DE60105185T2

DE60105185T2 - 2,5-diketo-d-gluconsäure-reduktasen und deren anwendungen

Info

Publication number: DE60105185T2
Application number: DE60105185T
Authority: DE
Inventors: Mark Donnelly; H. William ESCHENFELDT; Jonathan Trent
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2021-10-03
Also published as: US20120322095A1; ES2223927T3; US20140141448A1; AU2002211843A1; US20150064736A1; US6576452B1; US20030203449A1; US8216811B2; US20050158762A1; DE60105185D1; US20100021908A1; US20110229943A1; US7922483B2; WO2002029019A3; ATE274576T1; PT1322753E; US7374917B2; US6864075B2; US20080248546A1; WO2002029019A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft natürlich vorkommende und rekombinante Varianten der 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase. Spezifischer betrifft die Erfindung die Isolation, Identifizierung und Verwendung von 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen.
Hintergrund der Erfindung
Die Umwandlung von Glucose in Vitamin C (Ascorbinsäure) ist ein komplizierter Prozeß, da er die selektive Epimerisierung, Oxidierung und Lactonbildung einschließt. Die natürlichen Biosynthesewege sind lang und enthalten viele energiekonsumierende Reaktionen (Davey et al., Plant Physiol. 121(2): 535–43 (1999); M. Nishikimi und K. Yagi, Subcell Biochem. 25: 17–39 (1996); Wheeler et al., Nature 393(6683): 365–9 (1998)). Das gegenwärtige kommerzielle Verfahren zur Ascorbinsäureproduktion (das Reichstein-Verfahren) verbindet einen einzigen, biologischen Anfangsschritt – die mikrobielle Reduktion von Glucose zu Sorbitol – mit der darauffolgenden mehrstufigen chemischen Umwandlung von blockierten Sorbitolderivaten zu Ascorbinsäure (T. C. Crawford, American Chemical Society, Washington, DC (1982); T. Reichstein und A. Grussner, Helv. Chim. Acta 16: 311 (1934)). Ein alternatives kommerzielles Verfahren, welches die biologische Umwandlung von Glucose in 2-Keto-L-gulonsäure, welche chemisch zu Ascorbinsäure laktonisiert wird, umfaßt, ist vorgeschlagen worden (Anderson et al., Science 230: 144–149 (1985); Grindley et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 1770–1775 (1988); Sonoyama et al., US-Patent 3,922,194 (1975)). Der beteiligte biologische Metabolismus ist einfacher als jener der natürlichen Biosynthesewege und benötigt weniger metabolische Energie (weniger ATP und NADPH). In diesem Verfahren wird Glucose zunächst durch endogene Oxidasen eines geeigneten Bakterienstammes, unter Verwendung von molekularem Sauerstoff als den letzten Elektronenakzeptor, in 2,5-Diketo-D-gluconsäure umgewandelt. 2,5-Diketo-D-gluconsäure wird dann durch eine heterologe 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase (DKGR), welche in dem Produktionsstamm exprimiert wird, enzymatisch zu 2-Keto-L-gulonsäure reduziert. Das für die Reaktion benötigte NADPH wird durch den Metabolismus des Wirtsstammes generiert. Schließlich erzeugt chemische Laktonisierung von 2-Keto-L-gulonsäure Ascorbinsäure.
Bis heute wurden nur zwei 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen umfassend charakterisiert, beide wurden von einer Corynebacterium-Art isoliert (Miller et al., J. Biol. Chem. 262(19): 9016–20; D. B. Powers und S. Anderson, US-Patent 5,795,761 (1998); T. Sonoyama und K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311–317 (1987)). Diese Enzyme können 2,5-Diketo-D-gluconsäure reduzieren, jedoch könnten alternative oder veränderte Reduktasen die Ascorbinsäureproduktion durch das oben beschriebene Verfahren oder Varianten davon verbessern. Beide Corynebacterium-Enzyme sind relativ ineffiziente Katalysatoren, mit K_m-Werten für 2,5-Diketo-D-gluconsäure von mehr als 1 mM und katalytischen Effizienzen (k_cat/K_m) von weniger als 20 mM^–1sec^–1.
2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen sind Mitglieder der Aldo-Keto-Reduktase-Superfamilie (Jez et al., Biochem J. 326(Pt3): 625–36 (1997); Seery et al., J. Mol. Evol. 46(2): 139–46 (1998)). Wie beinahe alle anderen Aldo-Keto-Reduktasen sind die bekannten 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen ausschließlich für NADPH spezifisch (Jez et al., Biochem J. 326(Pt3): 625–36 (1997); Seery, J. Mol. Evol. 46(2): 139–46 (1998)). Kürzlich wurden basierend auf einer Suche der Genomsequenzen aus E. coli zusätzliche Aldo-Keto-Reduktasen isoliert, welche 2,5-Diketo-D-gluconsäure zu 2-Keto-L-gulonsäure umwandeln können (Yum et al., Bacteriol. 180(229): 5984–8 (1998); Yum et al., Appl. Environ. Microbiol. 65(8): 3341–6 (1999)). Jedoch katalysieren auch diese Enzyme die Reaktion relativ ineffizient. Den bekannten 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen mangelt es auch an Stabilität; beide Corynebacterium-Enzyme sind thermisch labil (D. B. Powers und S. Anderson, US-Patent 5,795,761 (1998); T. Sonoyama und K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311–317 (1987)).
Daher wäre es wünschenswert, das Problem der ineffizienten Reduktasen durch Bereitstellung von 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen zu lösen, welche effizienter als bekannte Reduktasen sind. Insbesondere wäre es wünschenswert, neue Enzyme mit einer größeren katalytischen Effizienz als bisher bekannte 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen zur Verfügung zu stellen, welche NADH-abhängige Aktivität haben. Es wäre darüber hinaus wünschenswert, daß die Reduktase thermisch stabiler als bekannte 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen ist. Es wäre darüber hinaus wünschenswert, Varianten dieser Reduktasen, Verfahren zur Herstellung, dem Screening und der Verwendung neuer Reduktasen zur Verfügung zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuren, Proteine, Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben zur Verfügung, welche jeweils Reduktasen der Aldo-Keto-Reduktasen-Superfamilie umfassen.
In einer Ausführungsform wird ein Expressionsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, zur Verfügung gestellt, welche ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche zumindest 60% Sequenzidentität zu einer in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigten Aminosäuresequenz hat, kodiert. Das Peptid hat 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktaseaktivität. In einer weiteren Ausführungsform hat diese Aminosäuresequenz zumindest etwa 70%, 80% oder soviel wie 90% Sequenzidentität zu einer in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigten Aminosäuresequenz.
In einer weiteren Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine Nukleotidsequenz wie in 2A (SEQ ID NO: 7) oder 2B (SEQ ID NO: 9) gezeigt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung enthält der Expressionsvektor eine Sequenz, die aus der in 1 (SEQ ID NO: 1–6) gezeigten Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist.
Es wird auch ein Mikroorganismus zur Verfügung gestellt, der einen oder mehrere besagter Vektoren enthält. Vorzugsweise ist jener Mikroorganismus aus Pantoea.
Darüber hinaus wird hierin ein Polypeptid zur Verfügung gestellt, welches eine Aminosäuresequenz enthält, die zumindest 60% Identität mit einer in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigten Aminosäuresequenz hat. Jedes Polypeptid enthält 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktaseaktivität. In einer weiteren Ausführungsform hat jenes Polypeptid zumindest 70% Sequenzidentität mit jener Aminosäuresequenz aus 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10). In einer weiteren Ausführungsform wird hierin ein Polypeptid zur Verfügung gestellt, welches die in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigte Aminosäuresequenz hat.
In einer Ausführungsform hat jenes Polypeptid an einer zur Position 232 und/oder Position 238 der in 2A (SEQ ID NO: 7) gezeigten Aminosäuresequenz korrespondierenden Position ein Q.
In einer weiteren Ausführungsform hat jene Reduktase NADH-abhängige Aktivität.
Es wird hiermit ebenfalls ein Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Ascorbinsäure zur Verfügung gestellt, welches die Kultivierung von hiermit zur Verfügung gestellten Wirtszellen, unter für die Expression von 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase geeigneten Bedingungen, umfaßt.
Andere Aspekte der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Anmeldung klar werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Ausrichtung der Nukleotidsequenzen (SEQ ID NO: 1–6) der sechs Umwelt-DNA-PCR-Produkte. Die gesamte Sequenz des Klons pI-14 ist gezeigt. Identische Basen in den verbleibenden Sequenzen werden durch Punkte (.) gezeigt. In die Ausrichtung eingeführte Lücken werden als Striche (–) bezeichnet. Die durchgezogenen Striche zeigen die Positionen der zwei degenerierten PCR-Primer.
2 zeigt die Nukleotidsequenzen der Gesamtlängenklone für pI-14 (2A (SEQ ID NO: 7)) und pI-28 (2B (SEQ ID NO: 9)). Die kodierende Region der vermutlichen Reduktasegene werden durch Großbuchstaben bezeichnet, mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 8 bzw. 10) direkt darunter im Einbuchstabenkode gezeigt. Positionen der degenerierten und klonspezifischen Primer sind durch Pfeile gezeigt. Die vermutlichen partiellen offenen Leseraster upstream und downstream des Reduktasegens werden durch durchgezogene Striche gekennzeichnet.
3 zeigt die Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Klone pI-14 (SEQ ID NO: 8) und pI-28 (SEQ ID NO: 10). Die gesamte Sequenz von pI-14 wird gezeigt. Identische Basen im Klon pI-28 werden durch Punkte (.) gekennzeichnet.
4 zeigt ein rekombinantes Verfahren für die Umwandlung von Glucose in Ascorbinsäure.
5 zeigt Massenspektren von 2-Keto-L-gulonsäure-Reaktionsprodukt und 2-Keto-L-gulonsäure-Standard. 5A zeigt das Massenspektrum von 2-Keto-L-gulonsäure-Reaktionsprodukt. 5B zeigt das Massenspektrum von 2-Keto-L-gulonsäure-Standard.
6 zeigt die pH-Abhängigkeit der Reaktionsrate.
7 zeigt die NADH-abhängige 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Aktivität von aus der Umwelt isolierten 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen. 7A zeigt die NADH-abhängige Aktivität und 7B zeigt die Steigerung der NADH-abhängigen Aktivität durch Einschließen von anorganischem Phosphat.
8 zeigt die thermische Stabilität von Umweltform d (DKGRd) von 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Hierin werden neue Proteine und die Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt. Ebenso wird hierin die Verwendung jener Proteine und Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden hierin Verfahren zur Isolierung und Herstellung jener Proteine und Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt. Des weiteren wurden in einem Aspekt der Erfindung die hierin zur Verfügung gestellten Proteine als zur Familie der Aldo-Keto-Reduktasen gehörend identifiziert und sind 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen.
Ein Protein mit 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase (DKGR)-Aktivität wird hierin als ein Protein, welches die Umwandlung von 2,5-Diketo-D-gluconsäure in 2-Keto-L-gulonsäure katalysieren kann, definiert. In bevorzugten Ausführungsformen dürfen die hierin zur Verfügung gestellten 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen entweder NADPH oder NADH als Cosubstrate akzeptieren. In einer Ausführungsform sind beide Substrate. In einer anderen Ausführungsform kann DKGR als Kohlenstoff- oder Zuckerquelle dienen. In noch einer weiteren Ausführungsform hat DKGR andere Aktivitäten von Reduktasen, im speziellen Aldo-Keto-Reduktasen.
Es wird festgelegt, daß DKGR-Protein und Nukleinsäure hierin als "DKGR-Sequenzen" bezeichnet werden können, wobei aus dem Kontext hervorgeht, ob die Sequenz eine Aminosäuresequenz, eine Nukleinsäuresequenz oder beides ist.
In einem Aspekt der Erfindung haben die hierin zur Verfügung gestellten DKGR-Proteine veränderte Eigenschaften gegenüber zuvor beschriebenen DKGRs. Eigenschaften welche geändert sein können umfassen eine oder mehrere der folgenden: katalytische Effizienz, NADH-abhängige Aktivität, thermische Stabilität, Lösungsmitteltoleranz, Spezifität und pH-Optimum, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Verändert bedeutet, daß eine nachweisbare Veränderung stattgefunden hat, üblicherweise eine Zu- oder Abnahme von zumindest 10%, bevorzugter 30%, noch bevorzugter 75%, noch bevorzugter 100%, und noch bevorzugter mindestens 2- oder 3-mal mehr. Vorzugsweise ist die Eigenschaft katalytische Effizienz, thermische Stabilität oder Lösungsmitteltoleranz verbessert. Zusätzlich, wie weiter unten beschrieben, kann die hierin zur Verfügung gestellte Sequenz verändert oder verwendet werden, um DKGR-Proteine mit einer veränderten Eigenschaft im Vergleich zu den DKGR-Proteinen aus 2 oder kodiert durch die in 1 gezeigten Sequenzen zu erzeugen.
