ES2223927T3 - Acido 2,5-diceto-d-gluconico reductasas y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10), y en el que el péptido tiene actividad ácido 2, 5- diceto-D-glucónico reductasa.

Description

Ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas y métodos de uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa de origen natural y a variantes recombinantes. Más específicamente, la invención se refiere al aislamiento, identificación y uso de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas.

Antecedentes de la invención

La conversión de glucosa en vitamina C (ácido ascórbico) es un proceso complicado porque implica epimerización selectiva, oxidación y formación de lactona. Las rutas biosintéticas naturales son largas e incorporan muchas reacciones que consumen energía (Davey et al., Plant Physiol., 121(2): 535-543 (1999); Nishikimi, M. y K. Yagi, Subcell. Biochem. 25: 17-39 (1996); Wheeler et al., Nature 393(6683): 365-369 (1998). El proceso comercial actual para la producción de ácido ascórbico (proceso Reichstein) acopla una etapa biológica inicial sencilla, la reducción microbiana de glucosa a sorbitol, con la posterior conversión química multietapa de derivados de bloques de sorbitol en ácido ascórbico (Crawford, T.C., American Chemical Society, Washington DC (1982); Reichstein T. y A. Grussner, Helv. Chim. Acta 16: 311 (1934)). Se ha propuesto un proceso comercial alternativo que consiste en la conversión biológica de glucosa en ácido 2-ceto-L-gulónico, que se lactoniza químicamente a ácido ascórbico (Anderson, et al., Science 230: 144-149 (1985); Grindley, et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 1770-1775 (1988); Sonoyama, et al., patente de EE.UU. 3.922.194 (1975)). El metabolismo biológico implicado es más sencillo que el de las rutas biosintéticas naturales y requiere menos energía metabólica (menos ATP y NADPH). En este proceso, la glucosa se convierte primero en ácido 2,5-diceto-D-glucónico mediante oxidasas endógenas de una cepa bacteriana adecuada utilizando oxígeno molecular como aceptor último de electrones. El ácido 2,5-diceto-D-glucónico se reduce después enzimáticamente a ácido 2-ceto-L-glucónico mediante una ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa heteróloga (DKGR) expresada en la cepa de producción. El NADPH requerido para la reacción se genera por el metabolismo de la cepa hospedadora. Finalmente, la lactonización química del ácido 2-ceto-L-gulónico genera el ácido ascórbico.

Hasta la fecha, sólo se han caracterizado extensamente dos ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas, aisladas ambas de una especie de Corynebacterium (Miller, et al., J. Biol. Chem. 262(19): 9016-9020; Powers, D.B. y S. Anderson, patente de EE.UU. 5.795.761 (1998); Sonoyama, T. y K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311-317 (1987)). Estas enzimas son capaces de reducir el ácido 2,5-diceto-D-glucónico, pero reductasas alternativas o alteradas podrían mejorar la producción de ácido ascórbico mediante el proceso descrito anteriormente o variaciones del mismo. Ambas enzimas de Corynebacterium son catalizadores relativamente ineficaces, exhibiendo valores de K_{m} para el ácido 2,5-diceto-D-glucónico mayores de 1 mM y eficacias catalíticas (k_{cat}/K_{m}) menores de 20 mM^{-1}s^{-1}.

Las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas son miembros de la superfamilia de aldo-ceto reductasas (Jez, et al., Biochem. J. 326 (Pt3): 625-636 (1997); Seery, et al., J. Mol. Evol. 46(2): 139-146 (1998)). Como casi todas las demás aldo-ceto reductasas, las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas son exclusivamente específicas de NADPH (Jez, et al., Biochem. J. 326(Pt3): 625-636 (1997); Seery, J. Mol. Evol. 46(2): 139-146 (1998)). Recientemente, se han aislado aldo-ceto reductasas adicionales de E. coli, basándose en una búsqueda de la secuencia genómica, que pueden convertir el ácido 2,5-diceto-D-glucónico en ácido 2-ceto-L-gulónico (Yum, et al., Bacteriol. 180(22): 5984-5988 (1998); Yum, et al., Appl. Environ. Microbiol. 65(8): 3341-3346 (1999)). Sin embargo, estas enzimas catalizan también la reacción de forma relativamente ineficaz. Las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas conocidas carecen también de estabilidad; ambas enzimas de Corynebacterium son térmicamente lábiles (Powers, D.B. y S. Anderson, patente de EE.UU. 5.795.761 (1998); Sonoyama, T. y K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311-317 (1987)).

Por lo tanto, sería deseable resolver el problema de las reductasas ineficaces proporcionando ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas que sean más eficaces que las reductasas conocidas. En particular, sería deseable proporcionar nuevas enzimas que presenten mayor eficacia catalítica que las ácido 2,5-diceto-D- glucónico reductasas previamente conocidas, y que tengan actividad dependiente de NADH. Sería deseable adicionalmente que la reductasa fuera más estable térmicamente que las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas conocidas. Sería deseable adicionalmente proporcionar variantes de dichas reductasas, métodos para preparar, examinar y utilizar las nuevas reductasas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona ácidos nucleicos, proteínas, microorganismos y métodos de preparación y uso de los mismos que implican cada uno reductasas de la superfamilia de las aldo-ceto reductasas.

En una realización, se proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que tieene una secuencia aminoacídico que tiene al menos aproximadamente un 60% de identidad de secuencia con una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10). El péptido tiene actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa. En otra realización, dicha secuencia aminoacídica tiene al menos aproximadamente un 70%, 80% o tanto como un 90% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

En otra realización, el vector de expresión comprende una secuencia nucleotídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 7) o 2B (SEC ID Nº 9).

En otro aspecto de la invención, el vector de expresión comprende una secuencia seleccionada del grupo de secuencias indicado en la Figura 1 (SEC ID Nº 1-6). Se proporciona también en la presente memoria un microorganismo que comprende uno o más de dichos vectores. Preferiblemente, dicho microorganismo es de Pantoea.

Se proporciona adicionalmente en la presente memoria un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos aproximadamente un 60% de identidad con una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10). Dicho polipéptido comprende actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa. En otra realización, dicho polipéptido tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10). En una realización adicional, se proporciona un polipéptido en la presente memoria que tiene una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID
Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

En una realización, dicho polipéptido tiene una Q en una posición correspondiente a la posición 232 y/o la posición 238 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 2A (SEC ID Nº 7).

En otra realización, dicha reductasa tiene actividad dependiente de NADH.

Se proporciona también en la presente memoria un proceso para convertir glucosa en ácido ascórbico que comprende cultivar las células hospedadoras proporcionadas en la presente memoria en condiciones adecuadas para la expresión de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa.

Otros aspectos de la invención resultarán evidentes por la siguiente descripción detallada de la solicitud.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la alineación de las secuencias nucleotídicas (SEC ID Nº: 1-6) de los seis productos de PCR de ADN ambiental. Se muestra la secuencia completa del clon pI-14. Las bases idénticas en las secuencias restantes se indican por puntos (.). Los huecos introducidos en la alineación se indican por rayas (-). Las barras negras indican las localizaciones de los dos cebadores de PCR degenerados.

La Figura 2 muestra las secuencias nucleotídicas de los clones completos de pI-14 (Figura 2A (SEC ID Nº 7)) y pI-28 (Figura 2B (SEC ID Nº 9)). La región de codificación de los supuestos genes de reductasa se indica en letras mayúsculas, con la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº 8 y 10, respectivamente) mostrada inmediatamente debajo en código de una letra. Las localizaciones de los cebadores degenerados y específicos de clon se indican por flechas. Los supuestos marcos de lectura abiertos parciales cadena arriba y cadena abajo del gen de reductasa se indican por barras negras.

La Figura 3 muestra la alineación de las secuencias aminoacídicas deducidas de los clones pI-14 (SEC ID Nº 8) y pI-28 (SEC ID Nº 10). Se muestra la secuencia completa de pI-14. Las bases idénticas en el clon pI-28 se indican por puntos (.).

La Figura 4 describe un proceso recombinante para la conversión de glucosa en ácido ascórbico.

La Figura 5 describe los espectros de masas del producto de reacción del ácido 2-ceto-L-gulónico y ácido 2-ceto-L-gulónico patrón. La Figura 5A muestra el espectro de masas del producto de reacción del ácido 2-ceto-L-gulónico. La Figura 5B muestra el espectro de masas del ácido 2-ceto-L-gulónico patrón.

La Figura 6 describe la dependencia de la velocidad de reacción del pH.

La Figura 7 describe la actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico dependiente del NADH de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas aisladas del ambiente. La Figura 7A muestra la actividad dependiente del NADH y la Figura 7B ilustra la potenciación de la actividad dependiente del NADH mediante la inclusión de fosfato inorgánico.

La Figura 8 describe la estabilidad térmica de la forma d ambiental de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa (DKGRd).

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan en la presente memoria nuevas proteínas y ácidos nucleicos. Se proporciona también en la presente memoria el uso de dichas proteínas y ácidos nucleicos. Se proporcionan adicionalmente en la presente memoria métodos para el aislamiento y producción de dichas proteínas y ácidos nucleicos. Además, en un aspecto de la invención, las proteínas proporcionadas en la presente memoria se han identificado como pertenecientes a la familia de aldo-ceto reductasas y son ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas.

Una proteína que tiene actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa (DKGR) se define en la presente memoria como una proteína que es capaz de catalizar la conversión de ácido 2,5-diceto-D-glucónico en ácido 2-ceto-L-gulónico. En realizaciones preferidas, las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas proporcionadas en la presente memoria pueden aceptar tanto NADPH como NADH como cosustrato. En una realización, ambos son sustratos. En otra realización, la DKGR puede servir como fuente de carbono o azúcar. En aún otra realización, la DKGR tiene otras actividades reductasas, particularmente aldo-ceto reductasas.

