eines Enzyms gelöst werden, das Reduktionsäquivalente zwischen NAD und NADP überträgt; das beispielsweise NAD⁺ zu NADH reduziert, während es NADPH zu NADP⁺ oxidiert. Ein solches Enzym ist als Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase (PNTH) bekannt. Mehrere Enzymarten zeigen diese Aktivität (Rydström et al. (1987) in „Pyridine nucleotide coenzymes: chemical, biochemical and medical aspects", part B, Hrsg. Dolphin et al., John Wiley and Sons, NY, S. 433–460). Das bekannteste ist die membrangebundene Protonenpumpe PNTH, die in den Membranen von Mitochondrien und bestimmter Bakterien wie Escherichia coli vorkommt. Da dieses Enzym membrangebunden ist, ist es im Allgemeinen für Biotransformationen und analytische Zwecke ungeeignet.
Beispielsweise EP-A-0 733 712 offenbart, dass Organismen, die PNTH exprimieren, als Biokatalysatoren verwendet werden können. Dieses exprimierte Enzym ist membrangebunden und benötigt eine Energiequelle.
In Arch. Biochem. Biophys. (1996) 176; 136–143 ist PNTH aus Pseudomonas aeruginosa vorgestellt worden. Dieses lösliche PNTH-Enzym, das nicht energieabhängig ist, wurde recht ausführlich beschrieben, jedoch ist sein Nutzen begrenzt.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Das Gen (als „sth" bezeichnet), das die lösliche Transhydrogenase („STH") von Pseudomonas fluorescens NCIMB 9815 verschlüsselt, wurde geklont und sequenziert, und das Enzym wurde in Escherichia coli überexprimiert. Dadurch ist die verhältnismä ßig einfache Herstellung großer Enzymmengen möglich. Das Enzym wurde gereinigt und charakterisiert. Dieses Enzym wird durch die Reaktion definiert, die es katalysiert, nämlich die Übertragung von Reduktionsäquivalenten zwischen NAD und NADP oder Analoga dieser Cofaktoren; die Nucleotidsequenz des Strukturgens sth, das das Enzym verschlüsselt, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Enzyms, das daraus abgeleitet wird; Struktureigenschaften des Enzyms einschließlich einer M_r der Untereinheit von etwa 50.000 und die Fähigkeit, große Polymere mit einer M_r von über 1.000.000 zu bilden.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt dieser Erfindung wird ein Mikroorganismus als Katalysator verwendet, wobei der Mikroorganismus so verändert ist, dass er ein Enzym exprimiert, das eine Sequenz mit mehr als 70% vollkommener Übereinstimmung mit SEQ Nr. 2 aufweist und Reduktionsäquivalente zwischen Pyridin-Nucleotid-Cofaktoren übertragen kann.
Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung ist ein Verfahren, bei dem ein Substrat mithilfe eines Enzyms und eines Pyridin-Nucleotid-Cofaktors in ein Produkt umgewandelt wird und das die Verwendung eines Enzyms oder Organismus umfasst, wie sie zuvor definiert ist.
Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung ist ein Nucleotidmolekül mit einer Sequenz mit über 70% vollkommener Übereinstimmung mit SEQ Nr. 1, das ein Enzym verschlüsselt, das die Wirksamkeit der löslichen Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase aufweist. Das Gen kann zur Herstellung des Enzyms oder einer veränderten Form des Enzyms mithilfe eines genetisch veränderten Organismus verwendet werden. Zum Beispiel kann ein genetisch veränderter Organismus, der das sth-Gen als heterologes Konstrukt oder Teil eines heterologen Konstrukts trägt, so gezüchtet werden, dass die Herstellung des Enzyms begünstigt wird, das dann aus dem Nährmedium oder aus Zellextrakten gewonnen werden kann. Verfahren, um dies zu erreichen, sind im Fachgebiet wohlbekannt.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung kann von dem Enzym eingesetzt werden, das die Sequenz aufweist, die in SEQ Nr. 2 gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die mehr als 70%, vorzugsweise mindestens 80% und günstiger mindestens 90% vollkommene Übereinstimmung damit aufweist. Das Enzym kann als solches verwendet werden oder als veränderter Mikroorganismus. Dem Durchschnittsfachmann sind geeignete Wirte für die Transformation bekannt. Ein Beispiel für einen geeigneten Wirt ist E. coli.