In einer Ausführungsform kann eine DKGR-Sequenz anfänglich unter Verwendung von degenerierten PCR-Primern, abgeleitet von zuvor publizierter oder hierin beschriebener Sequenzinformation über DKGRs, identifiziert werden. Vermutliche Gesamtlängengene werden zunächst unter Verwendung sukzessiver PCR-Schritte erhalten, in welchen die Spezifität der Reaktion mit jedem Schritt des Nestingverfahrens zunimmt. Um zu überprüfen, daß das durch dieses Verfahren erhaltene Gesamtlängengen eine natürliche vorkommende Gensequenz darstellt, wird das gesamte Gen direkt aus der Anfangsprobe von Umwelt-DNA unter Verwendung von PCR-Primern, welche auf die flankierenden Regionen der vorhergesagten Sequenzen zielen, amplifiziert.
In weiteren Ausführungsformen kann eine DKGR-Sequenz durch substantielle Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz-Homologie zu den hierin beschriebenen DKGR-Sequenzen identifiziert werden. Solche Homologie kann auf der gesamten Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz basieren und wird generell, wie nachfolgend beschrieben, unter Verwendung von entweder Homologieprogrammen oder Hybridisierungsbedingungen bestimmt.
Somit ist in einer Ausführungsform eine Nukleinsäure eine "DKGR-Nukleinsäure", wenn die Gesamthomologie zu den Nukleotidsequenzen der Figuren (den Nukleinsäurefiguren) größer als 60 oder 70%, bevorzugter größer als etwa 80% oder bevorzugter größer als etwa 85% und am meisten bevorzugt größer als 90% ist. In manchen Ausführungsformen wird die Homologie so hoch wie etwa 93 bis 95 oder 98% sein. Homologie wie hierin verwendet bezieht sich auf Sequenzähnlichkeit oder -identität, wobei Identität bevorzugt ist. Diese Homologie wird unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken bestimmt werden, welche die folgenden einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind: den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), den Homologieausrichtungs-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), die Similaritätssuchmethode von Pearson & Lipman, PNAS USA 85: 2444 (1988), computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP; BESTFIT; FASTA und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), das Best Fit Sequenzprogramm beschrieben durch Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387–395 (1984), bevorzugterweise unter Verwendung der Starndardeinstellungen oder durch Überprüfung.
Ein Beispiel für einen nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt eine Mehrsequenzenausrichtung von einer Gruppe verwandter Sequenzen unter Verwendung progressiver, paarweiser Ausrichtungen. Es kann auch einen Baum darstellen, welcher die zur Erzeugung der Ausrichtung verwendeten Clusteringbeziehungen zeigt. PILEUP verwendet eine Vereinfachung der progressiven Ausrichtungsmethode von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351–360 (1987); das Verfahren ist ähnlich zu dem von Higgins & Sharp beschriebenen CABIOS 5: 151–153 (1989). Nützliche PILEUP-Parameter beinhalten ein Standardlückengewicht ("default gap weight") von 3,00, ein Standardlückenlängengewicht ("default gap length weight") von 0,10 und gewichtete Endlücken ("weighted end gaps").
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Mehrfachsequenzanalyse unter Verwendung der Lasergen-Programmsuite von DNASTAR durchgeführt. DNASTAR verwenden den Clustal-Algorithmus der Megalign-Programmversion 3.12. Standardmehrfach-Ausrichtungsparameter umfassen eine Lückenstrafe ("gap penalty") von 10 und eine Lückenlängenstrafe ("gap length penalty") von 10. Paarweise Ausrichtungsstandardparameter umfassen ein Ktuple ("ktuple") von 1, eine Lückenstrafe ("gap penalty") von 3, ein Fenster ("window") von 5 und gespeicherte Diagonalen ("diagonals saved") von 5.
Ein anderes Beispiel eines nützlichen Algorithmus ist der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990) und Karlin et al., PNAS USA 90: 5873–5878 (1993) beschriebene BLAST-Algorithmus. Ein besonders nützliches BLAST-Programm ist das WU-BLAST-2-Programm, welches von Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460–480 (1996);
http://blast.wust1/edu/blast/README.html] erhalten wurde. WU-BLAST-2 verwendet mehrere Suchparameter, wovon die meisten auf die Standardwerte gesetzt sind. Die einstellbaren Parameter sind auf die folgenden Werte gesetzt: Überlappungsspanne ("overlap span") = 1, Überlappungsfraktion ("overlap fraction") = 0,125, Wortschwellenwert (T)("word threshold (T)") = 11. Die HSP S und HSP S2 Parameter sind dynamische Werte und werden von dem Programm selbst etabliert, abhängig von der Zusammensetzung der speziellen Sequenz und Zusammensetzung der speziellen Datenbank, gegen welche die Sequenz von Interesse abgeglichen wird; jedoch können diese Werte angepaßt werden, um die Sensitivität zu erhöhen. Ein %-Wert der Aminosäuresequenzidentität wird bestimmt durch die Anzahl von passenden identischen Resten geteilt durch die Gesamtanzahl der Reste der "längeren" Sequenz in der ausgerichteten Region. Die "längere" Sequenz ist jene mit den meisten tatsächlichen Resten in der ausgerichteten Region (durch WU-BLAST-2 zur Maximierung des Ausrichtungsscores eingeführte Lücken werden ignoriert).
Ein aktualisierter BLAST-Algorithmus wird in Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389–3402 (1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ beschrieben. Ein besonders nützliches BLAST-Programm ist Basic BLAST. Bevorzugte Parameter sind Lambda K H 0,318, 0,135, 0,401 und Lücken Lambda ("gapped lambda") K H 0,27, 0,0470, 0,23, Matrix: BLOSUM62, Lückenstrafen ("gap penalties"): Existenz 11, Extension 1. Bevorzugte Parameter für die multiple Ausrichtung, die hierin gezeigt wird, welche auf der Lasergen-Programmsuite von DNASTAR durchgeführt wurde, sind die Standardeinstellungen des Clustal-Algorithmus in dem Megalign-Programm. Die Parameterinformation ist: (Mehrfachausrichtungen) Lückenstrafe ("gap penalty") 10, Lückenlängenstrafe ("gap length penalty") 10, (paarweise Ausrichtungen) ktuple 1, Lückenstrafe ("gap penalty") 3, Fenster ("window") 5 und Diagonalen ("diagonals") 5.
Somit ist "Prozent (%) Nukleotidsequenzidentität" definiert als der Prozentsatz von Nukleotidresten in einer Kandidatensequenz, welche mit den Nukleotidresten der in den Nukleinsäureabbildungen gezeigten Sequenzen identisch sind. Eine bevorzugte Methode verwendet das BLASTN-Modul von WU-BLAST-2, welches auf die Standardeinstellungen eingestellt ist, mit Überlappungsspanne ("overlap span") und Überlappungsfraktion ("overlap fraction") auf 1 bzw. 0,125 gesetzt.
Die Ausrichtung kann die Einführung von Lücken in die auszurichtende Sequenz umfassen. Eine besonders bevorzugte Methode verwendet die BLASTX- und BLASTP-Module von Basic BLAST eingestellt auf Matrix BLOSUM62 und eine Lückenstrafe ("gap penalty") von 11 für Existenz und eine Lückenstrafe von 1 für Extension.
Zusätzlich gilt für Sequenzen, welche entweder mehr oder weniger Nukleoside als jene der Nukleinsäureabbildungen enthalten, daß der Prozentsatz der Homologie basierend auf der Anzahl von homologen Nukleosiden in Relation zur Gesamtzahl von Nukleosiden bestimmt werden wird. Somit wird zum Beispiel die Homologie von Sequenzen, welche kürzer als jene hierin identifizierten Sequenzen sind und wie im folgenden diskutiert wird, unter Verwendung der Nukleosidanzahl der kürzeren Sequenz bestimmt werden.
In einer Ausführungsform wird die DKGR-Nukleinsäure durch Hybridisierungsstudien bestimmt. Somit werden zum Beispiel Nukleinsäuren, welche unter hochstringenten Bedingungen an in den Figuren dargestellten Nukleotidsequenzen hybridisieren, oder eine komplementäre Sequenz, in einer Ausführungsform hierin als DKGR-Sequenz angesehen. Hochstringente Bedingungen sind dem Fachmann bekannt; siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) und Short Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., welche hiermit beide durch Bezugnahme inkorporiert werden. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen verschieden sein. Längere Sequenzen hybridisieren bei höheren Temperaturen spezifisch. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren kann in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) gefunden werden. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß sie etwa 5–10°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH sind. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der zum Ziel komplementären Sonde im Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren (da die Zielsequenzen im Überschuß vorhanden sind, sind im Gleichgewicht bei Tm 50% der Sonden belegt). Stringente Bedingungen sind solche, in denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) ist, bei einem pH 7,0 bis 8,3 und die Temperatur zumindest etwa 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) und zumindest etwa 60°C für lange Sonden (z. B. größer als 50 Nukleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch Zusatz von destabilisierenden Substanzen wie Formamid erreicht werden.
In einer anderen Ausführungsform werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet; zum Beispiel moderate oder niedrige Stringenzbedingungen können verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind; siehe Maniatis und Ausubel wie oben und Tijssen wie oben.
Die DKGR-Nukleinsäuresequenzen können Fragmente größer Gene sein, d. h. sie sind Nukleinsäuresegmente. In diesem Zusammenhang umfaßt "Gene" kodierende Regionen, nicht kodierende Regionen und Mischungen von kodierenden und nicht kodierenden Regionen. Dementsprechend können, wie für den Fachmann nachzuvollziehen, unter Verwendung der hierin zur Verfügung gestellten Sequenzen zusätzliche Sequenzen von 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasegenen erhalten werden, unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Techniken zur Klonierung von entweder längeren Sequenzen oder den Gesamtlängensequenzen; siehe Maniatis et al. und Ausubel et al. wie oben, auf welche hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden DKGR-Sequenzen aus der Umwelt isoliert. Hierin wird mit "Isolierung von Umwelt-DNA" Extrahieren von genomischer DNA aus Erd- und/oder Wasserproben gemeint. Das heißt, Umwelt-DNA ist DNA erhalten von nicht kultivierten Organismen, welche noch nicht unter Laborbedingungen vermehrt wurden.
Während es bevorzugt ist, daß DKGR-Sequenzen von nicht kultivierten Organismen isoliert werden, können Sequenzen von kultivierten Organismen nützlich sein. Unter "kultiviert" werden hierin Organismen verstanden, welche in der Lage sind auf Nährstoffmedien in einem Labor zu wachsen. Somit werden in alternativen Ausführungsformen andere Sequenzen von Mikroorganismen zur Verfügung gestellt, welche in der Lage sind 2,5-Diketo-D-gluconsäure in 2-Keto-L-gluconsäure umzuwandeln, umfassend die Gruppe von coryneformen Bakterien (Corynebacterium, Brevibacterium und Arthobacter) sowie Arten von Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus und Citrobacter. Andere Mikroorganismen, die Homologe aufweisen, umfassen N. Crassa, Y. pestis, Zymomonas mobilis, Saccharomyces cerevisiae.
In einer anderen Ausführungsform sind die Sequenzen Sequenzvarianten wie hierin weiter beschrieben.
Sobald eine DKGR-Nukleinsäuresequenz identifiziert wurde, kann sie kloniert werden und ihre Bestandteile kombiniert werden, um die Gesamt-DKGR-Nukleinsäure zu bilden, oder vice versa kann ein Fragment gebildet werden. Einmal aus ihrer natürlichen Quelle isoliert, z. B. in einem Plasmid oder anderen Vektor enthalten, oder daraus als lineares Nukleinsäuresegment ausgeschnitten, kann die rekombinante DKGR-Nukleinsäure als Sonde weiter verwendet werden, um andere DKGR-Nukleinsäuren zu identifizieren und isolieren. Sie kann auch als "Vorläufer"-Nukleinsäure verwendet werden, um modifizierte oder variante DKGR-Nukleinsäuren und Proteine herzustellen. "Rekombinant" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Nukleinsäure oder ein Protein, welche nicht in ihrem nativen Zustand sind. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure gentechnisch hergestellt, isoliert, in einen menschengemachten Vektor eingesetzt sein oder in einer Zelle sein, worin sie nicht natürlicherweise exprimiert wird, um als rekombinant zu gelten.
Der Ausdruck "Nukleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide sowie Polymere daraus in einzel- oder doppelsträngiger Form. Wenn nicht spezifisch ausgeschlossen, umfaßt der Begriff Nukleinsäuren, welche bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden mit ähnlichen Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure und die auf eine ähnliche Art wie natürlich vorkommende Nukleotide metabolisiert werden, enthalten. Soweit nicht anders festgelegt, umfaßt eine bestimmte Nukleinsäuresequenz auch implizit konservativ veränderte Varianten davon (z. B. degenerierte Kodonsubstitutionen) und komplementäre Sequenzen sowie die explizit bezeichnete Sequenz. Spezifisch können degenerierte Kodonsubstitutionen dadurch erreicht werden, daß Sequenzen generiert werden, in denen die dritte Position eines oder mehrerer (oder aller) ausgewählter Kodons mit gemischten Basen und/oder Deoxyinosinresten substituiert werden (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605–2608 (1985); Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91–98 (1994)). Der Begriff Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA und mRNA, welche von einem Gen kodiert wird, verwendet.