Se entiende en la presente memoria que la proteína y el ácido nucleico DKGR pueden designarse en la presente memoria como "secuencias DKGR", en las que el contexto indicará si la secuencia es una secuencia aminoacídica, secuencia de ácido nucleica o ambas.

En un aspecto de la invención, las proteínas DKGR proporcionadas en la presente memoria tienen propiedades alteradas frente a las DKGR descritas previamente. Las propiedades que pueden alterarse incluyen una o más de las siguientes, pero sin limitación: eficacia catalítica, actividad dependiente del NADH, estabilidad térmica, tolerancia a disolventes, especificidad y pH óptimo. Alterado significa que ha ocurrido un cambio detectable, habitualmente un aumento o reducción de al menos un 10%, más preferiblemente un 30%, más preferiblemente un 75%, más preferiblemente un 100%, y más preferiblemente al menos 2 ó 3 veces más. Preferiblemente, mejora la propiedad de eficacia catalítica, estabilidad térmica o tolerancia a disolventes. Adicionalmente, como se describe con más detalle a continuación, las secuencias proporcionadas en la presente memoria pueden alterarse o utilizarse para generar proteínas DKGR que tienen una propiedad alterada en comparación con las proteínas DKGR de la Figura 2 o codificadas por las secuencias mostradas en la Figura 1.

En una realización, puede identificarse inicialmente una secuencia DKGR utilizando cebadores PCR degenerados derivados de la información de secuencia de DKGR previamente publicadas o como se describen en la presente memoria. Los supuestos genes completos se obtienen en primer lugar utilizando etapas sucesivas de PCR en las que la especificidad de la reacción aumenta con cada etapa del proceso de anidamiento. Para verificar que el gen completo obtenido mediante este enfoque representa una secuencia génica de origen natural, se amplifica directamente el gen completo a partir de la muestra de partida de ADN ambiental utilizando cebadores de PCR que se dirigen a las regiones flanqueantes de las secuencias predichas.

En otras realizaciones, puede identificarse una secuencia de DKGR mediante la homología sustancial de la secuencia de ácido nucleico y/o aminoacídica con las secuencias DKGR expuestas en la presente memoria. Dicha homología puede basarse en la secuencia de ácido nucleico o aminoacídica total, y se determina generalmente como se expone a continuación, utilizando programas de homología o condiciones de hibridación.

Por tanto, en una realización, un ácido nucleico es un "ácido nucleico DKGR" si la homología total de la secuencia de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico de las Figuras (las Figuras de ácido nucleico) es mayor de un 60% o 70%, más preferiblemente mayor de aproximadamente un 80%, aún más preferiblemente mayor de aproximadamente un 85% y lo más preferiblemente mayor de un 90%. En algunas realizaciones, la homología será del orden de aproximadamente 93 a 95 ó 98%. La homología como se utiliza en la presente memoria es con referencia a la similitud o identidad de secuencia, prefiriéndose la identidad. Esta homología se determinará utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica incluyendo, pero sin limitación, el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), el método de búsqueda de similitudes de Pearson & Lipman, PNAS USA 85: 2444 (1988), implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387-395 (1984), utilizando preferiblemente los ajustes por defecto, o mediante
inspección.

Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones pareadas progresivas. Puede representar también un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987); el método es similar al descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). Los parámetros útiles de PILEUP incluyen un valor de hueco por defecto de 3,00, un valor de longitud de hueco por defecto de 0,10 y huecos terminales valorados.

En una realización preferida, se realiza un análisis de secuencia múltiple utilizando la colección de programas Lasergene de DNASTAR. DNASTAR utiliza el algoritmo Clustal en el programa Megalign versión 3.12. Los parámetros de alineación múltiple por defecto incluyen una penalización por hueco de 10 y una penalización por longitud de hueco de 10. Los parámetros de alineación pareada por defecto incluyen una longitud de palabra de 1, una penalización por hueco de 3, una ventana de 5 y diagonales impedidas de 5.

Otro ejemplo de algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990) y Karlin, et al., PNAS USA 90: 5873-5787 (1993). Es un programa BLAST particularmente útil el programa WU-BLAST-2, que se obtuvo de Altschul, et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996): [http://
blast.wustl/edu/blast/README.html]. El WU-BLAST-2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se fijan a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se fijan con los siguientes valores: intervalo de superposición= 1, fracción de superposición= 0,125, umbral de palabra (T)= 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular en la que se está buscando la secuencia de interés; sin embargo los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad. Se determina un valor de % de identidad de secuencia aminoacídica mediante el número de residuos de coincidencia idéntica dividido entre el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es aquella que tiene más residuos reales en la región alineada (se ignoran los huecos introducidos por WU-BLAST-2 para maximizar la puntuación de
alineación).

Se describe un algoritmo BLAST actualizado en Altschul, et al., Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402 (1997); http://
www.ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/. Es un programa BLAST particularmente útil el BLAST Basic. Los parámetros preferidos son lambda K H 0,318, 0,135, 0,401 y lambda K H con huecos 0,27, 0,0470, 0,23; matriz: BLOSUM62, penalizaciones por hueco: existencia 11, extensión 1. Los parámetros preferidos para las alineaciones múltiples mostradas en la presente memoria que se realizaron en la colección de programas Lasergene de DNASTAR son los parámetros por defecto del algoritmo Clustal en el programa Megalign. La información de parámetros es: (alineaciones múltiples) penalización por hueco 10, penalización por longitud de hueco 10, (alineaciones pareadas) longitud de palabra 1, penalización por hueco 3, ventana 5 y diagonales 5.

Por tanto, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" se define como el porcentaje de residuos nucleotídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos nucleotídicos de la secuencia mostrada en las figuras de ácidos nucleicos. Un método preferido utiliza el módulo BLASTN de WU- BLAST-2 fijado a los parámetros por defecto, con el intervalo de superposición y la fracción de superposición fijados a 1 y 0,125, respectivamente.

La alineación puede incluir la introducción de huecos en las secuencias a alinear. Un método particularmente preferido utiliza los módulos BLASTX y BLASTP de BLAST Basic fijados a una matriz BLOSUM64 y con una penalización por hueco de 11 por existencia y una penalización por hueco de 1 por extensión.

Además, para secuencias que contienen más o menos nucleósidos que los de las figuras de ácidos nucleicos, se entiende que el porcentaje de homología se determinará basándose en el número de nucleósidos homólogos en relación con el número total de nucleósidos. Por tanto, por ejemplo, la homología de secuencias más cortas que las secuencias identificadas en la presente memoria y como se discuten a continuación se determinará utilizando el número de nucleósidos de la secuencia más corta.

En una realización, el ácido nucleico DKGR se determina mediante estudios de hibridación. Por tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos que hibridan con alto rigor con las secuencias de ácido nucleico identificadas en las figuras, o un complemento, se consideran secuencias DKGR en una realización de la presente memoria. Las condiciones de alto rigor son conocidas en la técnica; véanse por ejemplo Maniatis, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (1989) y "Short Protocols in Molecular Biology", ed. Ausubel, et al., incorporados ambos a la presente memoria como referencia. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Se encuentra una extensa guía de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes. Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5-10ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la que un 50% de las sondas complementarias con la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, un 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en que la concentración de sal es menos de aproximadamente 1,0 M de ión sodio, típicamente de aproximadamente 0,01 M a 1,0 M de concentración de ión sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden conseguirse también con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.

En otra realización, se utilizan condiciones de hibridación menos rigurosas; por ejemplo pueden utilizarse condiciones de moderado o bajo rigor, como son conocidas en la técnica; véase Maniatis y Ausubel, supra y Tijssen, supra.

Las secuencias de ácido nucleico DKGR pueden ser fragmentos de genes mayores, concretamente son segmentos de ácidos nucleicos. "Genes" en este contexto incluye regiones de codificación, regiones de no codificación y mezclas de regiones de codificación y de no codificación. En consecuencia, como apreciarán los expertos en la técnica, utilizando las secuencias proporcionadas en la presente memoria, pueden obtenerse secuencias adicionales de genes de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa utilizando técnicas bien conocidas en la técnica para la clonación de secuencias más largas o secuencias completas; véanse Maniatis et al. y Ausubel et al., supra, incorporadas expresamente a la presente memoria como referencia.

En una realización preferida, las secuencias DKGR se aíslan del medio. Por "aislamiento de ADN del medio" se quiere indicar en la presente memoria extraer muestras de suelo y/o agua para ADN genómico. Es decir, el ADN ambiental es ADN obtenido a partir de organismos no cultivados que no han crecido todavía en condiciones de laboratorio.

Aunque se prefiere aislar las secuencias DKGR de organismos no cultivados, las secuencias de organismos cultivados pueden ser útiles. Por "cultivado" en la presente memoria se quieren indicar organismos capaces de crecer en medio nutriente en un laboratorio. Por tanto, en realizaciones alternativas, se proporcionan otras secuencias de microorganismos capaces de convertir ácido 2,5-diceto-D-glucónico en ácido 2-ceto-L-glucónico, incluyendo el grupo de bacterias corineformes (Corynebacterium, Brevibacterium y Arthobacter), así como especies de Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus y Citrobacter. Otros microorganismos que tienen homólogos incluyen N. crassa, Y. pestis, Zymomonas mobilis, Saccharomyces cerevisiae.

En otra realización, las secuencias son variantes de secuencia como se describen adicionalmente en la presente memoria.