Ein Enzym oder Organismus der Erfindung kann bei der Biotransformation, zu analytischen Zwecken oder für jeden anderen geeigneten Zweck verwendet werden. Sie sind besonders nützlich in Verbindung mit einer Reaktion, bei der ein Enzym einen Pyridin-Nucleotid-Cofaktor einsetzt. Ein konkretes Beispiel ist in 1B gezeigt (das mit 1A verglichen werden soll). Die Verwendung von STH bedeutet, dass die Reduktion von Hydromorphon stark verringert wird, indem die Bildung von NADH verhindert wird. Dadurch besteht keine Notwendigkeit mehr, teure Cofaktoren bereitzustellen. Bei Biotransformationen kann STH Reduktionsäquivalente zwischen NADH und NAD⁺ hin- und hertransportieren, wodurch Zellen bei dem Verfahren mehr als einmal verwendet werden können. Auf der Grundlage der Oxidation von NADH zu NAD⁺ kann ein Signal gemessen werden. Das veränderte Signal kann anschließend mithilfe eines empfindlicheren Verfahrens erfasst werden, das vorher nicht angewendet werden konnte.
Das folgende Beispiel 1 veranschaulicht das Klonen und Sequenzieren von sth, während Beispiel 2 und 3 die erfindungsgemäße Verwendung von STH veranschaulicht. Die Beispiele sind mit Bezug auf 1 (zuvor beschrieben) und die weiteren zugehörigen Zeichnungen angeführt, von denen:
2 eine Restriktionskarte des 5,0 kb Eco RI-Fragments und des 0,5 kb SacII/XhoI-Subklons ist, der das sth-Gen trägt. Der dunkle Bereich zeigt den kodierenden Bereich an und die Pfeile zeigen Sequenzierungsreaktionen an.
3 zeigt die Umwandlung von Morphin zu Hydromorphon in Gegenwart der löslichen Transhydrogenase. Quadrate Morphin, Kreise Hydromorphon; Dreiecke Dihydromorphin.
4 zeigt die aufeinander folgenden Biotransformationen von Morphin mit Zellen von E. coli JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 und E. coli JM109/pMORB3-AmutMC80S (OC = Opiatkonzentration (mM), ☐ = Morphin, ⦁ = Hydromorphon und
= Dihydromorphin).
Beispiel 1
Thionicotinsäureamid-adenin-dinucleotid (tNAD+) und Adenosin-2',5'-diphosphatagarose wurden von Sigma (Poole, Dorset, UK) bezogen. Weitere Reagenzien waren analysenrein oder von höherer Qualität und wurden von Sigma oder Aldrich (Gillingham, Dorset, UK) bezogen.
Pseudomonas fluorescens NCIMB9815 wurde von der „National Collection of Industrial and Marine Bacteria" (Aberdeen, Scotland, UK) bezogen. Escherichia coli JM109 wurde von Promega (Southampton, UK) bezogen. Beide Organismen wurden immer gleich bleibend in SOB-Medium (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) bei 30°C (P. fluorescens) oder 37°C (E. coli) unter Drehschütteln bei 180 U/min gezüchtet.
Die Aktivität von STH wurde immer gleich bleibend bei 400 nm in einem Reaktionsgemisch aus 0,1 mM tNAD⁺ und 0,1 mM NADPH in 50 mM Phosphatpuffer, bei pH 7,0 und bei 30°C durch Beobachten der Reduktion von Thionicotinsäureamid-adenindinucleotid (tNAD⁺) bestimmt, einem Analogon von NAD⁺ mit veränderten Spektraleigenschaften. Eine Einheit (U) der Enzymaktivität wurde als der Betrag der Aktivität definiert, durch den unter diesen Bedingungen pro Minute 1 mmol tNAD⁺ reduziert wird. Die molare Extinktionsänderung von tNAD⁺ bei 400 nm bei der Reduktion zu tNADH wurde als 11.300 1 mol^–1 cm^–1 (Cohen et al. (1970) J. Biol. Chem. 245:2825- 2836) angenommen. Die Proteinkonzentration wurde immer gleich bleibend mithilfe des Reagens der Firma Pierce (Rockford, Illinois, USA) entsprechend den Herstellerangaben bestimmt. Als Standard wurde Rinderserumalbumin verwendet. Die spezifische Aktivität wurde als Einheiten STH-Aktivität je mg Protein (U/mg) berechnet.