Nukleinsäuren, die DKGR-Proteine kodieren, werden dazu verwendet, verschiedene Expressionsvektoren, welche DKGR-Proteine exprimieren, herzustellen, welche dann verwendet werden können um 2,5-Diketo-D-gluconsäure in 2-Keto-L-gulonsäure umzuwandeln, wie nachfolgend beschrieben. Die Expressionsvektoren können entweder selbstreplizierende extrachromosomale Vektoren oder Vektoren sein, welche in ein Wirtsgenom integrieren.
Im allgemeinen enthalten diese Expressionsvektoren Transkriptions- und Translations-regulierende Nukleinsäuren, welche operativ an die Nukleinsäure, welche das DKGR-Protein kodiert, gekoppelt sind. Der Begriff "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche zur Expression einer operativ gekoppelten kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die zum Beispiel für Prokaryonten geeignet sind, umfassen einen Promotor, optional eine Operatorsequenz und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Eukaryontische Zellen verwenden Bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Verstärker.
Eine Nukleinsäure ist "operativ gekoppelt" wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt ist. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Vorsequenz oder einen Sekretionsleader operativ an eine DNA für ein Polypeptid gekoppelt, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, welches an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Verstärker ist operativ an eine kodierende Sequenz gekoppelt, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gekoppelt, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet "operativ gekoppelt", daß die gekoppelten DNA-Sequenzen fortlaufend sind, und im Fall eines Sekretionsleaders fortlaufend und in Lesephase. Verstärker jedoch müssen nicht fortlaufend sein. Koppelung wird durch Ligierung an geeignete Restriktionsstellen erreicht. Falls solche Stellen nicht vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonukleotidadaptoren oder Linker nach gängiger Praxis verwendet. Die transkriptionell und translationell regulatorische Nukleinsäure wird im allgemeinen geeignet sein für die Wirtszelle, die verwendet wird, um DKGR- Protein zu exprimieren; zum Beispiel werden transkriptionelle und translationelle regulatorische Nukleinsäuresequenzen von Pantoea bevorzugt verwendet, um DKGR-Protein in Pantoea zu exprimieren. Dem Fachmann sind zahlreiche Arten von geeigneten Expressionsvektoren und geeigneten regulatorischen Sequenzen für eine Vielzahl von Wirtszellen bekannt.
Im allgemeinen können die transkriptionellen und translationellen regulatorischen Sequenzen Promotorsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, transkriptionelle Start- und Stopsequenzen, translationelle Start- und Stopsequenzen und Verstärker- oder Aktivatorsequenzen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die regulatorischen Sequenzen einen Promotor und transkriptionelle Start- und Stopsequenzen.
Promotorsequenzen kodieren entweder konstitutive oder induzierbare Promotoren. Die Promotoren können entweder natürlich vorkommende Promotoren oder hybride Promotoren sein. Hybride Promotoren, welche Elemente aus mehr als einem Promotor kombinieren, sind dem Fachmann auch bekannt und sind für die vorliegende Erfindung nützlich.
Zusätzlich können die Expressionsvektoren weitere Elemente umfassen. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme haben, dadurch kann er in zwei Organismen gehalten werden, zum Beispiel in Säuger- oder Insektenzellen zur Expression, und in einem Prokaryontenwirt zum Klonieren und zur Amplifikation. Für integrierende Expressionsvektoren enthält der Expressionsvektor des weiteren zumindest eine Sequenz, die zum Wirtszellengenom homolog ist, und bevorzugt zwei homologe Sequenzen, welche das Expressionskonstrukt flankieren. Der integrierende Vektor kann auf einen spezifischen Locus in der Wirtszelle durch Auswahl der geeigneten homologen Sequenz zum Einschluß in den Vektor gerichtet sein. Dem Fachmann sind Konstrukte für integrierende Vektoren wohlbekannt.
Zusätzlich enthält der Expressionsvektor in einer bevorzugten Ausführungsform ein selektierbares Markergen, um die Selektion von transformierten Wirtszellen zu ermöglichen. Selektionsgene sind dem Fachmann wohlbekannt und unterscheiden sich je nach verwendeter Wirtszelle.
Die DKGR-Proteine der vorliegenden Erfindung können durch Kultivierung einer Wirtszelle produziert werden, welche mit einem Expressionsvektor, der die Nukleinsäure enthält, welche ein DKGR-Protein kodiert, transformiert wurde, und die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, um die Expression von DKGR-Protein zu induzieren oder zu bewirken. Die zur Expression von DKGR-Protein geeigneten Bedingungen werden in Abhängigkeit von der Wahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle variieren und werden vom Fachmann durch Routineversuche leicht festgestellt werden können. Zum Beispiel wird die Verwendung konstitutiver Promotoren im Expressionsvektor die Optimierung von Wachstum und Vermehrung der Wirtszelle vonnöten machen, während die Verwendung eines induzierbaren Promotors geeignete Wachstumsbedingungen für Induktion benötigt. Zusätzlich ist in manchen Ausführungsformen die Zeit des Erntens wichtig. Zum Beispiel sind die in Insektenzellenexpression verwendeten baculoviralen Systeme lytische Viren, und somit kann die Wahl des Erntezeitpunkts entscheidend für die Produktausbeute sein.
Geeignete Wirtszellen umfassen Hefe, Bakterien, Archaebakterien, Pilze, Insekten- und Tierzellen, einschließlich Säugerzellen. Von besonderem Interesse sind Drosophila melanogaster Zellen, Saccharomyces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus subtilis, Pantoea sp., Sf9 Zellen, C129 Zellen, 293 Zellen, Neurospora, BHK, CHO, COS, HeLA Zellen, Adenovirus und Pflanzenzellen. Pantoae agglomerans, z. B. Stamm ATCC 27155; Pantoea ananatis, z. B. ATCC 33244, Pantoea citrea, z. B. ATCC 31623, Pantoea dispersa, z. B. ATCC 14589, Pantoea punctata, z. B. ATCC 31626, Pantoea stewartii, z. B. ATCC 8199. Die Auswahl der Wirtszelle ist nach der vorliegenden Lehre dem Fachmann möglich.
In einer Ausführungsform werden die DKGR-Proteine in Säugerzellen exprimiert. Säugerexpressionssysteme sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und schließen retrovirale Systeme ein. Verfahren um exogene Nukleinsäuren in Säugerwirte sowie andere Wirte einzuführen, sind dem Fachmann wohlbekannt und unterscheiden sich je nach verwendeter Wirtszelle.
In einer anderen Ausführungsform werden DKGR-Proteine in bakteriellen Systemen exprimiert. Dem Fachmann sind bakterielle Expressionssysteme wohlbekannt. Promotoren von Bakteriophagen können auch verwendet werden und sind dem Fachmann bekannt. Zusätzlich sind synthetische Promotoren und hybride Promotoren auch nützlich; zum Beispiel ist der tac-Promotor ein Hybrid aus den trp- und lac-Promotorsequenzen. Darüber hinaus kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs umfassen, welche die Fähigkeit haben, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und Transkription zu initiieren. Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle wünschenswert. Der Expressionsvektor kann auch eine Signalpeptidsequenz enthalten, welche die Sekretion des DKGR-Proteins in Bakterien bewirkt. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, welcher zwischen der inneren und äußeren Membran der Zellen (gram-negative Bakterien) gelegen ist, sekretiert. Der Expressionsvektor kann auch einen Epitopanhang umfassen, welcher die Affinitätsreinigung des DKGR-Proteins ermöglicht. Der bakterielle Expressionsvektor kann auch ein selektierbares Markergen umfassen, welches die Selektion von transformierten Bakterienstämmen ermöglicht. Geeignete Selektionsgene umfassen Gene, die die Bakterien resistent gegenüber Wirkstoffen wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin machen. Selektierbare Marker umfassen auch Biosynthesegene, wie jene in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegen. Diese Komponenten werden in Expressionsvektoren zusammengefügt. Expressionsvektoren für Bakterien sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans, unter anderen. Die bakteriellen Expressionsvektoren werden in bakterielle Wirtszellen transformiert unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wie Calciumchloridbehandlung, Elektroporation und anderen. Vorzugsweise werden Expressionsvektoren für Pantoea sp., wie z. B. nachstehend in den Beispielen gezeigt, verwendet.
In einer Ausführungsform werden die DKGR-Proteine in Insektenzellen produziert. Dem Fachmann sind Expressionsvektoren für die Transformation von Insektenzellen und insbesondere Baculovirus-basierte Expressionsvektoren wohlbekannt.
In einer anderen Ausführungsform werden DKGR-Proteine in Hefezellen produziert. Dem Fachmann sind Hefeexpressionssysteme wohlbekannt und umfassen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Klyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch DKGR-Proteinsequenzen zur Verfügung. Ein DKGR-Protein der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene Weise identifiziert werden. "Protein" in diesem Sinne umfaßt Proteine, Polypeptide, Enzyme und Peptide. Wie der Fachmann verstehen wird, können die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung verwendet werden, um Proteinsequenzen zu generieren. Insbesondere können Gesamtlängensequenzen und Homologe durch die Sequenzen oder Fragmente, welche hierin zur Verfügung gestellt werden, identifiziert werden. Ebenso werden natürlich vorkommende allelische Varianten der hierin zur Verfügung gestellten Sequenzen zur Verfügung gestellt.
Eine Ausführungsform von DKGR-Proteinen umfaßt auch Aminosäurevarianten der hierin bestimmten natürlich vorkommenden Sequenzen. Vorzugsweise sind die Varianten mehr als 60 oder 70% homolog zu der Wildtypsequenz, noch bevorzugter mehr als 70 oder 80%, darüber hinaus noch bevorzugter mehr als etwa 85% und am meisten bevorzugt mehr als 90%. In manchen Ausführungsformen wird die Homologie bis zu etwa 93 bis 95 oder 98% betragen. Wie für Nukleinsäuren bedeutet in diesem Zusammenhang Homologie Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität, wobei Identität bevorzugt ist. Diese Homologie wird unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken bestimmt, wie vorstehend für die Nukleinsäure-Homologien beschrieben. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können länger oder kürzer als die Wildtyp-Aminosäuresequenzen sein.
Zusätzlich können, wie vorstehend beschrieben, die DKGR-Nukleinsäuren der Erfindung verwendet werden, um zusätzliche kodierende oder nicht kodierende Regionen zu erhalten und somit im Fall von kodierenden Regionen zusätzliche Proteinsequenzen zu erhalten, unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das DKGR-Protein das DKGRc (pI-14) oder DKGRd (pI-28), wie in den 2 und 3 gezeigt. Einfachheitshalber wird hierin manchmal DKGR beispielhaft diskutiert, jedoch können in manchen Ausführungsformen, insbesondere in den hierin beschriebenen Verfahren, die hierin beschriebenen verschiedenen Ausführungsformen der DKGR-Proteine verwendet werden.
In einer Ausführungsform sind die DKGR-Proteine im Vergleich zu der Wildtypsequenz derivate oder variante DKGR-Proteine. Das heißt wie nachstehend ausführlicher beschrieben, das derivate DKGR-Peptid wird zumindest eine Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion oder Kombinationen davon enthalten, wobei Aminosäuresubstitutionen besonders bevorzugt sind. Die Aminosäuresubstitution, -insertion oder -deletion oder Kombinationen daraus können an jedem Rest innerhalb des DKGR-Peptids und/oder einem terminalen Ende des DKGR-Peptids auftreten. Üblicherweise werden diese Varianten erhalten durch ortsspezifische Mutagenese von Nukleotiden der DNA, welche das DKGR-Protein kodiert, unter Verwendung von Kassetten oder PCR-Mutagenese oder anderen dem Fachmann wohlbekannten Techniken, um DNA herzustellen, welche die Variante kodiert, und anschließend die DNA in rekombinanter Zellkultur, wie oben beschrieben, zu exprimieren. Variante DKGR-Proteinfragmente mit bis zu 100–150 Resten können jedoch durch in vitro Synthese unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden.
Aminosäuresequenzvarianten werden durch die vorherbestimmte Art der Variation gekennzeichnet, ein Merkmal, welches sie von natürlich vorkommenden allelischen- oder Interspeziesvarianten der DKGR-Protein-Aminosäuresequenz unterscheidet. Typischerweise zeigen die Varianten dieselbe qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analog, jedoch können Varianten auch ausgewählt werden, die veränderte Charakteristika haben, wie nachstehend näher beschrieben.