Una vez se identifica una secuencia de ácido nucleico DKGR, puede clonarse y recombinarse sus partes constituyentes para formar el ácido nucleico DKGR completo o viceversa, puede formarse un fragmento. Una vez aislado de su fuente natural, por ejemplo contenido en un plásmido u otro vector o escindido del mismo en forma de un segmento de ácido nucleico lineal, el ácido nucleico DKGR recombinante puede utilizarse adicionalmente como sonda para identificar y aislar otros ácidos nucleicos DKGR. Puede utilizarse también como ácido nucleico "precursor" para preparar ácidos nucleicos y proteínas DKGR modificados o variantes. "Recombinante" como se utiliza en la presente memoria designa un ácido nucleico o proteína que no está en su estado nativo. Por ejemplo, el ácido nucleico puede modificarse por ingeniería genética, aislarse, insertarse en un vector artificial o estar en una célula en la que no se expresa nativamente para ser considerado recombinante.

La expresión "ácido nucleico" designa desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma mono- o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término comprende ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular comprende también implícitamente variantes modificadas conservativamente del mismo (por ejemplo sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codón degenerado pueden conseguirse generando secuencias en las que se sustituye la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) por residuos de bases mixtas y/o de desoxoiinosina (Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Cassol, et al., 1992; Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). El término ácido nucleico se utiliza intercambiablemente con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.

Los ácidos nucleicos que codifican proteínas DKGR se utilizan para preparar una variedad de vectores de expresión para expresar proteínas DKGR, que pueden utilizarse después para convertir ácido 2,5-diceto-D-glucónico en ácido 2-ceto-L-gulónico como se describe a continuación. Los vectores de expresión pueden ser vectores extracromosómicos autorreplicativos o vectores que se integran en un genoma hospedador.

Generalmente, estos vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional ligado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína DKGR. La expresión "secuencias de control" designa secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación ligada operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen por ejemplo un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, se liga operativamente ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora a ADN de un polipéptido si éste se expresa en forma de una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; se liga operativamente un promotor o potenciador a una secuencia de codificación si ésta afecta a la transcripción de la secuencia; o se liga operativamente un sitio de unión a ribosoma a una secuencia de codificación si ésta está situada de modo que facilita la traducción. Generalmente, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, en el caso de una líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se realiza mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o engarces según la práctica convencional. El ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional será generalmente apropiado para la célula hospedadora utilizada para expresar la proteína DKGR; por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcional y traduccional de Pantoea se utilizan preferiblemente para expresar la proteína DKGR en Pantoea. Son conocidos en la técnica numerosos tipo de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células hospedadoras.

En general, las secuencias reguladoras transcripcional y traduccional pueden incluir, pero sin limitación, secuencias promotoras, sitios de unión a ribosoma, secuencias de inicio y paro transcripcional, secuencias de inicio y paro traduccional, y secuencias potenciadoras o activadoras. En una realización preferida, las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y paro transcripcional.

Las secuencias promotoras codifican promotores constitutivos o inducibles. Los promotores pueden ser promotores de origen natural o promotores híbridos. Los promotores híbridos, que combinan elementos de más de un promotor, son también conocidos en la técnica, y son útiles en la presente invención.

Además, el vector de expresión puede comprender elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así mantenerse en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o de insecto para expresión y en un hospedador procariótico para clonación y amplificación. Además, para integrar vectores de expresión, el vector de expresión contiene al menos una secuencia homóloga al genoma de la célula hospedadora, y preferiblemente dos secuencias homólogas que flanquean al constructo de expresión. El vector de integración puede dirigirse a un locus específico en la célula hospedadora seleccionando la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Los constructos para integrar vectores son bien conocidos en la
técnica.

Además, en una realización preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador detectable para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula hospedadora utilizada.

Las proteínas DKGR de la presente invención pueden producirse cultivando una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína DKGR en las condiciones apropiadas para inducir o causar la expresión de la proteína DKGR. Las condiciones apropiadas para la expresión de proteína DKGR variarán con la elección del vector de expresión y la célula hospedadora, y se determinarán fácilmente por un experto en la técnica mediante experimentación rutinaria. Por ejemplo, el uso de promotores constitutivos en el vector de expresión requerirá la optimización del crecimiento y proliferación de la célula hospedadora, mientras que el uso de un promotor inducible requiere las condiciones de crecimiento apropiadas para la inducción. Además, en algunas realizaciones, el momento de la recogida es importante. Por ejemplo, los sistemas de baculovirus utilizados en la expresión de células de insecto son virus líticos, y por lo tanto la selección del momento de recogida puede ser crucial para el rendimiento del producto.

Las células hospedadoras apropiadas incluyen levaduras, bacterias, arqueobacterias, hongos, células de insectos y animales, incluyendo células de mamíferos. Son de particular interés células de Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras, E. coli, Bacillus subtilis, Panteoa sp., células Sf9, células C129, células 293, células de Neurospora, BHK, CHO, COS, HeLA, adenovirus y células de plantas; Pantoea agglomerans, por ejemplo la cepa ATCC 27155; Pantoea ananatis, por ejemplo ATCC 33244, Pantoea citrea, por ejemplo ATCC 31623, Pantoea dispersa, por ejemplo ATCC 14589, Pantoea punctata, por ejemplo ATCC 31626, Pantoea stewartii, por ejemplo ATCC 8199. La selección de la célula hospedadora se considera al alcance de los expertos en la técnica de las enseñanzas de la presente memoria.

En una realización, las proteínas DKGR se expresan en células de mamífero. Los sistemas de expresión de mamífero son también conocidos en la técnica, e incluyen sistemas retrovirales. Los métodos de introducir ácido nucleico exógeno en hospedadores mamíferos, así como en otros hospedadores, son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula hospedadora utilizada.

En otra realización, las proteínas DKGR se expresan en sistemas bacterianos. Los sistemas de expresión bacterianos son bien conocidos en la técnica. Pueden utilizarse también promotores de bacteriófagos y son conocidos en la técnica. Además, son también útiles promotores sintéticos y promotores híbridos; por ejemplo el promotor tac es un híbrido de las secuencias promotoras trp y lac. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores naturales de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Además de una secuencia promotora activa, es deseable un sitio de unión a ribosoma eficaz. El vector de expresión puede incluir también una secuencia péptido señal que proporciona la secreción de la proteína DKGR en bacterias. La proteína se secreta al medio de crecimiento (bacterias gram-positivas) o al espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram-negativas). El vector de expresión puede incluir también un marcaje epitópico que proporciona la purificación adicional de la proteína DKGR. El vector de expresión bacteriano puede incluir también un gen marcador detectable para permitir la selección de cepas bacterianas que se hayan transformado. Los genes de selección adecuados incluyen genes que vuelven la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores de selección incluyen también genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina. Estos componentes se ensamblan en vectores de expresión. Los vectores de expresión para bacterias son bien conocidos en la técnica, e incluyen vectores para Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris y Streptococcus lividans, entre otros. Los vectores de expresión bacterianos se transforman en células hospedadoras bacterianas utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como tratamiento con cloruro de calcio, electroporación y otras. Preferiblemente, se utilizan vectores de expresión para Pantoea sp., por ejemplo como se demuestra a continuación en los
ejemplos.

En una realización, las proteínas DKGR se producen en células de insecto. Los vectores de expresión para la transformación de células de insecto, y en particular, los vectores de expresión basados en baculovirus, son bien conocidos en la técnica.

En otra realización, se producen proteínas DKGR en células de levadura. Los sistemas de expresión de levadura son bien conocidos en la técnica, e incluyen vectores de expresión para Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis y K. lactis, Pichia guillerimondii y P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica.

En consecuencia, la presente invención proporciona también secuencias de proteína DKGR. Una proteína DKGR de la presente invención puede identificarse de diversos modos. "Proteína" en este sentido incluye proteínas, polipéptidos, enzimas y péptidos. Como apreciarán los expertos en la técnica, las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para generar secuencias de proteína. En particular, las secuencias completas y homólogos pueden identificarse mediante las secuencias o fragmentos de los mismos proporcionados en la presente memoria. Se entiende también que se proporcionan adicionalmente en la presente memoria las variantes alélicas de origen natural de las secuencias proporcionadas en la presente memoria.

Se incluyen también en una realización de proteínas DKGR las variantes aminoacídicas de las secuencias de origen natural, como se determina en la presente memoria. Preferiblemente, las variantes son más de un 60 ó 70% homólogas con la secuencia de tipo silvestre, más preferiblemente más de aproximadamente un 70 u 80%, aún más preferiblemente más de aproximadamente un 85% y lo más preferiblemente más de un 90%. En algunas realizaciones, la homología será del orden de aproximadamente 93 a 95 ó 98%. Como para los ácidos nucleicos, homología en este contexto significa similitud o identidad de secuencia, prefiriéndose la identidad. Esta homología se determinará utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica como se exponen anteriormente para las homologías de ácidos nucleicos. Las proteínas de la presente invención pueden ser más cortas o más largas que las secuencias aminoacídicas de tipo silvestre.

Además, como se expone anteriormente, los ácidos nucleicos DKGR de la invención pueden utilizarse para obtener regiones de codificación y no codificación adicionales, y por tanto en el caso de regiones de codificación, secuencias de proteína adicionales, utilizando técnicas conocidas en la técnica.

En una realización preferida, la proteína DKGR es DKGRc (pI-14) o DKGRd (pI-28) como se muestra en las Figuras 2 y 3. Por simplicidad, a veces la DKGR en la presente memoria se discute de manera ejemplar, sin embargo se entiende que en algunas realizaciones, particularmente en los métodos descritos en la presente memoria, pueden utilizarse diferentes realizaciones de las proteínas DKGR como se describen en la presente memoria.