Von Stratagene (Cambridge, Cambs., UK) wurde pBluescript SK+, ein gängiger Klonierungsvektor, bezogen. pS 1EMBL, ein Vektor mit geringer Kopienzahl, ist bei Poustka et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4129–4133 beschrieben. Mithilfe von gängigen Verfahren (Sambrook et al., siehe oben) erfolgten Southern Blot und DNA-Manipulation. Reinigung von STH: Die lösliche Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase (STH) wurde nach einer Abwandlung des Verfahrens von Höjeberg et al. (1976) Eur. J. Biochem. 66:467–475 aus Zellen von P. fluorescens NCIMB9815 gereinigt. Die Zellen wurden in 1 l SOB-Medium bis zur stationären Phase gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 g, 15 min) geerntet und in 20 ml Puffer A (50 mM Tris/HCl, pH 7,0, mit 2 mM Dithiothreitol) resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend durch Beschallung (25 Impulse von 5 s bei 12 μm, durch 30 s Pausen Abkühlung in einem Eiswasserbad unterbrochen) mit einem MSE Soniprep 150 auseinander gerissen. Die Zellreste wurden durch Zentrifugation (25.000 g, 10 min) entfernt. Der Auszug enthielt 93 Einheiten STH-Aktivität bei einer spezifischen Aktivität von 0,19 U/mg.
STH wurde mithilfe einer Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm gereinigt, die mit 6 ml Adenosin-2',5'-diphosphatagarose (Füllhöhe 7,6 cm) gepackt war. Die Säule wurde während des Ladens mit 12 ml/h betrieben und während des Waschens mit 24 ml/h. Alle Vorgänge erfolgten bei 4°C und alle Puffer enthielten 2 mM Dithiothreitol. Nach Äquilibrierung der Säule mit 5 mM CaCl₂ in Puffer A wurde das Rohextrakt (20 ml), zu dem CaCl₂ bis auf eine Endkonzentration von 5 mM hinzugegeben wurde, auf die Säule geladen. Die Säule wurde anschließend mit 90 ml 0,4 M NaCl, 5 mM CaCl₂ in Puffer A, gefolgt von 24 ml 0,7 M NaCl, 5 mM CaCl₂ in Puffer A gewaschen. Gebundenes vice versa wurde mit 50 mM tris/HCl, pH 8,9 herausgelöst, das 0,4 M NaCl enthielt. Es wurden 5 ml Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen zusammengefasst. Das zusammengefasste Produkt wurde durch Ultrafiltration mit einer Amicon 8050 Ultrafiltrationszelle konzentriert, die mit einer Membran mit einer nominalen Trenngrenze von M_r 10.000 versehen ist, und anschließend mit Puffer A diafiltriert, um den pH-Wert und die Salzkonzentration zu senken. Das Endvolunen betrug 1,5 ml. Dieses Material enthielt 62 U STH-Aktivität bei einer spezifischen Aktivität von 140 U/mg.
Dieses Produkt wurde anschließend in eine Gelfiltrationssäule mit einem Innendurchmesser von 1,6 cm gegeben, die mit 150 ml Sephacryl S-300 (Pharmacia) (Füllhöhe 75 cm) gepackt und mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 8 ml/h betrieben. Es wurden 2 ml Fraktionen aufgefangen. Die wirksamen Fraktionen (16 ml) wurden zusammengefasst und wie zuvor beschrieben durch Ultrafiltration auf ein Endvolumen von 1 ml konzentriert. Das Produkt enthielt 26 U STH-Aktivität bei einer spezifischen Aktivität von 310 U/mg.
Vor der Untersuchung mit SDS-PAGE wurde die Probe durch Gefriertrocknung und erneute Suspension in einer kleinen Menge von Puffer A weiter konzentriert. Das rekonstituierte Material war nicht aktiv. SDS-PAGE zeigte eine einzelne Proteinbande mit einem scheinbaren M_r von 55.000, was mit dem Wert in Einklang steht, der für das Enzym von Pseudomonas aeruginosa (Rydström et al., siehe oben) beschrieben wurde.