Während die Stelle oder Region zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, muß die Mutation selbst nicht vorherbestimmt sein. Zum Beispiel kann zufällige Mutagenese an dem Zielkodon oder der Zielregion durchgeführt werden, um das Verhalten einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, und die exprimierten DKGR-Varianten können nach der optimalen Kombination der gewünschten Aktivität gescreent werden. Techniken zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohlbekannt, zum Beispiel M13-Primer-Mutagenese und PCR-Mutagenese. Das Screening der Mutanten wird unter Verwendung von DKGR-Proteinaktivitäts-Assays durchgeführt.
Aminosäuresubstitutionen umfassen üblicherweise einzelne Reste; Insertionen umfassen üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 20 Aminosäuren, obwohl erheblich größere Insertionen toleriert werden können. Deletionen umfassen etwa 1 bis 20 Reste, obwohl in manchen Fällen Deletionen viel größer sind.
Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination davon können verwendet werden, um zu einem endgültigen Derivat zu gelangen. Im allgemeinen werden diese Veränderungen an wenigen Aminosäuren durchgeführt, um die Veränderungen des Moleküls zu minimieren. Jedoch können größere Veränderungen unter bestimmten Umständen toleriert werden. Wenn kleine Veränderungen der Eigenschaften des DKGR-Proteins gewünscht werden, werden Substitutionen im allgemeinen nach dem folgenden Schema durchgeführt:
Schema I
Erhebliche Veränderungen der Funktion oder der immunologischen Identität werden durch Auswahl von Substitutionen, welche weniger konservativ als die in Schema I gezeigten sind, durchgeführt. Zum Beispiel können Substitutionen durchgeführt werden, welche eine bedeutendere Auswirkung auf folgendes haben: die Struktur des Polypeptidrückgrads in dem Bereich der Veränderung, zum Beispiel die alpha-helikale oder beta-Faltblattstruktur; die Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle; oder die Ausdehnung der Seitenkette. Die Substitutionen, von den im allgemeinen erwartet wird, daß sie die größten Veränderungen in den Eigenschaften des Polypeptids hervorrufen, sind jene, in welchen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest ersetzt wird, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) irgendeinen anderen Rest ersetzt wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl, ersetzt wird; oder (d) ein Rest mit einer ausgedehnten Seitenkette, z. B. Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne Seitenkette, z. B. Glycin, ersetzt wird.
Die Varianten werden typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analog zeigen und werden dieselbe Immunantwort hervorrufen, obwohl auch Varianten ausgewählt werden, um die Eigenschaften des DKGR-Proteins wie benötigt zu modifizieren. Alternativ kann die Variante so gestaltet werden, dass die biologische Aktivität des DKGR-Proteins verändert ist.
Kovalente Veränderungen des DKGR-Polypeptids werden von dieser Erfindung umfaßt. Eine Art von kovalenter Modifikation umfaßt das Reagieren von Zielaminosäureresten eines DKGR-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel, welches mit ausgewählten Seitenketten oder dem N- oder C-terminalen Rest eines DKGR-Polypeptids reagieren kann. Derivatisierung mit bifunktionalen Mitteln ist zum Beispiel zum Quervernetzen von DKGR-Protein an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder Oberfläche nützlich, zur Verwendung in einem Verfahren zur Reinigung von anti-DKGR-Antikörpern oder Screeningassays, wie unten näher beschrieben. Häufig verwendete Quervernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, umfassend Dissucinimidylester wie 3,3'-Dithiobis-(succinimidylpropionat), bifunktionale Maleimide wie Bis-N-maleimido-1,8-octan und Mittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Veränderungen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den korrespondierenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppe von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), Acetylierung von N-terminalem Amin und Amidierung von einer C-terminalen Carboxylgruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des DKGR-Polypeptids, die von dieser Erfindung umfaßt wird, umfaßt Veränderung des natürlichen Glycosylierungsmusters des Polypeptids. "Veränderung des natürlichen Glycosylierungsmusters" wird hierin definiert als Deletion einer oder mehrerer Kohlenwasserstoffeinheiten, die in DKGR-Polypeptiden mit nativer Sequenz gefunden werden, und/oder Hinzufügung von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen, welche in der nativen Sequenz des DKGR-Polypeptids nicht vorhanden sind.
Hinzufügung von Glycosylierungsstellen an DKGR-Polypeptide kann durch Veränderung von deren Aminosäuresequenz erreicht werden. Diese Veränderung kann zum Beispiel durch das Hinzufügen von, oder das Ersetzen durch, ein oder mehrere Serin- oder Threoninreste zu der nativen DKGR-Polypeptidse quenz (für O-gekoppelte Glycosylierungsstellen) durchgeführt werden. Optional kann die DKGR-Aminosäuresequenz durch Veränderungen auf Ebene der DNA, insbesondere durch Mutation der das DKGR-Polypeptid kodierenden DNA an ausgewählten Basen, verändert werden, so daß Kodons generiert werden, welche in die gewünschten Aminosäuren übersetzt werden.
Eine andere Möglichkeit, die Anzahl von Kohlenwasserstoffeinheiten am DKGR-Polypeptid zu erhöhen, ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden im Stand der Technik, z. B. in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, Crit. Rev. Biochem. S. 259–306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung von Kohlenhydrateinheiten, welche auf dem DKGR-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch, oder durch die Mutationssubstitution von Kodons, welche für Aminosäurereste kodieren, die als Glycosylierungsziele dienen, bewirkt werden. Chemische Deglycosylierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) und von Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981) beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydrateinheiten auf Polypeptiden kann unter Verwendung einer Vielzahl von endo- und exo-Glycosidasen, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987) beschrieben, erreicht werden. Vorzugsweise ist das DKGR-Protein nicht glycosyliert. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform das Protein z. B. human, exprimiert in Bakterien, z. B. E. coli. Darüber hinaus kann Phosphorylierung und/oder Methylierung von hierin verwendetem DKGR sich von der in Zellen gefundenen nativen Form von DKGR unterscheiden.
Eine andere Art kovalenter Modifikation von DKGR umfaßt Koppelung des DKGR-Polypeptids an eines verschiedener Nicht-Proteinpolymere, z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyoxyalkylenen, wie in den US-Patenten 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 und 4,179,337 gezeigt.
Die DKGR-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer Ausführungsform auch so modifiziert werden, daß sie chimäre Moleküle bilden, umfassend ein DKGR-Polypeptid gekoppelt an ein anderes, heterologes Polypeptid oder Aminosäuresequenz. In einer Ausführungsform umfaßt solch ein chimäres Molekül die Koppelung eines DKGR-Polypeptids mit einem Anhangspolypeptid, welches eine Epitop zur Verfügung stellt, an welches ein anti-Anhangs-Antikörper selektiv binden kann. Bevorzugte Anhänge umfassen das myc-Epitop und 6-Histidin. Der Epitopanhang wird generell an den Amino- oder Carboxyl-Terminus des DKGR-Polypeptids plaziert. Die Anwesenheit solcher epitopmarkierter Formen des DKGR-Polypeptids können unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Anhangspolypeptid, wie weiter unten beschrieben, detektiert werden. Zurverfügungstellen eines Epitopanhangs ermöglicht auch, daß das DKGR-Polypeptid einfach durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines anti-Anhangs-Antikörpers oder einer anderen Art von Affinitätsmatrix, welche an den Epitopanhang bindet, gereinigt werden kann. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Koppelung eines DKGR-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls könnte solch eine Koppelung an den Fc-Bereich eines IgG-Moleküls erfolgen.
Unterschiedliche Anhangspolypeptide und deren jeweilige Antikörper sind dem Fachmann wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-histidin-(poly-his) oder Poly-histidin-glycin-(poly-his-gly)-anhänge; das Grippe-HA-Anhangspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159–2165 (1988)); den c-myc-Anhang und die 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 Antikörper dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5: 3610–3616 (1985)); und den Herpes Simplex Virus Glycoprotein D-(gD)-anhang und seinen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547–553 (1990)). Andere Anhangspolypeptide umfassen das Flagpeptid (Hopp et al., BioTechnology 6: 1204–1210 (1988)); das KT3 Epitoppeptid (Martin et al., Science 255: 192–194 (1992)); Tubulin-Epitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266: 15163–15166 (1991)); und den T7-Gen 10 Proteinpeptidanhang (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6393–6397 (1990)).
Von der Definition eines DKGR-Protein in einer Ausführungsform auch umfaßt sind andere Reduktaseproteine der Aldo-Keto-Reduktase-Superfamilie und DKGR-Proteine anderer Organismen, welche wie unten beschrieben kloniert und exprimiert werden. Somit können Sonden oder degenerierte Polymerasekettenreaktion (PCR)-Primersequenzen verwendet werden, um andere verwandte DKGR-Proteine des Menschen oder anderer Organismen zu finden. Wie der Fachmann erkennen wird, umfassen besonders nützliche Sonden und/oder PCR-Primersequenzen die einzigartigen Bereiche der DKGR-Nukleinsäuresequenz. Wie dem Fachmann generell bekannt, sind bevorzugte PCR-Primer etwa von 15 bis 35 Nukleotide lang, bevorzugt etwa von 20 bis 30, und können nach Bedarf Inosin enthalten. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion sind dem Fachmann bekannt.
Zusätzlich können DKGR-Proteine, wie hierin beschrieben, hergestellt werden, welche länger sind als jene in den Figuren gezeigten, zum Beispiel durch die Aufklärung zusätzlicher Sequenzen, das Hinzufügen von Epitop oder Reinigungsanhängen, die Hinzufügung weiterer Fusionssequenzen etc.
DKGR-Proteine können auch dadurch identifiziert werden, daß sie durch DKGR-Nukleinsäuren kodiert werden. Somit werden in einer Ausführungsform DKGR-Proteine durch Nukleinsäuren kodiert, welche an die in den Nukleinsäureabbildungen gezeigten Sequenzen oder deren Komplemente hybridisieren, oder solche mit Homologie zu oder der Aktivität von anderen DKGR-Proteinen wie hierin beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das DKGR-Protein nach Expression gereinigt oder isoliert. Die DKGR-Proteine können auf verschiedene dem Fachmann bekannte Arten gereinigt oder isoliert werden, abhängig davon, welche anderen Komponenten in der Probe vorhanden sind. Standardreinigungsmethoden umfassen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Techniken, umfassend Ionenaustausch-, hydrophobe-, Affinitäts- und HPLC-Chromatographie und Chromatofokussierung. Zum Beispiel kann das DKGR-Protein unter Verwendung einer Standard-Affinitätschromatographie gereinigt werden, gefolgt von Ionenaustauschchromatographie.
Ultrafiltrations- und Diafiltrationstechniken in Verbindung mit Proteinkonzentration sind auch nützlich. Für allgemeine Anweisungen zu geeigneten Reinigungstechniken siehe R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982). Der nötige Reinigungsgrad wird von der Verwendung des DKGR-Proteins abhängig variieren. Unter bestimmten Umständen wird keine Reinigung nötig sein.
Die Ausdrücke "isoliert", "gereinigt" oder "biologisch rein" beziehen sich auf Material, welches im Wesentlichen oder weitestgehend frei von Komponenten ist, welche es normalerweise im nativen Zustand begleiten. Reinheit und Homogenität werden typischerweise unter Verwendung von Verfahren der analytischen Chemie bestimmt, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Ein Protein, welches in einer Präparation die prädominante Spezies ist, ist im wesentlichen gereinigt. Der Begriff "gereinigt" bezeichnet, daß eine Nukleinsäure oder ein Protein im wesentlichen eine Bande auf einem Elektrophoresegel hervorbringen. Insbesondere bedeutet es, daß die Nukleinsäure oder das Protein zumindest 85% rein, bevorzugter zumindest 95% rein und am meisten bevorzugt zumindest 99% rein ist. In einer bevorzugten Ausführungsform gilt ein Protein als rein, wenn bestimmt wurde, daß keine kontaminierende Aktivität vorliegt.
Einmal exprimiert und wenn nötig gereinigt, sind die DKGR-Proteine und Nukleinsäuren in einer Anzahl von Anwendungen nützlich. Zum Beispiel können DKGR-Nukleinsäuren sequenziert werden und positionsspezifischer Mutagenese unterworfen werden, um modifizierte DKG-Reduktasen zu entwickeln mit gewünschten Eigenschaften, welche in den Wildtyp-Proteinen fehlen oder weniger ausgeprägt sind, wie Hitzestabilität, Lösungsmitteltolerenz, NADH-abhängige Aktivität und ein unterschiedliches pH-Optimum.
Die DKGR-Nukleinsäuren und Proteine dieser Erfindung können zu jedem Zweck eingesetzt werden, in dem DKGR-Enzymaktivität notwendig oder gewünscht ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden DKGR-Nukleinsäuren und Proteine verwendet, um Enzyme herzustellen, die in industriellen Prozessen nützlich sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden DKGR-Nukleinsäuren und Proteine verwendet, um Enzyme herzustellen, welche kommerziell verwendet werden können, um Glucose in Vitamin C in einem einzigen Organismus umzuwandeln. In diesem Verfahren wird ein Stamm, der in der Lage ist, Glucose zu 2,5-Diketo-D-gluconsäure durch eine endogene Oxidase umzuwandeln, gentechnisch verändert, um eine DKG-Reduktase zu exprimieren, welche unter Verwendung einer der Methoden der vorliegenden Erfindung erhalten wurde. Der Stamm hat eine Quelle für Glucose oder zur Herstellung von Glucose oder es wird eine solche zur Verfügung gestellt. Der erhaltene rekombinante Stamm wandelt dann Glucose zu 2-Keto-L-gulonsäure in einem einzigen Fermentationsschritt um.