En una realización, las proteínas DKGR son proteínas DKGR derivadas o variantes en comparación con la secuencia de tipo silvestre. Es decir, como se expone más detalladamente a continuación, el péptido DKGR derivado contendrá al menos una sustitución, deleción, inserción aminoacídica o combinación de las mismas, prefiriéndose particularmente la sustitución aminoacídica. La sustitución, inserción o deleción aminoacídica o combinación de las mismas puede ocurrir en cualquier residuo dentro y/o en un extremo terminal del péptido DKGR. Estas variantes se preparan normalmente mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína DKGR, utilizando mutagénesis de módulo o PCR u otras técnicas bien conocidas en la técnica para producir ADN que codifica la variante, y después de ello, expresar el ADN en cultivo de células recombinantes como se expone anteriormente. Sin embargo, pueden prepararse fragmentos de proteína DKGR variante que tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos mediante síntesis in vitro utilizando técnicas establecidas. Las variantes de secuencia aminoacídica se caracterizan por la naturaleza predeterminada de la variación, un rasgo que las aparta de la variación alélica o interespecie de origen natural de la secuencia aminoacídica de la proteína DKGR. Las variantes exhiben típicamente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo de origen natural, aunque pueden seleccionarse también variantes que tengan características modificadas como se expondrá más detalladamente a continuación.

Aunque el sitio o región de introducción de una variación de secuencia aminoacídica está predeterminado, la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, puede realizarse una mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y analizarse en las variantes de DKGR expresadas la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo mutagénesis de cebador M13 y mutagénesis de PCR. El análisis de los mutantes se realiza utilizando ensayos de actividades de proteína DKGR.

Las sustituciones aminoacídicas son típicamente de residuos simples; las inserciones serán habitualmente del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque pueden tolerarse inserciones considerablemente mayores. Las deleciones están en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho mayores.

Pueden utilizarse sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a un derivado final. Generalmente, estos cambios se realizan en unos pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, pueden tolerarse cambios mayores en ciertas circunstancias. Cuando se desean pequeñas alteraciones en las características de la proteína DKGR, se hacen generalmente sustituciones según el siguiente cuadro:

CUADRO I

Residuo original	Sustituciones ejemplares
Ala		Ser
Arg		Lys, His
Asn		Gln, His
Asp		Glu
Cys		Ser
Gln		Asn
Glu		Asp
Gly		Pro
His		Asn, Gln
Ile		Leu, Val
Leu		Ile, Val
Lys		Arg, Gln, Glu, Gly
Met		Leu, Ile
PheSer		Met, Leu, Tyr
Thr		Thr
Trp		Ser
Tyr		Tyr
Val		Trp, Phe, Ile, Leu

Se realizan cambios sustanciales en la función o identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos conservativas que las mostradas en el cuadro I. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones que afectan más significativamente a: la estructura de la cadena principal en el área de la alteración, por ejemplo la estructura de hélice alfa o lámina beta; la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que produzcan los mayores cambios en las propiedades del polipéptido son aquellas en que (a) se sustituye un residuo hidrófilo, por ejemplo serilo o treonilo, por un residuo hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) se sustituye una cisteína o prolina por cualquier otro residuo; (c) se sustituye un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, por un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) se sustituye un residuo de cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, por uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo glicina.

Las variantes exhiben típicamente la misma actividad biológica cualitativa y desencadenarán la misma respuesta inmune que el análogo de origen natural, aunque se seleccionan también variantes para modificar las características de las proteínas DKFR según sea necesario. Como alternativa, la variante puede diseñarse de tal modo que se altere la actividad biológica de la proteína DKGR.

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos DKGR están incluidas en el alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoacídicos diana de un polipéptido DKGR con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales de un polipéptido DKGR. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular la proteína DKGR con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en el método para purificar anticuerpos anti-DKGR o en ensayos de análisis, como se describe con más detalle a continuación. Los agentes de reticulación utilizados habitualmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo, treonilo o tirosilo, la metilación de grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido DKGR incluida en el alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativa del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativa del polipéptido" se pretende que signifique con fines de la presente invención eliminar uno o más restos carbohidrato encontrados en un polipéptido DKGR de secuencia nativa, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido DKGR de secuencia nativa.

La adición de sitios de glicosilación a polipéptidos DKGR puede conseguirse alterando la secuencia aminoacídica de los mismos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución de, uno o más residuos de serina o treonina del polipéptido DKGR de secuencia nativa (por sitios de glicosilación ligados por O). La secuencia aminoacídica DKGR puede alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel de ADN, particularmente mediante mutación del ADN que codifica el polipéptido DKGR en bases preseleccionadas de tal modo que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Es otro medio de aumentar el número de restos carbohidrato en el polipéptido DKGR mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos métodos se describen en la técnica, por ejemplo en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).

La retirada de restos carbohidrato presentes en el polipéptido DKGR puede realizarse química o enzimáticamente o mediante sustitución por mutación de codones que codifican residuos aminoacídicos que sirven como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) y por Edge, et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de los restos carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas como se describe por Thotakura, et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987). Preferiblemente, la proteína DKGR es no glicosilada. Por ejemplo, en una realización, la proteína es, por ejemplo, humana expresada en bacterias, por ejemplo E. coli. Además, la fosforilación y/o metilación de DKGR como se utiliza en la presente memoria puede diferir de la de DKGR como se encuentra en su forma nativa en una célula.

Otro tipo de modificación covalente de DKGR comprende unir el polipéptido DKGR a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera indicada en las patentes de EE.UU. nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ó 4.179.337.

Los polipéptidos DKGR de la presente invención pueden modificarse también en una realización de modo que formen moléculas quiméricas que comprendan un polipéptido DKGR fusionado con otro polipéptido heterólogo o secuencia aminoacídica. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de un polipéptido DKGR con un polipéptido de marcaje que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-marcaje. Los marcajes preferidos incluyen el epítopo myc y 6-histidina. El marcaje epitópico se dispone generalmente en la terminación amino o carboxilo del polipéptido DKGR. La presencia de dichas formas marcadas epitópicamente de un polipéptido DKGR puede detectarse utilizando un anticuerpo contra al polipéptido de marcaje como se discute adicionalmente a continuación. Además, la provisión del marcaje epitópico posibilita purificar fácilmente el polipéptido DKGR mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-marcaje u otro tipo de matriz de afinidad que se una al marcaje epitópico. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de un polipéptido DKGR con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma divalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser la región Fc de una molécula de IgG.

Son bien conocidos en la técnica diversos polipéptidos de marcaje y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen marcajes de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido de marcaje HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field, et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); el marcaje c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 del mismo (Evan, et al., Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616 (1985)); y el marcaje de glicoproteína D (gD) de herpesvirus simplex y su anticuerpo (Paborsky, et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). Otros polipéptidos de marcaje incluyen el péptido Flag (Hopp, et al., BioTechnology 6: 1204-1210 (1988)); el péptido epitópico KT3 (Martin, et al., Science 255: 192-194 (1992)); el péptido epitópico de tubulina (Skinner, et al., J. Biol. Chem. 266: 15163-15166 (1991)) y el marcaje peptídico de proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 87: 6393-6397 (1990)).

Se incluyen también en la definición de proteína DKGR en una realización otras proteínas de la superfamilia de aldo-ceto reductasas y proteínas DKGR de otros organismos, que se clonan y expresan como se expone a continuación. Por tanto, pueden utilizarse secuencias de sondas o de cebadores de reacción en cadena con polimerasa (PCR) degenerados para encontrar otras proteínas relacionadas con DKGR en seres humanos u otros organismos. Como apreciarán los expertos en la técnica, las secuencias de sonda y/o cebador de PCR particularmente útiles incluyen las áreas únicas de la secuencia de ácido nucleico DKGR. Como es generalmente conocido en la técnica, los cebadores de PCR preferidos son de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, prefiriéndose de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, y pueden contener inosina según sea necesario. Las condiciones para la reacción PCR son bien conocidas en la técnica. Además, como se expone en la presente memoria, pueden prepararse proteínas DKGR que son más largas que las descritas en las Figuras, por ejemplo mediante la elucidación de secuencias adicionales, la adición de marcajes epitópicos o de purificación, la adición de otras secuencias de fusión, etc.

Las proteínas DKGR pueden identificarse también por estar codificadas por ácidos nucleicos DKGR. Por tanto, en una realización, las proteínas DKGR se codifican por ácidos nucleicos que hibridarán con las secuencias de las figuras de ácidos nucleicos, o sus complementos, o que tienen homología con o la actividad de otra proteína DKGR como se expone en la presente memoria.

En una realización preferida, la proteína DKGR se purifica o aísla después de la expresión. Las proteínas DKGR pueden aislarse o purificarse en una variedad de modos conocidos por los expertos en la técnica, dependiendo de cuáles otros componentes están presentes en la muestra. Los métodos de purificación estándar incluyen técnicas electroforéticas, moleculares, inmunológicas y cromatográficas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, hidrófoba, de afinidad y HPLC, y cromatoenfoque. Por ejemplo, la proteína DKGR puede purificarse utilizando una cromatografía de afinidad estándar seguida de cromatografía de intercambio iónico.

Las técnicas de ultrafiltración y diafiltración, junto con la concentración de proteína, son también útiles. Para una guía general de las técnicas de purificación adecuadas véase Scopes, R., "Protein Purification", Springer-Verlag, NY (1982). El grado de purificación necesario variará dependiendo del uso de la proteína DKGR. En algunos casos, no será necesaria purificación.

Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" designan material que está sustancial o esencialmente exento de componentes que lo acompañan normalmente cuando se encuentra en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Se purifica sustancialmente la proteína que es la especie predominante presente en una preparación. El término "purificado" designa que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o proteína es al menos un 85% puro, más preferiblemente al menos un 95% puro, y lo más preferiblemente al menos un 99% puro. En una realización preferida, una proteína se considera pura cuando se determina que no hay actividad contaminante.

Una vez expresados y purificados si es necesario, las proteínas y ácidos nucleicos DKGR son útiles en una serie de aplicaciones. Por ejemplo, los ácidos nucleicos DKGR pueden secuenciarse y someterse a mutagénesis específica de sitio para desarrollar reductasas DKGR modificadas con propiedades deseadas que están ausentes o son menos pronunciadas en las proteínas de tipo silvestre, tales como estabilidad térmica, tolerancia a disolventes, actividad dependiente de NADH y diferente pH óptimo.

Los ácidos nucleicos y proteínas DKGR de esta invención pueden emplearse para cualquier fin en el que sea necesaria o deseada la actividad de la enzima DKGR. En una realización preferida, los ácidos nucleicos y proteínas DKGR se utilizan para preparar enzimas útiles en procesos industriales.

En una realización preferida, los ácidos nucleicos y proteínas DKGR se utilizan para preparar enzimas que pueden utilizarse comercialmente para convertir glucosa en vitamina C en un solo organismo. En este proceso, se modifica por ingeniería genérica una cepa capaz de convertir la glucosa en ácido 2,5-diceto- D-glucónico mediante una oxidasa endógena para expresar una reductasa DKG obtenida utilizando uno de los métodos de la presente invención. La cepa tiene una fuente de glucosa o prepara glucosa o se le proporciona una. La cepa recombinante resultante convierte después glucosa en ácido 2-ceto-L-gulónico en una sola etapa de fermentación.

En una realización, se proporciona un microorganismo capaz de dirigir la producción de 2-ceto-L-gulonato a partir de D-glucosa. En una realización, el gulonato se convierte posteriormente en vitamina C.

Pueden utilizarse las proteínas DKGR, sus fragmentos u otros derivados o análogos de los mismos como inmunógeno para producir anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

En una realización, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo como son conocidos en la técnica, incluyendo Fab, Fab_{2}, anticuerpos monocatenarios (Fv por ejemplo), anticuerpos quiméricos, etc., producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo utilizando tecnologías de ADN recombinante.

Los métodos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la técnica. Los anticuerpos policlonales pueden estimularse en un mamífero, por ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un coadyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o coadyuvante se inyectará al mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir la proteína DKGR, un fragmento de la misma o una proteína de fusión de la misma. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero sin limitación, hemocianina de lapa bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Los ejemplos de coadyuvantes que pueden emplearse incluyen coadyuvante completo de Freund y coadyuvante MPL-TDM (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede seleccionarse por un experto en la técnica sin experimentación indebida.

Los anticuerpos pueden ser, como alternativa, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). En un método de hibridoma, se inmuniza típicamente un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado con un agente inmunizante para desencadenar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido DKGR o un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se utilizan células de bazo o células de nódulo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan después con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, pág. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovinas y de origen humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células originales carecen de la enzima hipoxantinoguanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), evitando dichas sustancias el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Los anticuerpos generados contra las proteínas DKGR de la presente invención pueden utilizarse para examinar enzimas similares de otros organismos y muestras. Los anticuerpos pueden emplearse también como sondas para examinar bibliotecas génicas para identificar reductasas DKG o actividades reactivas cruzadas.

Los siguientes ejemplos sirven para describir con más detalle la manera de utilizar la invención anteriormente descrita, así como para indicar los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se entiende que estos ejemplos no sirven para limitar el verdadero alcance de esta invención en modo alguno, sino que se presentan con fines ilustrativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas ambientales DKGRc y DKGRd Materiales y métodos

Se realizó la extracción y purificación de ADN de muestras de suelo y sedimento de agua como se describe anteriormente (Eschenfeldt, et al., "Isolation of a full-length hsp60 gene from environmental DNA by polymerase chain reaction" (2000)). Se recogieron las muestras de suelo y agua en el verano de 1996 de un estanque, un bosque de hoja caduca y cerca de la base de un arbusto cultivado de agracejo en las cercanías del Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois.

Se recogió el agua de estanque en garrafas de plástico y se concentró el material suspendido mediante centrifugación de corriente paralela (Sharples, modelo A5-16) o, para volúmenes pequeños, mediante filtración a través de filtros de nitrocelulosa de 0,22 \mum. Se extrajo el ADN de los concentrados utilizando un kit de extracción de ADN genómico comercial (Puregene) siguiendo los métodos descritos por el fabricante.

Las muestras de suelo se recogieron después de retirar los desechos de superficie y descartar aproximadamente 3 cm de la capa superficial del suelo. Se dispusieron muestras de 3 a 6 cm por debajo de la superficie en bolsas de plástico sellables estériles, se devolvieron al laboratorio y se almacenaron a 4ºC hasta la extracción de ADN. El procedimiento de extracción fue esencialmente como se describe por (Selenska, S. y W. Klingmüller, Lett. Appl. Microbiol. 13(1): 21-24 (1991)). Se suspendieron 2 g (peso húmedo) de suelo en 4 ml de tampón de extracción (Na_{2}HPO_{4} 120 mM (pH 8,0) y dodecilsulfato de sodio al 1%). Se agitó la suspensión a 200 rpm durante 1 h a 70ºC en un incubador con agitación New Brunswick, y después se centrifugó a 3000 x g durante 5 min a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Se recogió el sobrenadante que contenía ADN y se extrajo el sedimento de suelo dos veces adicionales mediante resuspensión en 2 ml de tampón de extracción, agitación durante 20 min a 70ºC y centrifugación como anteriormente. Se centrifugaron los sobrenadantes combinados a 20.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente para retirar las partículas residuales. Se almacenaron estas muestras a 4ºC hasta procesamiento posterior.

Se retiraron las sustancias húmicas de los extractos de suelo mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Sepharose CL-4B) seguida de cromatografía de intercambio iónico (Tip 500G; Qiagen). Para la separación de Sepharose, se añadieron 150 \mul de glicerol a 1,4 ml del extracto de ADN de suelo y se aplicó la muestra a la superficie de una columna CL-4B de 1,0 x 20 cm equilibrada con Tris 10 mM (7,5), EDTA 1 mM, NaCl 100 mM (TEN). Las fracciones de volumen de huecos que contenían ADN se combinaron y se precipitaron con etanol. (La columna podría reutilizarse mediante un lavado concienzudo con tampón TEN). Se disolvió el ADN precipitado en Tris 10 mM (pH 8,4) y se añadió NaCl a una concentración final de 0,75 M. Se purificó adicionalmente el ADN utilizando una columna Qiagen Tip 500G según las instrucciones del fabricante. Se disolvió el ADN precipitado con isopropanol recuperado de la columna Tip 500G en 500 \mul de Tris 10 mM (pH 8,0), se determinó su concentración mediante la absorbancia a 260 nm y se almacenó a -20ºC.

Se amplificaron fragmentos internos de los genes utilizando cebadores degenerados. Los cebadores degenerados se diseñaron basándose en comparaciones de secuencia de los dos genes de 2,5-DKG reductasa conocidos de Corynebacterium [acceso a Genbank M12799 (Anderson, et al., Science 230: 144-149 (1985)) y M21193 (Grindley, et al., Appl. Environ. Microbiol. 54(7): 1770-1775 (1988))] y lo que parecía ser el estrechamente relacionado gen de morfina deshidrogenasa de Pseudomonas putida [GB: M94775 (Willey, et al., Biochem. J. 290(Pt2): 539-544 (1993)]. Las secuencias aminoacídicas de estos tres genes se alinearon utilizando el método Clustal (programa Megalign, DNA Star). Se diseñaron dos cebadores de 20 nucleótidos basándose en las regiones de identidad o fuerte similitud para al menos siete aminoácidos. Se analizaron en los cebadores la formación de horquillas y dúplex, la temperatura de fusión predicha y la energía libre de asociación con el programa Oligo 5 (National Biosciences, Inc.). Se sintetizaron los dos oligonucleótidos, designados DU1 y DL1, por la HHMI/Keck Oligonucleotide Synthesis Facility, Universidad de Yale.

Se determinaron las condiciones óptimas para la PCR con los cebadores degenerados utilizando el plásmido ptrp1-35a (Anderson, et al., Science 230: 144-149 (1985)) que contiene el gen 2,5-DKGa reductasa de Corynebacterium. A menos que se indique otra cosa, todas las reacciones PCR (volumen de reacción de 50 \mul) contenían 1 x tampón exento de Mg, 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP, MgCl_{2} 2,5 mM, 2 \muM de cada uno de los cebadores degenerados, 1,5 unidades de polimerasa Taq (Promega) y 25-100 ng de ADN ambiental preparado como se describe anteriormente. Las condiciones de PCR comenzaron con 94ºC (1 min) seguido de 40 ciclos de 94ºC (30 s), 58ºC (45 s) y 72ºC (1 min), y terminaron con una incubación a 72ºC durante 60 min. Se analizaron los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% como se describe en otro sitio (Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).

Se purificó el producto de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,0% en tampón TBE. Se escindió la banda de interés del gel y se extrajo el ADN con el kit de purificación QiaQuick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se ligó el ADN purificado al vector pBluescript SK+ (Stratagene) digerido con EcoRV (Promega), y se añadió un solo residuo T a los extremos 3' añadiendo el extremo con dTTP y polimerasa Taq (Ausubel, et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Nueva York (1988)). Se obtuvieron la ADN ligasa T4 y el tampón 10 x de Promega, y se utilizaron según las instrucciones del fabricante. Se transformó el ADN ligado en DH5\alpha de Escherichia coli (MaxEfficiency, GIBCO/BRL) según las instrucciones del fabricante. Se cultivó E. coli en placas de agar LB que contenían ampicilina, IPTG y Xgal (Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Se analizaron en las colonias blancas los vectores que contenían insertos de ADN de los tamaños esperados utilizando PCR. Se utilizaron las regiones promotoras T3 y T7 del vector como cebadores y se realizó la PCR utilizando las condiciones descritas anteriormente.