Klonen: Das Protein wurde mit dem Semidry-Übertragungssystem PhastTransfer (Pharmacia, St. Albans, Herts., UK) entsprechend den Herstellerangaben von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Membran aus Poly(vinylidendifluorid) (PVDF) (ProBlott, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) übertragen.
Die N-terminale Sequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die N-terminale Sequenz der gereinigten PNTH wurde bestimmt als:
A-V-Y-N-Y-D-V-V-V-L-G-S-(G/V)-P-A-G-E-(G/V)-A-A-M-N-A-A-(R/D)- wobei die Klammern ungewisse Zuordnungen anzeigen.
Auf der Grundlage von 20 Genen in der Gen-EMBL-Datenbank wurde eine Codonprä ferenztabelle für P. fluorescens abgeleitet. Daraus wurde für die meisten Codons eine merkliche Bevorzugung für G und C an der dritten Stelle deutlich. Auf der Grundlage dieser Codonpräferenz wurde das folgende degenerierte Oligonukleotid abgeleitet: AC-(C/G)AC-(C/G)AC-GTC-GTA-GTT-GTA-(C/G)AC-(G/C)GC (auf der Grundlage der Reste 1 bis 9 der N-terminalen Sequenz).
Southern Blots der genomischen DNA von P. fluorescens NCIMB9815 zeigten, dass sich dieses Oligonukleotid am stärksten an ein 5,0 kb Eco RI-Fragment gebunden hat. Im Klonierungsvektor pBluescript SK+ wurde mit E. coli JM109 als Wirt eine Bibliothek der Eco RI-Fragmente von 4 bis 6 kb erstellt, und rekombinante Zellen wurden durch Kolonieblotting unter Verwendung der Oligonukleotidsonde erfasst. Mehrere positive Kolonien wurden isoliert und es wurde herausgefunden, dass sie alle den gleichen Insert von 5,0 kb trugen. Es wurden beide Orientierungen des Inserts gewonnen. Die rekombinanten Plasmiden wurden als pSTH1A and pSTH1B bezeichnet, die sich nur in der Orientierung des Eco RI-Inserts unterschieden. Die Lage des Gens sth wurde durch Restriktionskartierung des Inserts und anschließender Southern-Analyse unter Verwendung der Oligonukleotidsonde bestimmt. Die Sequenzierung verwies auf die Gegenwart eines offenen Leserahmens, der ein Protein derselben N-terminalen Sequenz verschlüsselt wie die, die für STH bestimmt wurde. Es wurden verschiedene Subklone in pBluescript SK+ hergestellt und mithilfe von Primern auf der Grundlage von Vektoren sequenziert, wie in 1 gezeigt ist. Die Sequenz von sth und die abgeleitete Aminosäuresequenz von STH sind als SEQ Nr. 1 und 2 dargestellt.
Zellextrakte aus gesättigten E. coli JM109/pSTH1A- oder pSTH1B-Kulturen wiesen eine nachweisbare STH-Aktivität auf, die durch die Reduktion von Thionicotinsäureamid-adenin-dinucleotid (tNAD⁺) in Gegenwart von NADPH bestimmt wurde. Ein 1,5 kb SacII/XhoI-Fragment von pSTH1A wurde in pBluescript SK+ (2) subkloniert. Dieses Plasmid wurde als pSTH2 bezeichnet. Bei pSTH2 befindet sich sth in der richtigen Orientierung, sodass es unter dem lac-Promotor des pBluescript SK+ exprimiert werden kann. Zellextrakte aus gesättigten E. coli JM109/pSTH2- Kulturen in Abwesenheit oder Gegenwart von 0,4 mM IPTG wiesen eine Transhydrogenaseaktivität von 4,1 U/mg beziehungsweise 22,0 U/mg auf. Auf der Grundlage der spezifischen Aktivität von gereinigter STH wurde geschätzt, dass STH im letzteren Fall etwa 6% lösliches Zellprotein bildete, etwa hundertmal so viel, wie bei P. fluorescens beobachtet wurde.