In einer Ausführungsform wird ein Mikroorganismus zur Verfügung gestellt, welcher imstande ist, direkt 2-Keto-L-gulonat aus D-Glucose herzustellen. In einer Ausführungsform wird das Gulonat anschließend in Vitamin C umgewandelt.
Die DKGR-Proteine, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu produzieren. Diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein.
In einer Ausführungsform umfaßt der Begriff "Antikörper" Antikörperfragmente, die dem Fachmann bekannt sind, umfassend Fab, Fab₂, Einzelketten-Antikörper (z. B. Fv), chimäre Antikörper etc., hergestellt entweder durch die Modifikation der gesamten Antikörper oder jener, die de novo unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie synthetisiert wurden.
Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säuger erzeugt werden, z. B. durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Agens und, falls gewünscht, einem Adjuvans. Typischerweise wird das immunisierende Agens und/oder Adjuvans in den Säuger durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert werden. Das immunisierende Agens kann das DKGR-Protein, Fragmente davon oder ein Fusionsprotein davon enthalten. Es kann nützlich sein, das immunisierende Agens an ein Protein zu koppeln, das bekannterweise in dem zu immunisierenden Säuger immunogen ist. Beispiele solcher immunogenen Proteine umfassen Keyhole Limpet Hämocyanin, Serumalbumin, bovines Thyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen Freund's komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryllipid a, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungprotokoll kann vom Fachmann ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand ausgewählt werden.
Alternativ können die Antikörper monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden, wie jene beschrieben von Kohler und Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Agens immunisiert, um Lymphozyten zu erzeugen, welche Antikörper herstellen, die spezifisch an das immunisierende Agens binden, oder in der Lage sind jene herzustellen. Alternativ können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Das immunisierende Agens wird typischerweise das DKGR-Polypeptid oder ein Fragment davon oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Im allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten ("PBLs") verwendet, wenn Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht werden, oder Milz- oder Lymphknotenzellen, wenn nicht-menschliche Säugerquellen gewünscht werden. Die Lymphozyten werden dann mit einer immortalisierten Zellinie fusioniert unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie Polyethylenglycol, um eine Hybridomzelle zu bilden (Godin, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103). Immortalisierte Zellinien sind typischerweise transformierte Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagern, Rind und Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mäuse-Myelomzellinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, welches vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, welche das Wachstum oder das Überleben der nicht fusionierten, immortalisierten Zellen inhibieren. Zum Beispiel wird das Kulturmedium für die Hybridomas typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium") enthalten, wenn den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, Substanzen, welche das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
Gegen DKGR-Proteine der vorliegenden Erfindung generierte Antikörper können im Screening nach ähnlichern Enzymen aus anderen Organismen und Proben verwendet werden. Antikörper können auch als Proben verwendet werden, um Genbibliotheken zu screenen, um DKG-Reduktasen oder kreuzreaktive Aktivitäten zu identifizieren.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Verwendung der oben beschriebenen Erfindung genauer zu beschrieben, sowie dazu, die als am besten betrachteten Arten zur Durchführung verschiedener Aspekte der Erfindung darzustellen. Diese Beispiele limitieren in keiner weise den wahren Umfang dieser Erfindung, sondern werden stattdessen zu Illustrationszwecken präsentiert.
Beispiele
Beispiel 1
Isolierung von Umwelt-2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen, DKGRc und DKGRd
Materialien und Methoden
Extraktion und Reinigung von DNA aus Boden- und Wassersedimentproben wurde wie vorbeschrieben durchgeführt (Eschenfeldt et al., Isolation of a full-length hsp60 gene from environmental DNA by polymerase chain reaction (2000)). Wasser- und Bodenproben wurden im Sommer 1996 aus einem Teich, einem Laubwald und nahe der Basis eines kultivierten Berberitzenstrauchs in der Nähe des Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois, gesammelt.
Teichwasser wurde in Plastikflaschen gesammelt, und das suspendierte Material wurde entweder durch Durchflußzentrifugation (Sharples, Modell A5-16) oder bei kleinen Volumina durch Filtration durch 0,22 μm Nitrocellulosefilter konzentriert. Die DNA wurde aus den Konzentraten unter Verwendung kommerzieller genomischer DNA-Extraktionskits (Puregene) nach der vom Hersteller beschriebenen Methode extrahiert.
Bodenproben wurden nach Entfernung von Oberflächendebris und dem Wegkratzen von etwa 3 cm Oberboden gesammelt. Proben von 3 bis 6 cm unter der Oberfläche wurden in sterile verschließbare Plastikbeutel gegeben, ins Labor gebracht und bei 4°C bis zur DNA-Extraktion gelagert. Das Extraktionsverfahren war im wesentlichen wie beschrieben von S. Selenska und W. Klingmüller, Lett. Appl. Microbiol. 13(1): 21–24 (1991). 2 g (Naßgewicht) Boden wurden in 4 ml Extraktionspuffer (120 mM Na₂HPO₄ (pH 8,0) und 1% Natriumdodecylsulfat) suspendiert. Die Suspension wurde bei 200 Upm für 1 h bei 70°C in einem New-Brunswick-Schüttelinkubator geschüttelt und dann bei 3.000 × g für 5 min. bei Raumtemperatur in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der DNA enthaltende Überstand wurde gesammelt und das Bodenpellet wurde zwei weitere Male extrahiert durch Resuspension in 2 ml Extraktionspuffer, Schütteln für 20 min. bei 70°C und Zentrifugation wie zuvor. Die kombinierten Überstände wurden bei 20.000 × g für 10 min. bei Raumtemperatur zentrifugiert, um verbliebene Partikel zu entfernen. Diese Proben wurden bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
Die humösen Substanzen wurden aus den Bodenextrakten durch Größenexklusions-Chromatographie (Sepharose CL-4B), gefolgt von Ionenaustausch-Chromatographie (Tip 500G; Qiagen) entfernt. Für die Sepharosetrennung wurden 150 μl Glycerol zu 1,4 ml des Boden-DNA-Extrakts zugesetzt, und die Probe wurde auf die Oberfläche einer 1,0 × 20 cm CL-4B-Säule, in 10 mM Tris (7,5), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl (TEN) äquilibriert, aufgetragen. Die Totvolumenfraktionen, welche die DNA enthalten, wurden gepoolt und mit Ethanol präzipitiert. (Die Säule konnte durch gründliches Waschen mit TEN-Puffer wiederverwendet werden.) Präzipitierte DNA wurde in 10 mM Tris (pH 8,4) aufgelöst und NaCl wurde zu einer Endkonzentration von 0,75 M beigefügt. Die DNA wurde unter Verwendung einer Qiagen-Tip-500G-Säule nach den Anweisungen des Herstellers weiter gereinigt. Die Isopropanol-präzipitierte DNA, welche von der Tip-500G-Säule gewonnen wurde, wurde in 500 μl 10 mM Tris (pH 8,0) aufgelöst, die Konzentration durch Absorption bei 260 nm bestimmt und bei –20°C gelagert.
Interne Genfragmente wurden unter Verwendung von degenerierten Primern amplifiziert. Degenerierte Primer wurden basierend auf dem Sequenzvergleich der zwei bekannten 2,5 DKG-Reduktasegene aus Corynebacterium [Genbank Accession M12799 (Anderson et al., Science 230: 144–149 (1985)) und M21193 (Grindley et al., Appl. Environ. Microbiol. 54(7): 1770–1775 (1988))] und dem nahe verwandt erscheinenden Morphindehydrogenasegen aus Pseudomonas putida [GB: M94775 (Willey et al., Biochem. J. 290(Pt2): 539–544 (1993)] entworfen. Die Aminosäuresequenzen dieser drei Gene wurden unter Verwendung des Clustal-Verfahrens (Megalign-Programm, DNA Star) ausgerichtet. Zwei Primer mit 20 Nukleotiden wurden basierend auf Regionen mit Identität oder starker Ähnlichkeit über zumindest sieben Aminosäuren entworfen. Die Primer wurden auf Haarnadel- oder Duplexbildung, vorhergesagte Schmelztemperatur und freie Assoziationsenergie mit dem Oligo-5-Programm (National Biosciences, Inc.) analysiert. Die zwei Oligonukleotide, als DU1 und DL1 bezeichnet, wurden von der HHMI/Keck Oligonukleotid-Syntheseeinrichtung, Yale University, synthetisiert.
Optimale Bedingungen für PCR mit den degenerierten Primern wurden unter Verwendung des Plasmids ptrp1-35a (Anderson et al., Science 230: 144–149 (1985)), welches das Corynebacterium 2,5 DKGa-Reduktasegen enthält, bestimmt. Falls nicht anders angeführt, enthielten alle PCR-Reaktionen (50 μl Reaktionsvolumen) 1 × Mg-freien Puffer, 200 μM von jedem der vier dNTPS, 2,5 mM MgCl₂, 2 μM von jedem der degenerierten Primer, 1,5 Einheiten Taq-Polymerase (Promega) und 25–100 ng Umwelt-DNA, hergestellt wie zuvor beschrieben. PCR-Bedingungen begannen mit 94°C (1 min.), gefolgt von 40 Zyklen von 94°C (30 sek.), 58°C (45 sek.) und 72°C (1 min.), und endeten mit einer Inkubation bei 72°C für 60 min. PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in einem 1%igen Agrarosegel wie anderweitig beschrieben analysiert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)).
Das PCR-Produkt wurde durch Elektrophorese in 1,0%igen Agarosegelen in TBE-Puffer gereinigt. Die Bande von Interesse wurde aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wurde mit dem QiaQuick-Gel-Reinigungskit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die gereinigte DNA wurde in den Vektor pBluescript SK+ (Stratagene) ligiert, welcher mit EcoRV (Promega) verdaut wurde und ein einzelner T-Rest an den 3'-Enden durch Tailing mit dTTP und Taq-Polymerase wurde hinzugefügt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York (1988)). T4-DNA-Ligase und 10× Puffer von Promega wurden nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Ligierte DNA wurde in Escherichia coli DH5α (MaxEfficiency, GIBCO/BRL) nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. E. coli wurde auf LB-Agarplatten kultiviert, welche Ampicillin, IPTG und Xgal enthielten (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Unter Verwendung von PCR wurden weiße Kolonien auf Vektoren, welche DNA-Inserts mit den erwarteten Größen enthielten, analysiert. Die T3- und T7-Promotorregionen des Vektors wurden für Primer verwendet, und die PCR wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Plasmidklone wurden unter Verwendung des ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) in einem Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 Thermocycler unter Verwendung von T3- und T7-Promotorprimern sequenziert. Alle Konzentrationen von Komponenten, Inkubations- und Zyklenbedingungen folgten den Anweisungen des Herstellers. Proben wurden auf einem 6% Acrylamidgel, welches 8 M Harnstoff enthielt, in einem Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzer (Perkin-Elmer Applied Biosystems) nach den Anleitungen des Herstellers aufgetrennt. Sequenzen wurden unter Verwendung des Seqman-Programms (DNA Star) analysiert.
Die flankierenden Regionen der Gene wurden wie folgt amplifiziert. Die Nukleotidsequenzen der klonierten Umwelt-PCR-Fragmente wurden unter Verwendung des Megalign-Programms von DNA Star ausgerichtet. Potentielle klonspezifische Primer wurden aus Bereichen mit der geringsten Sequenzhomologie ausgewählt. Primerschmelztemperatur, freie Assoziationsenergie, Duplexbildung und vorhergesagtes Verhalten in einer PCR-Reaktion wurden unter Verwendung des Oligo-5-Programms (National Biosciences, Inc.) untersucht. Unter Verwendung des spezifischen Klons als Vorlage wurden optimale Bedingungen für jedes Primerset experimentell bestimmt. Spezifität der Primer wurde durch Testen jedes Primersets mit jedem der Umweltklone als Vorlage bestimmt. Ein Primerpaar galt als spezifisch, wenn es die erwartete Bande nur mit seiner spezifischen Vorlage bildete. Die Sequenzen der klonspezifischen Primer für die beiden 2,5 DKG-Reduktase verwandten Klone, welche für weitere Studien ausgewählt wurden (pI-14 und pI-28) werden in Tabelle 1 gezeigt. Fortlaufende DNA aus den 5'- und 3'-flankierenden Regionen wurde durch Restriktionsstellen-PCR erhalten.