Se secuenciaron los clones de plásmido utilizando el kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction ABI Prism (Perkin-Elmer Applied Biosystems) en un termociclador GeneAmp PCR System 9600 de Perkin-Elmer utilizando los cebadores promotores T3 y T7. Todas las concentraciones de componentes, condiciones de incubación y ciclado siguieron las instrucciones del fabricante. Se separaron las muestras en un gel de acrilamida al 6% que contenía urea 8 M en un secuenciador de ADN 373A de Applied Biosystems (Perkin-Elmer Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron las secuencias utilizando el programa Seqman (DNA Star).

Se amplificaron las regiones flanqueantes de los genes de la manera siguiente. Se alienaron las secuencias nucleotídicas de los fragmentos de PCR ambientales clonados utilizando el programa Megalign de DNA Star. Se eligieron cebadores específicos de clones potenciales de áreas con la menor homología de secuencia. Se examinaron la temperatura de fusión del cebador, la energía libre de asociación, la formación de dúplex y el rendimiento predicho en una reacción PCR utilizando el programa Oligo 5 (National Biosciences, Inc.). Se determinaron experimentalmente las condiciones óptimas para cada conjunto de cebadores utilizando el clon específico como molde. Se determinó la especificidad de los cebadores ensayando cada conjunto de cebadores con cada uno de los clones ambientales como molde. Un par cebador se consideró específico si generaba la banda esperada sólo con su molde específico. Las secuencias de los cebadores específicos de clon para los dos clones de 2,5-DKG reductasa relacionados seleccionados para estudio adicional (pI-14 y pI-28) se muestran en la Tabla 1. Se obtuvo el ADN contiguo de las regiones flanqueantes 5' y 3' mediante PCR de sitio de restricción.

TABLA 1 Secuencias de cebador de PCR

1

2

3

Se sintetizaron cebadores de PCR de sitio de restricción (RS-PCR) (Sarkar, et al., PCR Methods Appl. 2(4): 318-322 (1993)) por la HHMI/Keck Oligonucleotide Synthesis Facility, Universidad de Yale. Los cebadores fueron de estructura general N_{10}GAATTC, en la que las primeras 10 posiciones están completamente degeneradas y las seis finales especifican un sitio de restricción, EcoRI en el ejemplo. Se utilizaron también cebadores de Nco I, Pvu II, Xho I, Bgl I e Hind III. Se realizaron una serie de tres reacciones PCR semianidadas. Para la región flanqueante 3', la primera reacción utilizó uno de los cebadores de RS-PCR y el cebador específico apropiado U1 a 20 \muM, 100 ng de ADN ambiental y 1,25 unidades de polimerasa Taq (Promega). Se desnaturalizaron las muestras a 94ºC durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos a 94ºC (30 s), 50ºC (1 min) y 72ºC (2 min), con una incubación final a 72ºC durante 15 min. Las rondas dos y tres fueron idénticas, excepto porque se utilizó 1 \mul de la reacción PCR de la ronda anterior como molde y se utilizaron los cebadores específicos U2 y U3 en las rondas 2 y 3, respectivamente. Se analizaron alícuotas de cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las bandas candidatas se escindieron del gel, se purificaron y se secuenciaron directamente utilizando cebadores específicos de clon. Para obtener las regiones flanqueantes 5', se utilizaron los cebadores específicos de clon apropiados L1-L3.

Se generaron copias completas de los genes pI-14 y pI-28 a partir del ADN de sedimento de agua de estanque mediante PCR con cebadores específicos de las regiones 5' y 3' de no codificación de cada gen (14U6, 14L6, 28U5, 28L7, véase la Tabla 1). Las condiciones fueron similares a las utilizadas para los cebadores degenerados. Las condiciones de reacción se desviaron de las condiciones estándar sólo en el uso de MgCl_{2} 1,5 mM. Se desnaturalizaron las muestras a 94ºC durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos a 94ºC (30 s), 58ºC (45 s) y 72ºC (2 minutos), con una incubación final a 72ºC durante 15 min.

Se diseñaron cebadores adaptadores que generarían un sitio Mun I inmediatamente cadena arriba del codón de iniciación y un sitio Hind III inmediatamente cadena abajo del codón de terminación de cada gen. (14expU, 14expL, 28expU, 28expL, véase la Tabla 1). Se utilizaron como molde los productos de PCR completos de la amplificación directa, y las condiciones de reacción fueron idénticas a las descritas anteriormente. Se purificaron los productos de estas reacciones mediante electroforesis en gel de agarosa, se digirieron con Mun I e Hind III y se ligaron en el vector de expresión pJF118EH (Fürste, et al., Gene 48(1): 119-131 (1986)), que se había digerido con EcoR I y Hind III. Se transformó el ADN ligado en DH5\alpha o JM109 de E. coli y se analizó como se describe anteriormente.

Resultados

Los cebadores degenerados DU1 y DL1 se dirigen a regiones internas altamente conservadas de la secuencia aminoacídica de las DKGR bacterianas. En una reacción de control, utilizando un plásmido que porta el gen DKGRa de Corynebacterium como molde, se obtuvo una banda bien definida del producto esperado de 380 pb. Cuando se utilizaron varios extractos de ADN ambiental como molde, la electroforesis en gel de agarosa reveló amplias bandas entre 350 y 400 pb de tamaño. Estas bandas se escindieron del gel, se ligaron en el vector pBluescript SK+ (Promega) y se transformaron en DH5\alpha de E. coli. Se aislaron un total de seis clones que contenían insertos de aproximadamente 350-400 pb para estudio adicional (Tabla 2). La secuenciación reveló que los seis clones eran diferentes entre sí. Una búsqueda BLASTX (Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 (1997)) de la base de datos GenBank indicó que los seis eran miembros de la familia de genes de aldo-ceto reductasa, y ninguno era idéntico a ninguna secuencia en las bases de datos públicas. La alineación de las secuencias nucleotídicas de los clones (Figura 1) reveló que dos, pU-14 y pI-28, tenían un 79% de identidad de secuencia nucleotídica excluyendo las secuencias cebadoras. Estos clones poseían un 46-48% de identidad de secuencia aminoacídica con el gen DKGRa de Corynebacterium [acceso GB M12799 (Anderson, et al., Science 230: 144-149 (1985))]. Estos dos clones se eligieron para estudio adicional.

TABLA 2 Fragmentos de PCR clonados

4

5

Se obtuvieron las secuencias flanqueantes 5' y 3' para los clones pI-14 y pI-28 mediante PCR de sitio de restricción (RS-PCR) (Sarkar, et al., PCR Methods Appl. 2(4): 318-322 (1993)). Se diseñaron cebadores específicos de clon anidados (Tabla 1) para ambos pI-14 y pI-28, y se utilizaron conjuntamente con diversos cebadores de RS-PCR. La amplificación inicial, utilizando ADN ambiental como molde, generó una mancha difusa de productos con unas pocas bandas apenas discernibles. Las rondas posteriores de PCR utilizaron el producto de la reacción anterior como molde, el mismo cebador de RS-PCR y un cebador anidado cadena abajo. Con cada ronda, se generaron cada vez más productos discretos. Después de tres o cuatro rondas, se formaron productos discretos con buen rendimiento. Para la región 3' flanqueante se generó un fragmento de aproximadamente 800 pb con el cebador Xho I de RS-PCR para ambos clones pI-14 y pI-28. Se generó un fragmento de aproximadamente 500 pb de secuencia flanqueante 5' para cada clon utilizando el cebador Bgl I de RS-PCR.

La secuenciación de los productos finales confirmó que las regiones flanqueantes se superponían con la secuencia de los clones originales. Se construyeron supuestas secuencias nucleotídicas completas para los genes I-14 e I-28 a partir de los fragmentos superpuestos (Figura 2). Se predice que el supuesto gen DKG reductasa en el clon pI-14 empieza en el codón GTG en la posición 312. En el clon pI-28, el supuesto gen empieza en el codón ATG en la posición 94. Las secuencias aminoacídicas deducidas de las reductasas predichas fueron homólogas a las de la DKGRa de especies Corynebacterium.

Se encontraron marcos abiertos de lectura parciales cadena arriba y cadena abajo de los genes reductasa. Un supuesto marco de lectura abierto cadena arriba (orf1) empieza más allá del intervalo del fragmento amplificado y cubre 104 aminoácidos en el clon pI-14. El codón de terminación de orf1 se superpone con el supuesto codón de inicio GTG del gen DKGR. La secuencia de pI-28 contiene los 29 aminoácidos finales de orf1, de los cuales 27 son idénticos a la secuencia de pI-14. Una búsqueda BLASTP de la base de datos Genbank con la secuencia aminoacídica orf1 de pI-14 proporcionó sólo unos pocos aciertos. La mejor coincidencia fue un marco de lectura abierto de E. coli hipotético [ACC74333 (Blattner, et al., Science 277 (5331): 1453-1474 (1997))] con una identidad de un 32% para 103 aminoácidos. Un segundo marco de lectura abierto potencial (orf2) empieza en ambos clones en un residuo de metionina justo después del codón de terminación de reductasa, y se extiende más allá del intervalo de los clones. Las secuencias orf2 son un 88% idénticas entre sí para 86 residuos aminoacídicos. Una búsqueda BLASTP de las secuencias proporcionó la mejor coincidencia con una proteína hipotética de Streptomyces coelicolor [CAB51274 (Redenbach, et al., Mol. Microbiol. 21(1): 77-96 (1996))] con una identidad de un 45% para un intervalo de 85 aminoácidos.