Die rekombinante STH wurde bis zur apparenten Homogenität in einem einzigen affinitätschromatografischen Schritt mit Adenosin-2',5'-diphosphatagarose gereinigt. Wie zuvor beschrieben, wurde ein Zellextrakt aus 1 1 der gesättigten E. coli JM109/pSTH2-Kultur hergestellt, die in Gegenwart von 0,4 mM IPTG gezüchtet wurde. Von den entstehenden 25 ml Zellextrakt, wurden wie zuvor beschrieben 5 ml, die 2140 U STH-Aktivität bei einer spezifischen Aktivität von 27 U/mg enthielten, auf eine Säule geladen, die mit Adenosin-2',5'-diphosphatagarose gepackt war. Die Säule wurde mit 35 ml 0,7 M NaCl, 5 mM CaCl₂ in Puffer A gewaschen. STH wurde anschließend mit 0,4 M NaCl in 50 mM Tris/HCl, pH 8,9 herausgelöst. Die wirksamsten Fraktionen, insgesamt 13 ml, wurden wie zuvor beschrieben zusammengefasst, konzentriert und diafiltriert, mit der Ausnahme, dass eine Membran mit einer nominalen Trenngrenze bei einem Molekulargewicht von 300.000 verwendet wurde. Das Produkt enthielt 900 U STH-Aktivität bei einer spezifischen Aktivität von 300 U/mg. Dieses Material erschien homogen nach SDS-PAGE; daher wurde der Gelfiltrationsschritt weggelassen. Die gereinigte STH wurde bei –20°C in Puffer A mit 2 mM Dithiothreitol gelagert, ohne nachweisbaren Verlust der Aktivität über mehrere Wochen.
Die Eigenschaften der rekombinanten STH wurden mit denen verglichen, die für das Enzym von Pseudomonas aeruginosa beschrieben wurden. Das M_r der Untereinheit nach Bestimmung durch SDS-PAGE steht im Einklang mit dem zuvor beschriebenen (Rydström et al., siehe oben). Um zu ermitteln, ob das rekombinante Enzym große Polymere formen kann, wurden Proben an Kohlenstoffschichten angelagert, mit 1% w/v Uranylacetat negativgefärbt und elektronenmikroskopisch mit einem Phillips CM 100 Elektronenmikroskop untersucht. Es wurden lange Polymere mit einem Durchmesser von etwa 10 nm und über 500 nm Länge beobachtet. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten (Louie et al. (1972) J. Mol. Biol. 70:651–664).
Beispiel 2
Aus rekombinanten Escherichia-coli-Stämmen wurden nach veröffentlichten Verfahren (Willey et al. (1993) Biochem. J. 290:539–544; French und Bruce (1995) Biochem. J. 312:671–678) Morphindehydrogenase und Morphinonreduktase hergestellt. STH wurde aus Pseudomonas fluorescens NCIMB9815 hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Morphinalkaloide wurden mithilfe der HPLC mengenmäßig bestimmt (French et al., siehe oben).
Ein Reaktionsgemisch aus 0,5 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, das 10 mM Morphin, 0,2 mM NADPH, 0,2 mM NAD⁺, 1 mM Dithiothreitol, 1 Einheit Morphinonreduktase, 1 Einheit Morphindehydrogenase und 6 Einheiten STH enthielt, wurde bei 4°C 8 Stunden lang inkubiert. In Abständen wurden 50 μl Proben entnommen, mit Essigsäure behandelt, um Proteine auszufällen, und mit HPLC untersucht. Morphin wurde in hoher Ausbeute zu Hydromorphon umgewandelt, wie in 3 gezeigt. Es wurde auch ein Parallelversuch ohne STH durchgeführt. In diesem Fall kam es nicht zur Umwandlung von Morphin. Dadurch ist bewiesen, dass STH die Regeneration von Cofaktoren in einem enzymatischen Biotransformationsvorgang katalysieren kann.