Tabelle 1 PCR-Primersequenzen
Primer für Restriktionsstellen-PCR (RS-PCR) (Sarkar et al., PCR Methods Appl. 2(4): 318–322 (1993)) wurden von der HHMI/Keck-Oligonukleotid-Syntheseeinrichtung, Yale University, synthetisiert. Primer hatten die generelle Struktur N₁₀GAATTC, wobei die ersten 10 Positionen komplett degeneriert sind und die letzten sechs eine Restriktionsstelle, in dem Beispiel EcoRI, festlegen. Nco I, Pvu II, Xho I, Bgl I und Hind III Primer wurden auch verwendet. Eine Serie von drei halbgenesteten PCR-Reaktionen wurde durchgeführt. Für die 3'-flankierende Region verwendete die erste Reaktion einen der RS-PCR-Primer und den geeigneten spezifischen Primer U1 mit 20 μM, 100 ng von Umwelt-DNA und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (Promega). Proben wurden bei 94°C für 1 min. denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C (30 sek.), 50°C (1 min.) und 72°C (2 min.), mit einer letzten Inkubation bei 72°C für 15 min. Runden zwei und drei waren identisch, außer daß 1 μl der PCR-Reaktion der Runde davor als Vorlage verwendet wurde, und die spezifischen Primer U2 und U3 in Runden 2 bzw. 3 verwendet wurden. Aliquots jeder Reaktion wurden durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel analysiert. Kandidatenbanden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, aufgereinigt und direkt unter Verwendung von klonspezifischen Primern sequenziert. Um die 5'-flankierenden Regionen zu erhalten, wurden die geeigneten klonspezifischen Primer L1–L3 verwendet.
Gesamtlängenkopien der pI-14 und pI-28 Gene wurden aus Teichwassersediment-DNA durch PCR mit Primern, welche für die 5'- und 3'-nichtkodie renden Regionen jedes Gens spezifisch waren (14U6, 14L6; 28U5, 28L7; siehe Tabelle 1) hergestellt. Bedingungen waren ähnlich wie jene, die für die degenerierten Primer verwendeten. Reaktionsbedingungen wichen von den Standardbedingungen nur in der Verwendung von 1,5 mM MgCl₂ ab. Proben wurden bei 94°C für 1 min. denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C (30 sek.), 58°C (45 sek.) und 72°C (2 min.), mit einer letzten Inkubation bei 72°C für 15 min.
Adaptorprimer, welche eine Mun I Schnittstelle direkt upstream des Anfangskodons und eine Hind III Schnittstelle direkt downstream des Endkodons jedes Gens generieren würden, wurden entworfen (14expU, 14expL; 28expU, 28expL; siehe Tabelle 1). Die Gesamtlängen-PCR-Produkte aus der direkten Amplifikation wurden als Vorlage verwendet, und die Reaktionsbedingungen waren identisch zu den oben beschriebenen. Die Produkte dieser Reaktionen wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, mit Mun I und Hind III verdaut und in den Expressionsvektor pJF118EH ligiert (Fürste et al., Gene 48(1): 119–131 (1986)), welcher mit EcoR I und Hind III verdaut worden war. Die ligierte DNA wurde in E. coli DH5α oder JM109 transformiert und wie oben beschrieben gescreent.
Ergebnisse
Die degenerierten Primer DU1 und DL1 zielen auf hochkonservierte interne Regionen der Aminosäuresequenz von bakteriellen DKGRs. Unter Verwendung eines Plasmids, welches als Vorlage das Corynebacterium DKGRa-Gen enthält, wurde in einer Kontrollreaktion eine gut definierte Bande des erwarteten 380 bp Produkts erhalten. Wenn verschiedene Umwelt-DNA-Extrakte als Vorlage verwendet wurden, zeigte Agarosegelelektrophorese breite Banden zwischen 350 und 400 bp Größe. Die Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, in den Vektor pBluescript SK+ (Promega) ligiert und in E. coli DH5α transformiert. Insgesamt sechs Klone, welche Inserts von etwa 350–400 bp enthielten, wurden für weitere Studien isoliert (Tabelle 2). Sequenzierung zeigte, daß alle sechs Klone voneinander unterschiedlich waren. Eine BLASTX-Suche (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402 (1997)) der Genbank-Datenbank zeigte, daß alle sechs Mitglieder der Aldo-Keto-Reduktase-Genfamilie waren, und keiner zu einer Sequenz in den öffentlichen Datenbanken identisch war. Ausrichtung der Nukleotidsequenzen der Klone (1) zeigte, daß zwei, pI-14 und pI-28, 79% Nukleotidsequenzidentität (ohne die Primersequenzen) aufwiesen. Diese Klone besitzen 46–48% Aminosäuresequenzidentität mit dem Corynebacterium DKGRa-Gen [GB accession M12799 (Anderson et al., Science 230: 144–149 (1985))). Diese beiden Klone wurden für weitere Studien ausgewählt.
Tabelle 2 Klonierte PCR-Fragmente
Die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen der Klone pI-14 und pI-28 wurden durch Restriktionsstellen-PCR (RSPCR) erhalten (Sarkar et al., PCR Methods Appl. 2(4): 318–322 (1993)). Genestete, klonspezifische Primer (Tabelle 1) wurden für sowohl pI-14 als auch pI-28 entworfen und mit mehreren unterschiedlichen RSPCR-Primern verwendet. Unter Verwendung von Umwelt-DNA als Vorlage generierte die anfängliche Amplifikation eine diffuse Schliere von Produkten mit wenigen, schwach unterscheidbaren Banden. Nachfolgende PCR-Runden verwendeten das Produkt der vorhergehenden Reaktion als Vorlage, dieselben RSPCR-Primer und ein downstream nested Primer. Mit jeder Runde wurden zunehmend diskrete Produkte generiert. Nach drei oder vier Runden wurden diskrete Produkte in guter Ausbeute gebildet. Für die 3'-flankierende Region wurde ein etwa 800 bp Fragment mit dem Xho I RSPCR-Primer für sowohl den pI-14 als auch pI-28 Klon generiert. Ein etwa 500 by Fragment der 5'-flankierenden Sequenz wurde für jeden Klon unter Verwendung des Bgl I RSPCR-Primers generiert. Sequenzierung des Endprodukts bestätigte, daß die flankierenden Regionen mit der Sequenz der Originalklone überlappte. Vermutlich komplette Nukleotidsequenzen der I-14 und I-28 Gene wurden aus den überlappenden Fragmenten konstruiert (2). Es wird vorausgesagt, daß das vermutliche DKG-Reduktasegen in Klon pI-14 an dem GTG-Kodon bei Position 312 beginnt. In Klon pI-28 beginnt das vermutliche Gen an dem ATG-Kodon bei Position 94. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der vorhergesagten Reduktasen waren zu jener des Corynebacterium sps.DKGRa homolog.
Partielle offene Leseraster wurde upstream und downstream der Reduktasegene gefunden. Ein upstream vermutlicher offener Leseraster (orf1) beginnt jenseits der Spanne des amplifizierten Fragments und überspannt 104 Aminosäuren im pI-14 Klon. Das Endkodon des orf1 überlappt das vermutliche GTG-Startkodon des DKGR-Gens. Die pI-28 Sequenz enthält die letzten 29 Aminosäuren von orf1, wovon 27 identisch zu der pI-14 Sequenz sind. Eine BLASTP-Suche der Genbank-Datenbank mit der pI-14 orf1 Aminosäuresequenz ergab nur wenige Treffer. Die beste Übereinstimmung war ein hypothetischer E. coli offener Leseraster [ACC74333 (Blattner et al., Science 277(5331): 1453–1474 (1997))] mit einer Identität von 32% über 103 Aminosäuren. Ein zweiter potentieller offener Leseraster (orf2) beginnt in beiden Klonen an einem Methioninrest direkt hinter dem Reduktaseendkodon und reicht bis jenseits der Spanne des Klons. Die orf2 Sequenzen sind über 86 Aminosäurereste 88% identisch zueinander. Eine BLASTP-Suche der Sequenzen ergab eine beste Übereinstimmung mit einem hypothetischen Protein aus Streptomyces coelicolor [CAB51274 (Redenbach et al., Mol. Microbiol. 21(1): 77–96 (1996))] mit einer Identität von 45% über eine Spanne von 85 Aminosäuren.
Um zu etablieren, daß die zusammengefügten pI-14 und pI-28 Gene wahrhaftig in der Umwelt vorhanden sind und nicht ein Chimär aus mehreren homologen Genen sind, wurden spezifische Primer für die 5'- und 3'-nichtkodierenden Regionen jedes Klons entworfen (Tabelle 1). Direkte Amplifikation mit diesen Primern unter Verwendung der originalen Umwelt-DNA als Vorlage generierte Produkte der vorhergesagten Größe in einer einzigen PCR-Reaktion. Sequenzierung dieser Banden bestätigte ihre Identität als pI-14 und pI-28.
Um die Expression der amplifizierten Gene zu ermöglichen, wurden die kodierenden Sequenzen in den Expressionsvektor pJH118EH kloniert (Fürste et al., Gene 48(1): 119–131 (1986)). Adaptorenprimer wurden für die Klone pI-14 und pI-28 synthetisiert (Tabelle 1). Da die Sequenzen darauf hindeuteten, daß beide Gene eine interne EcoR2-Schnittstelle hatten, fügten die Vorwärtsprimer (14expU und 28expU) eine Mun I Schnittstelle direkt upstream des Anfangskodons hinzu. Für pI-14 änderte der Vorwärtsprimer auch das 'GTG'-Anfangskodon zu ATG. Die Rückwärtsprimer für beide Klone (14expL, 28expL) fügten ein zweites Stopkodon im Leseraster direkt benachbart zu dem bestehenden Stopkodon hinzu, zusammen mit einer Hind III Schnittstelle. Die Gesamtlängen-PCR-Produkte, die aus Umwelt-DNA generiert wurden, wurden als Vorlagen verwendet. Die Produkte dieser zwei Reaktionen wurden in den Expressionsvektor pJF118EH kloniert und in E. coli transformiert. Klone mit der erwarteten Insertgröße wurden identifiziert, und ein Klon für jedes Gen (als pI-14 bzw. pI-28 bezeichnet) wurde für weitere Studien ausgewählt.
Die Sequenzen beider Klone wurden bestimmt und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 8 bzw. 10) wurden verglichen (3). Die zwei Klone hatten eine Gesamt-Aminosäuresequenzidentität von 82,5%. Es sollte erwähnt werden, daß keine der exprimierten Klonsequenzen identisch zu den originalen Klonen, erhalten als RSPCR-Produkte, war. Die Aminosäuresequenz von Klon pI-14 unterschied sich um 4% und von Klon pI-28 um 1% von ihren vorhergesagten Sequenzen. Derartige Unterschiede können möglicherweise auf die große Anzahl von PCR-Zyklen, die verwendet wurden um die originalen Klone herzustellen, zurückgeführt werden.
Eine Suche (BLASTP) der Genbank-Datenbank nach Homologen der pI-14 und pI-28 Aminosäuresequenzen deutete an, daß beide Sequenzen am nächsten verwandt zu einem vermutlichen Oxidoreduktasegen aus Streptomyces coelicolor [CAA22355 (Redenbach et al., Mol. Microbiol. 21(1): 77–96 (1996))] sind. Die Homologie beträgt 47% Identität für PI-14 und 48% Identität für PI-28. Beide Sequenzen sind auch zu dem DKGR von Corynebacterium spp mit 41% bzw. 42% Identität homolog.
Beispiel 2
Reinigung von Umwelt-2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen, DKGRc und DKGRd
Materialien und Methoden
Gesamtlängen-Umwelt-2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen, DKGRc und DKGRd wurden durch Induktion von E. coli-Kulturen, welche die Expressionsplamide pI-14 oder pI-28 enthielten, produziert. Kulturen von E. coli DH5α, welche pI-14 enthielten, wurden aerobisch bei 37°C in 500 ml Luria-Medium in einem gekerbten 1 l Erlenmeyer-Kolben kultiviert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Kulturen von E. coli JM109, welche das Plasmid pI-28 enthielten, wurden unter denselben Bedingungen aber bei 30°C kultiviert. Beide Kulturen wurden mit 250 Upm bewegt. Sobald die OD₆₀₀ der Kulturen 0,3–0,5 erreichte, wurde Expression mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, U.S. Biochemicals) induziert. Die Zellen wurden nach 4 h (37°C Experimente) oder nach Wachstum über Nacht (30°C Experiment) geerntet, einmal mit TE-Puffer gewaschen und bei –70°C gelagert. Bestandteile der Medien wurden von Fisher gekauft.
In Routineenzymassays wurde feste 2,5-Diketo-D-gluconsäure (DKG), geliefert von Genencor International, als Substrat verwendet. Für kinetische Analysen und für die Präparation des Reaktionsprodukts wurde DKG durch die Oxidation von Glucose durch permeabilisierte Zellen von Pantoea citrea hergestellt und entweder ohne Reinigung zur festen Form oder mit sorgfältiger Trocknung zur Verhinderung von Hydration des festen Produkts verwendet. P. citrea war von Genencor International. Alle anderen Chemikalien waren von Sigma.