Para establecer que los genes ensamblados pI-14 y pI-28 están verdaderamente presentes en el entorno y no son quimeras de múltiples genes homólogos, los inventores diseñaron cebadores específicos para las regiones 5' y 3' de no codificación de cada clon (Tabla 1). La amplificación directa con estos cebadores utilizando el ADN ambiental original como molde generó productos del tamaño predicho en una sola reacción PCR. La secuenciación de estas bandas confirmó sus identidades como pI-14 y pI-28.

Para permitir la expresión de los genes amplificados, se clonaron las secuencias de codificación en el vector de expresión pJF118EH (Fürste, et al., Gene 48(1): 119-131 (1986)). Se sintetizaron cebadores de adaptador para los clones pI-14 y pI-28 (Tabla 1). Debido a que las secuencias indicaron que ambos genes tenían un sitio EcoR I interno, los cebadores de codificación (14expU y 28expU) añadieron un sitio de restricción Mun I inmediatamente cadena arriba del codón de iniciación. Para pI-14, el cebador de codificación cambió también el codón de iniciación de "GTG" a ATG. Los cebadores inversos para ambos clones (14expL, 28expL) añadieron un segundo codón de terminación en fase inmediatamente adyacente al codón de terminación existente, junto con un sitio de restricción Hind III. Los productos de PCR completos generados a partir de ADN ambiental se utilizaron como molde. Se clonaron los productos de estas dos reacciones en el vector de expresión pJF118EH y se transformaron en E. coli. Se identificaron clones con los tamaños de inserto esperados y se seleccionó un clon para cada gen (designado pI-14 y pI-28, respectivamente) para análisis adicional.

Se determinaron dos secuencias de ambos clones y se compararon las secuencias aminoacídicas deducidas (SEC ID Nº 8 y 10, respectivamente) (Figura 3). Los dos clones tienen una identidad de secuencia aminoacídica total de un 82,5%. Debe observarse que ninguna de las secuencias del clon de expresión fue idéntica a los clones originales obtenidos en forma de productos de RS-PCR. La secuencia aminoacídica del clon pI-14 difería en un 4% y el clon pI-28 en un 1% de sus secuencias predichas. Dichas diferencias pueden atribuirse al gran número de ciclos de PCR utilizados para generar los clones originales.

Una búsqueda (BLASTP) en la base de datos Genbank de homólogos de las secuencias aminoacídicas de pI-14 y pI-28 indicó que las secuencias están relacionadas lo más estrechamente con un supuesto gen de oxidorreductasa de Streptomyces coelicolor [CAA22355 (Redenbach, et al., Mol. Microbiol. 21(1): 77-96 (1996)). La homología es de un 47% de identidad para PI-14 y un 48% de identidad para pI-28. Ambas secuencias son también homólogas con DKGR de Corynebacterium spp. con un 41% y 42% de identidad, respectivamente.

Ejemplo 2 Purificación de las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas ambientales DKGRc y DKGRd Materiales y métodos

Se produjeron las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas ambientales completas DKGRc y DKGRd mediante la inducción de cultivos de E. coli que contienen los plásmidos de expresión pI-14 o pI-28. Se hicieron crecer aeróbicamente cultivos de DH5\alpha de E. coli que contenían pI-14 a 37ºC en 500 ml de caldo Luria (Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., 2º vol. Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)) en un matraz erlenmeyer entallado de 1 l. Se hicieron crecer cultivos de JM109 de E. coli que contenían el plásmido pI-28 en las mismas condiciones, pero a 30ºC. Se agitaron ambos cultivos a 250 rpm. Cuando la DO_{600} de los cultivos alcanzó 0,3-0,5, se indujo la expresión con \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (IPTG, U.S. Biochemicals). Se recogieron las células después de 4 horas (experimentos a 37ºC) o se hicieron crecer durante una noche (experimento a 30ºC), se lavaron una vez con tampón TE y se almacenaron a -70ºC. Los componentes de los medios se adquirieron en Fisher.

Para los ensayos enzimáticos rutinarios, se utilizó como sustrato ácido 2,5-diceto-D-glucónico (DKG) sólido, proporcionado por Genencor International. Para los análisis cinéticos y para la preparación del producto de reacción, se preparó DKG mediante la oxidación de glucosa por células permeabilizadas de Pantoea citrea, y se utilizó sin purificación en forma sólida o con secado cuidadoso para evitar la hidratación del producto sólido. La P. citrea se proporcionó por Genencor International. Todos los demás productos químicos fueron de Sigma.

Se hizo crecer P. citrea durante una noche en 50 ml de caldo Luria que contenía glucosa 20 mM a 28ºC en un matraz entallado de 250 ml a 250 rpm. Se añadió una alícuota adicional de 10 ml de caldo Luria que contenía glucosa 100 mM al cultivo, y se hizo crecer el cultivo durante 1 hora adicional a 28ºC. Se recogieron las células mediante centrifugación a 6000 rpm (3600 x g) a 20ºC durante 10 minutos. Se resuspendieron las células en 6 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 5 mM, y se transfirieron a un matraz erlenmeyer tapado de 125 ml. Se ajustó la concentración de las células a una DO_{600} final de 10-20 unidades DO/ml. Se permeabilizaron las células añadiendo 50 \mul de una solución de tolueno:acetona (1:9) por ml de células, y agitando con vórtex durante 1 minuto. Para preparar ácido 2,5-diceto-D-glucónico, se añadió glucosa a las células permeabilizadas hasta una concentración final de 50 mM, y se incubaron las células a 28ºC durante 4-6 horas con agitación a 250 rpm. Se retiraron las células mediante centrifugación a 3600 x g durante 10 minutos y se filtró el sobrenadante, que contenía ácido 2,5-diceto-D-glucónico, a través de un filtro de 0,2 micrómetros para retirar cualquier desecho celular. Se determinó enzimáticamente la concentración de ácido 2,5-diceto-D-glucónico utilizando ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa. Se dispusieron alícuotas de 1 ml a -80ºC para almacenamiento a largo plazo.

Se purificaron las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas resuspendiendo sedimentos celulares en aproximadamente 2 volúmenes de Tris/HCl 10 mM, pH 7,5 que contenían EDTA 1 mM, ditiotreitol 0,5 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) al 0,001%. Se lisaron las células pasando la suspensión dos veces a través de una prensa French. Se retiraron los desechos celulares y las membranas mediante centrifugación a 950 x g seguido de ultracentrifugación a 435.000 x g en una ultracentrífuga Beckman TL-100. Se purificaron ambas reductasas mediante cromatografía de afinidad en un gel Matrix Red A (Amicon) seguido de intercambio iónico en una columna MonoQ (Pharmacia).

Se cargó una columna de 2 x 8 cm de Active Red Matrix y se eluyó utilizando el sistema de cromatografía líquida Fast Protein (Pharmacia Biotech). Se equilibró la columna con Tris/HCl 10 mM, pH 7,2 que contenía EDTA 0,5 mM y DTT 0,5 mM. Para formar c, se cargaron aproximadamente 5 ml de extracto ultracentrifugado en la columna a un caudal de 0,5 ml/min. Se lavó la columna con 40 ml de tampón de equilibrado a un caudal de 2 ml/min, después se eluyó por etapas, primero con 40 ml de tampón de equilibrado que contenía NaCl 1,5 M, seguido de tampón que contenía NaCl 2,5 M. La forma c de reductasa eluyó en el lavado de NaCl 2,5 M.

Para la forma d de reductasa, se modificó este procedimiento de la manera siguiente. Después de cargar la enzima, se lavó la columna con tampón de equilibrado, como se describe anteriormente. Se eluyó después la enzima con un gradiente lineal de 100 ml de tampón de equilibrado NaCl 0-1,5 M. La enzima eluyó a una concentración de NaCl de aproximadamente 0,6 M. En ambas purificaciones, las fracciones que contenían actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa se combinaron y se dializaron frente a tampón exento de sal.

Se cargaron las fracciones combinadas dializadas en una columna MonoQ HR 10/10 utilizando un Superloop. La reductasa c eluyó utilizando un gradiente lineal de 2,5%/min de NaCl 0-1,0 M en tampón Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5, que contenía DTT 0,5 mM. La purificación de la reductasa d requirió dos etapas de MonoQ, realizadas a pH 7,5 y pH 8,0. La enzima eluyó de la primera columna con gradientes lineales de 1%/min de NaCl 0-1,0 M en tampón Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5 que contenía DTT 0,5 mM. Se combinaron las fracciones que contenían actividad reductasa, se dializaron durante una noche frente a Tris/HCl 100 mM, pH 8,0 que contenía DTT 0,5 mM, y se cargaron en la columna MonoQ que se había equilibrado previamente con el mismo tampón a pH 8,0. Se eluyó la enzima con un gradiente lineal de 1,25%/min de NaCl 0-1,0 M en Tris 0,1 M, pH 8,0 que contenía DTT 0,5 mM. En cada caso, la ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa eluyó en forma de un pico agudo (A280) en el gradiente final. Se evaluó la pureza mediante electroforesis en gel desnaturalizante (Laemmli, Nature 227(259): 680-685 (1970)).