Beispiel 3
Ein 1,2 kb Pst I-Fragment mit einem mutanten Morphindehydrogenase-Strukturgen (morA), vollständig mit seiner davor liegenden Ribosomenbindungsstelle und den Promotorsequenzen, wurde in den Vektor pS 1EMBL mit geringer Kopienzahl ligiert, der vorher mit Pst I verdaut wurde, wodurch das Konstrukt pMORA4mutMC80S entstand, das geeignete Restriktionsstellen zum weiteren Subklonieren enthielt. Ein 1,2 kb HindIII/Eco RI-Fragment, das das mutante morA-Gen, die Ribosomenbindungsstelle und den Promotorbereich trägt, wurde aus pMORA4mutMC80S herausgeschnitten und in pMORB3 ligiert, das mit HindIII/Eco RI verdaut wurde (French et al., siehe oben) und eine einzelne Kopie von morB, dem Strukturgen für Morphinonreduktase, zusammen mit seiner Ribosomenbindungsstelle und dem Promotorbereich trägt, wodurch das Konstrukt pMORB3-AmutMC80S entstand.
Ein 1,5 kb Pst I/XhoI-Fragment, das das Strukturgen für die lösliche Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase enthält, wurde in pS 1EMBL ligiert, der vorher mit Pst I und Sal I verdaut wurde, wodurch das Konstrukt pPNT4 entstand.
Zellen von E. coli JM109/pMORB3-AmutMC80S und E. coli JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 wurden bis zur stationären Phase gezüchtet und durch Zentrifugation bei 17.310 × g für 15 min bei 4°C geerntet. Die Zellen wurden anschließend mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die pelletierten Zellen auf Eis gelagert, bis sie für die Biotransformation benötigt wurden. Typische Werte für die Enzymaktivität in Zellen von E. coli JM109/pMORB3-AmutMC80S betrugen 0,06 U/mg für Morphindehydrogenase und 0,88 U/mg für Morphinonreduktase; wohingegen die Werte in Zellen von E. coli JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 0,044 U/mg für Morphindehydrogenase, 0,78 U/mg für Morphinonreduktase und 0,72 U/mg für STH betrugen. Ganzzellbiotransformationen mit kleinen Substanzmengen (Gesamtvolumen 3 ml) wurden in Reaktionsgemischen mit 20 mM Morphin und einer Endzelldichte von 0,17 g/ml in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) durchgeführt. Die Biotransformationen erfolgten zweimal bei 30°C mit einem Drehschüttelapparat und in regelmäßigen Abständen wurden Proben entnommen. Die Proben wurden durch Zentrifugation gereinigt und mithilfe der HPLC auf den Opiatgehalt hin untersucht, wie vorher beschrieben ist (French et al., siehe oben). Es erfolgte eine Reihe aufeinander folgender Biotransformationen mit derselben Charge Zellen, die zwischen den Inkubationen geerntet und gewaschen wurde. Die Ergebnisse, die in 4 veranschaulicht sind, deuten darauf hin, dass Zellen, die rekombinante STH enthalten, mehr als einmal für den Biotransformationsvorgang verwendet werden konnten, während Zellen ohne rekombinante STH nur einmal verwendet werden konnten. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die rekombinante STH bei in vivo-Enzymvorgängen, die auf NADP und NAD angewiesen sind, zur Cofaktorregeneration in der Lage ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Mikroorganismus' als Biokatalysator, wobei der Mikroorganismus so verändert ist, dass er ein Enzym exprimiert, das eine Sequenz mit mehr als 70% vollkommener Übereinstimmung mit SEQ Nr. 2 aufweist und Reduktionsäquivalente zwischen Pyridin-Nucleotid-Cofaktoren übertragen kann.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die vollkommene Übereinstimmung mindestens 80% beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die vollkommene Übereinstimmung mindestens 90% beträgt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym die lösliche Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer analytischen Untersuchung auf Enzymbasis, wobei auf der Grundlage der Oxidation von NADH zu NAD⁺ zusätzlich ein Signal gemessen wird.
Verfahren, bei dem ein Substrat mithilfe eines Enzyms und eines Pyridin-Nucleotid-Cofaktors in ein Produkt umgewandelt wird und das die Verwendung eines Enzyms oder Mikroorganismus' umfasst, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 6, das eine Biotransformation oder eine Untersuchung ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das Substrat Morphin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Cofaktor in einer katalytischen Menge verwendet wird.
Nucleotidmolekül mit einer Sequenz mit über 70% vollkommener Übereinstimmung mit SEQ Nr. 1, das ein Enzym verschlüsselt, das die Wirksamkeit der löslichen Pyridin-Nucleotid-Transhydrogenase aufweist.