P. citrea wurde über Nacht in 50 ml Luria-Medium, welches 20 mM Glucose enthielt, bei 28°C in einem gekerbten 250 ml Kolben bei 250 Upm kultiviert. Ein zusätzliches Aliquot von 10 ml Luria-Medium, welches 100 mM Glucose enthielt, wurde zu der Kultur hinzugefügt, und die Kultur wurde eine weitere Stunde bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 6.000 Upm (3.600 × g) bei 20°C für 10 min. geerntet. Die Zellen wurden in 6 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers, pH 7,2, welcher 5 mM MgCl₂ enthielt, resuspendiert und in einen 125 ml Erlenmeyer-Kolben mit Stöpsel überführt. Die Konzentration der Zellen wurde auf eine finale OD₆₀₀ von 10–20 OD-Einheiten/ml eingestellt. Die Zellen wurden durch Zugeben von 50 μl einer Lösung von Toluol : Aceton (1 : 9) pro ml Zellen permeabilisiert, und 1 min. gevortext. Um 2,5-Diketo-D-gluconsäure herzustellen, wurde Glucose zu den permeabilisierten Zellen mit einer Endkonzentration von 50 mM hinzugefügt, und die Zellen wurden bei 28°C für 4–6 h mit Bewegung bei 250 Upm inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3.600 × g für 10 min. entfernt und der Überstand, der 2,5-Diketo-D-gluconsäure enthielt, wurde durch einen 0,2 μm Filter filtriert, um jeglichen Zelldebris zu entfernen. Die Konzentration von 2,5-Diketo-D-gluconsäure wurde enzymatisch bestimmt unter Verwendung von gereinigter 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase. 1 ml Aliquots wurden zur Langzeitlagerung auf –80°C gebracht.
Die 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen wurden durch Resuspendieren von Zellpellets in ungefähr 2 Volumen von 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, enthaltend 1 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol und 0,001% Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), gereinigt. Die Zellen wurden lysiert, indem die Suspension zweimal durch eine "French press" gedrückt wurde. Zelldebris und Membranen wurden durch Zentrifugation bei 950 × g entfernt, gefolgt durch Ultrazentrifugation bei 435.000 × g in einer Beckman-TL-100-Ultrazentrifuge. Beide Reduktasen wurden durch Affinitätschromatographie auf Matrix Red A Gel (Amicon) gereinigt, gefolgt von Ionenaustausch auf einer MonoQ-Säule (Pharmacia).
Eine 2 × 8 cm Säule der Active Red Matrix wurde unter Verwendung eines Fast Protein Liquid Chromatography-Systems (Pharmacia Biotech) geladen und eluiert. Die Säule wurde mit 10 mM Tris/HCl, pH 7,2, enthaltend 0,5 mM EDTA und 0,5 mM DTT, äquilibriert. Für die c-Form wurden ungefähr 5 ml des ultrazentrifugierten Extrakts mit einer Flußrate von 0,5 ml/min. auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 40 ml Äquilibrierungspuffer bei einer Flußrate von 2 ml/min. gewaschen, dann schrittweise eluiert, zunächst mit 40 ml Äquilibrierungspuffer enthaltend 1,5 M NaCl, gefolgt von Puffer enthaltend 2,5 M NaCl. Die c-Form-Reduktase eluierte in dem 2,5 M NaCl Waschschritt.
Für die d-Form-Reduktase wurde dieses Verfahren wie folgt modifiziert. Nachdem das Enzym geladen wurde, wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer wie oben beschrieben gewaschen. Das Enzym wurde dann mit einem 100 ml linearen Gradienten von 0–1,5 M NaCl Äquilibrierungspuffer eluiert. Das Enzym eluierte bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,6 M. In beiden Reinigungen wurden die Fraktionen, welche 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktaseaktivität enthielten, gepoolt und gegen einen Puffer ohne Salz dialysiert.
Die gepoolten, dialysierten Fraktionen wurden auf eine MonoQ HR 10/10 Säule unter Verwendung eines Superloops geladen. Die c-Reduktase wurde unter Verwendung eines 2,5%/min. linearen Gradienten von 0–1,0 M NaCl in 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,5 mM DTT, eluiert. Reinigung der d-Reduktase benötigte zwei MonoQ Schritte, durchgeführt bei pH 7,5 und pH 8,0. Das Enzym wurde von der ersten Säule mit einem 1%/min. linearen Gradienten von 0–1,0 M NaCl in 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,5 mM DTT, eluiert. Fraktionen, welche Reduktaseaktivität enthielten, wurden gepoolt, über Nacht gegen 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5 mM DTT, dialysiert und auf die MonoQ-Säule geladen, welche zuvor mit demselben pH 8,0 Puffer äquilibriert worden war. Das Enzym wurde mit einem 1,25%/min. linearen Gradienten von 0–1,0 M NaCl in 0,1 M Tris, pH 8,0, enthaltend 0,5 mM DTT, eluiert. In jedem Fall eluierte die 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase als ein scharfer Peak (A280) gegen Ende des Gradienten. Die Reinheit wurde durch denaturierende Gelelektrophorese überprüft (Laemmli, Nature 227(259): 680–685 (1970)).
Ergebnisse
DKGRc, welche stärker überexprimiert war, wurde schnell in zwei Schritten bis zur Homogenität gereinigt. Diese Reduktase band fest an die Affinitätssäule und wurde durch die schrittweise Erhöhung der NaCl-Konzentration eluiert. Die mit 2,5 M NaCl eluierte Reduktase ergab ausreichend reines Material zur Reinigung bis zur Homogenität in einem einzigen Ionenaustauschschritt. Nach Dialyse um das Salz zu entfernen wurden die gepoolten aktiven Fraktionen zur anscheinenden Homogenität auf einer MonoQ-Säule gereinigt, eluiert mit sequentiellen linearen Gradienten zunächst bestehend aus einem 2%/min. Gradienten bis zu einem Puffer enthaltend 0,3 M NaCl, gefolgt von einem steilen Gradienten mit 0,5 M NaCl. Das Enzym eluierte als ein scharfer, symmetrischer, wohlgetrennter Peak bei ungefähr 0,4 M NaCl.
DKGRd war nicht so stark überexprimiert, band weniger fest an die Matrix Red Agarose und MonoQ-Harze. DKRGd wurde von der Matrix Red Agarosesäule mit einem 100 ml linearen Gradienten von 0–1,5 M NaCl eluiert. Gelelektrophoreseanalyse zeigte, daß mehrere zelluläre Proteine mit der Reduktase bei dieser Salzkonzentration coeluierten. Fraktionierung dieses Materials auf einer MonoQ-Säule hatte keinen Erfolg dabei, die Reduktase von einer der hauptsächlichen zellulären Kontaminanten zu trennen. Eine zweite MonoQ-Säule wurde bei pH 8,0 unter Verwendung eines flachen Salzkonzentrationsgradienten in dem Bereich, in dem die Reduktase eluierte, durchgeführt. Das resultierende Protein war frei von größeren Kontaminanten und wurde durch Densitrometrie auf eine Reinheit von mehr als 97% geschätzt. Gereinigte DKGRc und DKGRd hatten ein anscheinendes natives Molekulargewicht von 30 bzw. 31 kD. Die beobachteten Molekulargewichte entsprachen in etwa den nach den Gensequenzen vorhergesagten von 29.687 bzw. 33.798 Dalton.
Beispiel 3
Charakterisierung von Umweltreduktasen
Materialien und Methoden
Das Produkt der Reduktion von 2,5-DKG durch die gereinigten Enzyme wurde durch Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GCMS) bestimmt. Zunächst wurde eine hoch konzentrierte Präparation von 2,5-Diketo-D-gluconsäure aus permeabilisierten Zellen hergestellt. Die Zellen wurden kultivierten und permeabilisiert wie oben beschrieben. Die behandelten Zellen (50 ml in einem 250 ml gekerbten Kolben) wurden mit 50 mM Glucose für 6 h bei 28°C und 250 Upm inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde durch einen 0,22 μm Filter filtriert, um alle lebensfähigen Zellen zu entfernen. Die Konzentration von 2,5-DKG wurde enzymatisch als 32 mM bestimmt. Zur Umwandlung in ein Produkt wurde die Präparation verdünnt, um 1 ml einer Lösung zu ergeben, welche 10 μmol Substrat in 65 mM Bis/Tris-Puffer bei pH 7,0 enthielt. 5 μmol NADPH wurden beigefügt und die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 40 Einheiten gereinigter DKGRc oder 52 Einheiten gereinigter DKGRd initiiert. Der Fortschritt der Reaktionen wurde durch Bestimmung der Konzentration des verbleibenden NADPHs überwacht; 10 μl Proben der Reaktion wurden in 0,99 ml Tris-Puffer verdünnt und die Absorption bei 340 nm gemessen. Sobald die unverdünnte Reaktionsmischung eine OD₃₄₀ von weniger als 2,0 erreichte, wurden weitere 5 μmol NADPH hinzugefügt, um insgesamt 10 μmol zu ergeben. Zusätzlich wurde auch ein weiteres Aliquot des gereinigten Enzyms hinzugefügt. Die Umwandlung wurde durch HPLC überprüft. Sobald die Umwandlung von NADPH komplett war, wurden die Proben mit HPLC analysiert und bei –80°C gelagert.
Standardenzymassays für die Reduktion von 2,5-Diketo-D-gluconsäure wurden bei 30°C in 1,0 ml 100 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 0,1 mM NADPH und 1 mM 2,5-Diketo-D-gluconsäure, durchgeführt. Die Abnahme der Absorption infolge der Oxidation von NADPH wurde unter Verwendung eines Shimadzu UV 160U-Spektrophotometers gemessen. Eine Enzymeinheit wird als jene Menge Enzym definiert, welche die Oxidierung von 1 μmol NADPH pro Minute katalysierte. Zur Bestimmung der pH Optima wurden 100 mM Bis-Tris- und Bis-Tris-propanlösungen hergestellt, mit Steigerungen von 0,5 pH-Einheiten von pH 5,5 bis 9,0. Die Enzyme wurden bei jedem pH-Wert untersucht, um die optimale Aktivität zu bestimmen.
Kinetische Parameter der Umwelt-2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen (DKGRc und DKGRd) wurden in Duplikaten bestimmt, und wurden durch eine Anpassung der Daten mit der Methode der kleinsten Quadrate ("least squares fit") an eine Hyperbel unter Verwendung des Kurvenanpassungsalgorithmus von DeltaGraph (DeltaPoint, Monterey, CA) oder Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) berechnet. Die Cosubstrate waren in den für den Standardassay (oben beschrieben) beschriebenen Konzentrationen vorhanden. Zur Bestimmung der Km für NADPH und NADH wurden Assays unter Verwendung eines Varian Cary 1G-Spektrophotometers durchgeführt.
Zur Bestimmung der Parameter zur NADH-abhängigen Aktivität (nur in DKGRc vorhanden) wurden höhere Konzentrationen von sowohl Cofaktor als auch Substrat benötigt. Als Folge war die anfängliche Absorption bei 340 nm außerhalb des linearen Bereichs des Spektrophotometers, und die Änderung der Absorption wurde bei 385 nm gemessen. Da der Extinktionskoeffizient von NADH bei 385 nm 7,74-fach geringer als bei 340 nm war, wurden die Daten entsprechend angepaßt.
Zur Bestimmung der pH-Optima der Enzyme wurden 100 mM Bis/Tris- und Bis/Tris-propanlösungen zubereitet, mit Steigerungen von 0,5 pH-Einheiten von pH 5,5 bis 9,0. Die Enzyme wurden bei jedem pH-Wert gemessen, um optimale Aktivität zu bestimmen.
Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bradford-Verfahren unter Verwendung des Protokolls und der Reagenzien von Bio-Rad Laboratories mit bovinem Serumalbumin als Standard bestimmt.
Die thermische Stabilität jeder Reduktase wurde bei geringen Proteinkonzentrationen (0,085 mg/ml) in 100 mM Bis/Tris-Puffer, pH 7,0, bestimmt. Die Halbwertszeit bei 45°C wurde durch Inkubieren von 30 μ Aliquots von gereinigtem Enzym in dünnwandigen PCR-Röhrchen bei 4°C bestimmt. Die Temperatur wurde rasch auf 45°C durch einen Robocycler Gradient 96 Thermocycler (Stratagene, Inc.) erhöht und für 0,5, 5, 10, 20, 30 oder 60 min. bei 45°C gehalten, bevor die Probe auf 4°C zurückgeführt wurde. Jedes Röhrchen wurde später nach der Standardprozedur analysiert. Die Temperatur der mittleren thermischen Inaktivierung von DKGRd wurde durch Inkubieren des Enzyms für 10 min. über einen durch den Robocycler eingestellten Bereich von Temperaturen bestimmt. Der Robocycler wurde programmiert, um die Proben von 4°C zu einem Gradienten definierter Temperaturen im Bereich von 30–52°C in 2°C Schritten zu führen. Nach 10 min. wurden die Proben auf 4°C zurückgeführt. Die Stabilität von DKGRc bei 30°C wurde durch Plazieren von Enzymaliquots in vorgewärmte Mikrozentrifugenröhrchen in ein Wasserbad mit 30°C bestimmt. Die Röhrchen wurden für 1–5 h inkubiert, herausgenommen und analysiert. Die Ratenkonstante für den Verlust von Aktivität wurde durch Anpassung an die Gleichung eines exponentiellen Zerfalls unter Verwendung von Prism (GraphPad, Inc.) bestimmt. Alle Proben wurde im Duplikat analysiert.
Ergebnisse
Zuvor war die Reduktion von 2,5-Diketo-D-gluconsäure durch die überexprimierte Umweltreduktasen enthaltende Extrakte stöchiometrisch und ergab ein Produkt, welches mit 2-Keto-L-gulonsäure in der HPLC mitwanderte. Jedoch könnten in Extrakten Komplikationen auftreten, und es sind nicht für alle vier der möglichen Produkte, die durch die Reduktion von 2,5-Diketo-D-gluconsäure gebildet werden, Standards verfügbar. Daher wurde eine konzentrierte Lösung von 2,5-Diketo-D-gluconsäure vorbereitet und wie oben beschrieben durch jede Reduktase in Produkt umgewandelt. Die Konzentration von 2,5-Diketo-D-gluconsäure in dem Reaktionsgemisch war 10 mM. Nach der Zugabe von gereinigtem Enzym (40–52 Einheiten) und einem leichten Überschuß von NADPH im Verhältnis zu 2,5-Diketo-D-gluconsäure, zeigte HPLC-Analyse, daß die gesamte 2,5-Diketo-D-gluconsäure in eine Substanz umgewandelt worden war, welche mit echter 2-Keto-L-gulonsäure miteluierte. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit GCMS analysiert. Das Produkt beider Reaktionen hatte ein Massenspektrum, welches zu jenem von echter 2-Keto-L-gulonsäure identisch war (5). Alle anderen Komponenten, die in dem Chromatogramm vorhanden waren, wurden als Derivate von Pufferkomponenten oder derivatisierten Reagenzien identifiziert (nicht gezeigt). Keine anderen von 2,5-Diketo-D-gluconsäure abgeleiteten Produkte wurden beobachtet.
Die kinetischen Parameter der Umwelt-2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen wurden bei 30°C bestimmt (Tabelle 3). Die für 2,5-Diketo-D-gluconsäure bestimmten K_m-Werte waren 57 und 67 μM für die c- bzw. d-Form. Diese Werte sind um vieles niedriger als jene für die Corynebacterium-Reduktasen beschriebenen (T. Sonoyama und K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311/317 (1987)). Die für beide Umweltformen beobachtete k_cat war näher an jener des aktiveren Corynebacterium-Enzyms (Tabelle 3). Als Ergebnis waren die berechneten k_cat/K_m-Werte für die Umweltformen viel höher. Die neuen 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen hatten mehr als 20 mal höhere katalytische Effizienzen als das Corynebacterium Form-a-Enzym und 1.000 mal höhere als das Form-b-Enzym.
Tabelle 3 Kinetische Parameter der gereinigten 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen
Die pH-Profile der beiden Reduktasen zeigten eine Bevorzugung von saurem pH, es wurde jedoch eine gute Aktivität bei allen pH-Werten unter 7,5 beobachtet (6). Beide Enzyme zeigten eine optimale Aktivität bei pH 6,0. Dieser Trend wurde bei allen untersuchten Puffern beobachtet, aber die Aktivität variierte in Abhängigkeit des verwendeten Puffers. Aminpuffer wie Tris und Bis-Tris ergaben die beste Aktivität. In Phosphat- und Pyro phosphatpuffern waren beide Enzyme bei pH 6,0 etwa ein Drittel so aktiv. Sulfonatpuffer wie MES und HEPES ergaben intermediäre Aktivitäten. Die Bevorzugung eines sauren pHs war für die DKGRd etwas stärker ausgeprägt.
Mit wenigen Ausnahmen sind Aldo-Keto-Reduktasen absolut spezifisch für NADPH als Cosubstrat, einschließlich der Corynebacterium-2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktasen (Ratnam et al., Biochemistry 38(24): 7856–64 (1999); Todaka et al., Superfamily Arch Biochem. Biophys. 374(2): 189–197 (2000)). Wenn Extrakte von induzierten Zellen durch nicht-denaturierende Polyacylamid-Gelelektrophorese fraktioniert wurden und mit NADH oder NADPH inkubiert wurden, wurden Banden von 2,5-Diketo-D-gluconsäure abhängiger Oxidation beider Cofaktoren beobachtet (Daten nicht gezeigt). Diese Banden, welche in nicht-induzierten Zellen fehlten, waren an derselben Stelle im Gel positioniert, was darauf hinwies, daß ein Enzym beide Reaktionen katalysierte. Analysen der gereinigten Enzyme bestätigten, daß sie für die beobachtete Reaktion verantwortlich waren (7A). Jedoch war die Katalyse mit NADH als Cosubstrat weniger effizient (Tabelle 4). Der K_m-Wert für NADH war beinahe drei Größenordnungen höher als für NADPH. Die scheinbaren k_cat- und k_cat/K_m-Werte waren ebenfalls viel niedriger als jene mit NADPH als Cosubstrat gemessenen. Substitution von NADPH durch NADH beeinflußte auch dramatisch die scheinbare K_m für 2,5-Diketo-D-gluconsäure, mit einer 17- bis 40-fachen Erhöhung (Tabellen 4 und 5). Die NADH-abhängige Aktivität wurde durch Vorhandensein von anorganischem Phosphat im Reaktionspuffer erhöht (7B). Die Steigerung war sättigbar, mit einer scheinbaren K_m von 1,3 mM, was darauf hinwies, daß diese Erscheinung auf die Bindung von anorganischem Phosphat an das Enzym zurückzuführen war.
Tabelle 4 Vergleich der kinetischen Parameter mit NADH als Cofaktor
Corynebacterium-Reduktasen sind einigermaßen thermisch labil (D. B. Powers und S. Anderson, US-Patent 5,795,761 (1998); T. Sonoyama und K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311–317 (1987)). Um die thermische Stabilität der Umweltreduktasen zu bestimmen, wurde jede Umweltreduktase bei 44°C für unterschiedliche Zeitspannen inkubiert. Ein automatischer PCR- Thermocycler (Robocycler Gradient 96, Stratagene, Inc.) wurde zur schnellen und präzisen Einstellung von Temperaturen verwendet. Unter diesen Bedingungen war DKGRc relativ labil und verlor mehr als die Hälfte ihrer Aktivität zum frühesten Zeitpunkt, 0,5 min. Ihre Halbwertszeit wurde auf 0,4 min. geschätzt. Im Gegensatz dazu war DKGRd unter diesen Bedingungen relativ stabil mit einer Halbwertszeit von 53,4 min. Die thermische Inaktivierungstemperatur von DKGRd wurde durch Inkubieren des Enzyms für 10 min. über einen von dem Robocycler eingestellten Temperaturgradienten bestimmt (8). Das Enzym behielt beinahe die vollständige Aktivität bis zu 45°C, wonach die Aktivität rasch abnahm. Die Temperatur, bei der unter diesen Bedingungen die Hälfte der Aktivität verloren war, wurde auf 47°C geschätzt.
Beispiel 4
Konstruktion von positionsspezifischen Mutanten der Umweltreduktase DKGRc
Materialien und Methoden
Positionsspezifische Mutanten der DKGRc wurden durch Überlappungs-Extensions-PCR konstruiert. Es wurden Oligonukleotide entworfen, um zwei positiv geladene Reste, welche in die Bindung von Adenosin-2'-phosphat von NADPH impliziert werden, K232 und R238, in neutrale Reste zu verwandeln. Die Oligonukleotide:
5-ATCAGGGTTCGAAGACTGTGG (SEQ ID NO: 42)
5-TCTTCGAACCCTGATCAACTTG (SEQ ID NO: 43)
waren zum Antisense- bzw. Sensestrang komplementär und führten die Austausche K232Q bzw. R238Q ein. Die sich von der natürlichen Sequenz unterscheidenden Basen sind unterstrichen. Jedes Oligonukleotid wurde mit dem passenden Adaptorprimer (d. h. Primer zur Amplifikation des Gens zur Insertion in Expressionsvektoren) in PCRs gepaart, um Fragmente des DKGRc-Gens zu generieren, welche einen der beiden Austausche enthielten. Es wurden auch Primer synthetisiert, welche zur natürlichen DNA-Sequenz paßten. In Verwendung mit dem passenden Adaptorprimer generierten diese ein nicht modifiziertes Fragment des Gens. Die Genfragmente wurden paarweise in Überlappungs-Extensions-PCR-Reaktionen kombiniert, um die K232Q und die R238Q Mutanten zu ergeben. Die Amplifizierung des Gesamtlängengens wurde durch Beifügung beider Adaptorprimer getrieben. Die R238Q Mutante wurde durch dieselbe Prozedur, die zur Reinigung von nativem DKGRc verwendet wurde, gereinigt, eluierte jedoch an einer anderen Stelle des Salzgradienten, wie erwartet.
Ergebnisse
Aus induzierten Proben der K232Q und R238Q Mutanten bereitete Extrakte zeigten basierend auf Gelelektrophorese vergleichbare, starke Überexpression des Reduktaseproteins, jedoch war die NADPH-abhängige Aktivität stark reduziert. Moderate Aktivität wurde in Extrakten der R238Q Mutante detektiert, aber sehr niedrige Aktivität wurde für die K232Q Mutante beobachtet. Die R238Q Mutante wurde zur Homogenität gereinigt und kinetisch analysiert (Tabelle 5). Die K_m für NADPH war 18-fach höher in mutierter Reduktase, wie für die Entfernung eines Restes, der in der Ladung-Ladung-Interaktion mit dem Adenosin-2'-phosphat impliziert wird, erwartet. Jedoch erhöhte sich die maximale Aktivität des Enzyms in der Gegenwart der Mutation, angezeigt durch einen 3,5-fachen Anstieg in k_cat. Die gesamtkatalytische Effizienz (in Bezug auf die K_m von NADPH) war ein Fünftel jener des nativen Enzyms.
Die K_m für NADH, im Gegensatz, war durch die Mutation nicht beeinträchtigt (Tabelle 5), jedoch wurde eine ähnliche Steigerung der k_cat mit NADH als Cosubstrat beobachtet. Daher stieg die katalytische Effizienz mit NADH als Cosubstrat infolge der Mutation 7-fach an. Nichtsdestotrotz, infolge der viel höheren K_m für NADH, blieb die Effizienz des mutierten Enzyms mit NADPH als Cosubstrat selbst nach der Mutation viel höher. Austausch des Arginins mit Glutamin beeinflußte ebenfalls die Interaktion des Enzyms mit dem Substrat, 2,5-Diketo-D-gluconsäure; seine K_m stieg 7,7-fach von 57 auf 440 μM.
Tabelle 5 Kinetische Parameter von DKGRc und seiner R238Q Mutante

Claims

Expressionsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, die zumindest 60% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigt, hat, und wobei das Peptid 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktaseaktivität besitzt.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz zumindest 70% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz von 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) besitzt.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 2, wobei die Aminosäuresequenz zumindest 80% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz von 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) besitzt.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 3, wobei die Aminosäuresequenz zumindest 90% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz von 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) besitzt.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 4, der eine Nukleotidsequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 7) oder 2B (SEQ ID NO: 9) gezeigt, umfaßt.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das codierte Peptid an der Position, die zu Position 232 der in 2A (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäuresequenz korrespondiert, ein Q aufweist.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das codierte Peptid an der Position, die zu Position 238 der in 2A (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäuresequenz korrespondiert, ein Q aufweist.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, worin das Molekül eine aus den in 1 (bzw. SEQ ID NO: 1–6) gezeigten Sequenzen ausgewählte Sequenz umfaßt.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.
Wirtszelle gemäß Anspruch 9, wobei die Zelle Pantoea ist.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zumindest 60% Identität zu einer Aminosäuresequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigt, hat, wobei das Polypeptid 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktaseaktivität besitzt.
Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid zumindest 70% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigt, besitzt.
Polypeptid gemäß Anspruch 12, wobei das Polypeptid zumindest 80% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigt, besitzt.
Polypeptid gemäß Anspruch 13, wobei das Polypeptid zumindest 90% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigt, besitzt.
Polypeptid gemäß Anspruch 12, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, wie in 2A (SEQ ID NO: 8) oder 2B (SEQ ID NO: 10) gezeigt, besitzt.
Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid an der Position, die zu Position 232 der in 2A (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäuresequenz korrespondiert, ein Q aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid an der Position, die zu Position 238 der in 2A (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäuresequenz korrespondiert, ein Q aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid eine NADH-abhängige Aktivität aufweist.
Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Ascorbinsäure, umfassend die Kultivierung der Wirtszelle gemäß Anspruch 9 unter Bedingungen, die zur Expression der 2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase geeignet sind.