Resultados

Se purificó rápidamente la DKGRc, que estaba más sobreexpresada, hasta homogeneidad en dos etapas. La reductasa se unió estrechamente a la columna de afinidad, y se eluyó mediante aumentos escalonados de la concentración de NaCl. La reductasa eluída con NaCl 2,5 M proporcionó suficiente material puro para purificación hasta homogeneidad en una sola etapa de intercambio iónico. Después de la diálisis para retirar la sal, se purificaron las fracciones activas combinadas hasta aparente homogeneidad en una columna MonoQ eluída con gradientes lineales secuenciales constituidos en primer lugar por un gradiente de 2%/min de tampón que contenía NaCl 0,3 M, seguido de un gradiente en etapas de NaCl 0,5 M. La enzima eluyó en forma de un pico agudo simétrico bien aislado aproximadamente a NaCl 0,4 M.

La DKGRd, no tan sobreexpresada, se unió menosestrechamente a las resinas Matrix Red Agarose y MonoQ. La DKGRd eluyó de la columna Matrix Red Agarose con un gradiente lineal de 100 ml de NaCl 0-1,5 M. El análisis de electroforesis en gel reveló que diversas proteínas celulares coeluían con la reductasa a esta concentración de sal. El fraccionamiento de este material en la columna MonoQ no consiguió separar la reductasa de uno de los contaminantes celulares principales. Se utilizó una segunda columna MonoQ a pH 8,0 utilizando un gradiente bajo de concentración de sal en la región en la que eluía la reductasa. La proteína resultante estaba exenta de los contaminantes principales y se estimó mediante densitometría que era pura en más de un 97%. La DKGRc y DKGRd purificadas tenían pesos moleculares nativos aparentes de 30 y 31 kD, respectivamente. Los pesos moleculares observados correspondían en general a los predichos por las secuencias génicas de 29.687 y 33.798 Da, respectivamente.

Ejemplo 3 Caracterización de reductasas ambientales Materiales y métodos

Se determinó el producto de la reducción de 2,5-DKG por las enzimas purificadas mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG-EM). En primer lugar, se preparó una preparación de alta concentración de ácido 2,5-diceto-D-glucónico a partir de células permeabilizadas. Se hicieron crecer las células y se permeabilizaron como se describe anteriormente. Se incubaron las células tratadas (50 ml en un matraz entallado de 250 ml) con glucosa 50 mM durante 6 horas a 28ºC y 250 rpm. Se retiraron después las células mediante centrifugación y se pasó el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros para retirar todas las células viables. Se determinó enzimáticamente que la concentración de 2,5-DKG era 32 mM. Para la conversión a producto, se diluyó la preparación proporcionando una solución de 1 ml que contenía 10 \mumol de sustrato en tampón Bis/Tris 65 mM a pH 7,0. Se añadieron 5 \mumol de NADPH, y se inició la reacción mediante la adición de 40 unidades de DKGRc purificada o 52 unidades de DKGRd purificada. Se controló la progresión de las reacciones determinando la concentración de NADPH restante; se diluyeron muestras de 10 \mul de la reacción en 0,99 ml de tampón Tris y se midió la absorbancia a 340 nm. Una vez alcanzó la mezcla de reacción no diluida una DO_{340} de menos de 2,0, se añadieron 5 \mumol adicionales de NADPH para dar un total de 10 \mumol. Se añadió también una alícuota adicional de enzima purificada. La conversión se verificó mediante HPLC. Una vez se completó la conversión de NADPH, se analizaron las muestras mediante HPLC y se almacenaron a -80ºC.

Se realizaron ensayos enzimáticos estándar para la reducción de ácido 2,5-diceto-D-glucónico a 30ºC en 1,0 mlde tampón Tris/HCl 100 mM, pH 7,2 que contenía NADPH 0,1 mM y ácido 2,5-diceto-D-glucónico 1 mM. La reducción de absorbancia debida a la oxidación de NADPH se midió utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV 160U. Se define una unidad de enzima como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 \mumol de NADPH por minuto. Para la determinación del pH óptimo, se prepararon soluciones de Bis-Tris y Bis-Tris-propano 100 mM en incrementos de 0,5 unidades de pH desde pH 5,5 a 9,0. Se ensayaron las enzimas a cada nivel de pH para determinar la actividad óptima.

Se evaluaron los parámetros cinéticos de las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas ambientales (DKGRc y DKGRd) por duplicado, y se calcularon mediante un ajuste de mínimos cuadrados de los datos de la hipérbola utilizando el algoritmo de ajuste de curvas de DeltaGraph (DeltaPoint, Monterrey, CA) o Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Estaban presentes cosustratos a la concentración descrita para el ensayo estándar (descrito anteriormente). Para la determinación de la Km para NADPH y NADH, se realizaron ensayos utilizando un espectrofotómetro Varian Cary 1G.

Para la determinación de los parámetros para la actividad dependiente de NADPH (presente sólo en DKGRc), se requerían concentraciones más altas tanto de cofactor como de sustrato. En consecuencia, la absorbancia inicial a 340 nm estaba por encima del intervalo lineal del espectrofotóemtro, y el cambio de absorbancia se midió a 385 nm. Debido a que el coeficiente de extinción del NADH a 385 nm era 7,74 veces menos que a 340 nm, los datos de velocidad se ajustaron en consecuencia.

Para la determinación del pH óptimo de las enzimas, se prepararon soluciones de Bis/Tris y Bis/Tris propano 100 mM en incrementos de 0,5 unidades de pH desde pH 5,5 a 9,0. Se ensayaron las enzimas a cada nivel de pH para determinar la actividad óptima.

Se ensayaron las concentraciones de proteína mediante el método de Bradford utilizando el protocolo y el reactivo de Bio-Rad Laboratories con albúmina de suero bovino como patrón.

Se evaluó la estabilidad térmica de cada reductasa a bajas concentraciones de proteína (0,085 mg/ml) en tampón Bis/Tris 100 mM, pH 7,0. Se determinó la semivida a 45ºC incubando alícuotas de 30 \mul de enzima purificada en tubos de PCR de paredes finas a 4ºC. Se cambió rápidamente la temperatura a 45ºC mediante un termociclador Robocycler Gradient 96 (Stratagene Inc.) y se mantuvo a 45ºC durante 0,5, 5, 10, 20, 30 ó 60 minutos antes de devolver la mezcla a 4ºC. Se ensayó cada tubo posteriormente mediante el procedimiento estándar. Se determinó la temperatura de punto medio de inactivación térmica de la DKGRd incubando la enzima durante 10 min en un intervalo de temperaturas definido por el Robocycler. Se programó el Robocycler para llevar muestras desde 4ºC hasta un gradiente de temperaturas definidas en el intervalo de 30-52ºC en incrementos de 2ºC. Después de 10 minutos, se devolvieron las muestras a 4ºC. Se determinó la estabilidad de la DKGRc a 30ºC disponiendo alícuotas de la enzima en tubos de microfuga precalentados en un baño de agua a 30ºC. Se incubaron los tubos durante 1 a 5 horas, se retiraron y se ensayaron. Se determinaron las constantes de velocidad para la pérdida de actividad mediante el ajuste a la ecuación para degradación exponencial utilizando Prism (GraphPad, Inc.). Todas las muestras se ensayaron por duplicado.

Resultados

Previamente, la reducción del ácido 2,5-diceto-D-glucónico mediante extractos que contenían las reductasas ambientales sobreexpresadas era estequiométrica, y proporcionó un producto que comigró con el ácido 2-ceto-L-gulónico en HPLC. Sin embargo, podrían surgir complicaciones en los extractos, y no están disponibles patrones para los cuatro posibles productos formados mediante la reducción del ácido 2,5-diceto-D-glucónico. Por lo tanto, se preparó una solución concentrada de ácido 2,5-diceto-D-glucónico y se convirtió en producto mediante cada reductasa como se describe anteriormente. La concentración de ácido 2,5-diceto-D-glucónico en la mezcla de reacción fue 10 mM. Después de la adición de enzima purificada (40-52 unidades) y un ligero exceso de NADPH respecto al ácido 2,5-diceto-D-glucónico, el análisis por HPLC reveló que todo el ácido 2,5-diceto-D-glucónico se había convertido en un compuesto que coeluía con el ácido 2-ceto-L-gulónico auténtico. Se analizó posteriormente la mezcla de reacción mediante CG-EM. El producto de ambas reacciones tenía un espectro de masas idéntico al del ácido 2-ceto-L-gulónico auténtico (Figura 5). Todos los demás componentes presentes en el cromatograma se identificaron como derivados de componentes del tampón o reactivos de derivatización (datos no mostrados). No se observó otro producto derivado del ácido 2,5-diceto-D-glucónico.

Se determinaron los parámetros cinéticos de las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas ambientales a 30ºC (Tabla 3). Los valores de K_{m} determinados para el ácido 2,5-diceto-D-glucónico fueron 57 y 67 \muM para las formas c y d, respectivamente. Esto valores son mucho menores que los reseñados para las reductasas de Corynebacterium (Sonoyama, T. y K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311-317 (1987)). Las k_{cat} observadas para ambas formas ambientales fueron cercanas a la de la enzima más activa de Corynebacterium (Tabla 3). Como resultado, los valores de k_{cat}/K_{m} calculados fueron mucho mayores para las formas ambientales. Las nuevas ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas tenían eficacias catalíticas más de 20 veces mayores que la forma Corynebacterium de una enzima, y 1000 veces mayores que la enzima de forma b.

TABLA 3 Parámetros cinéticos de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas purificadas

6

Los perfiles de ambas reductasas revelaron una preferencia por el pH ácido, pero se observó una buena actividad a todos los valores de pH inferiores a 7,5 (Figura 6). Ambas enzimas demuestran una actividad óptima a pH 6,0. Esta tendencia se observó para todos los tampones evaluados, pero la actividad variaba dependiendo del tampón utilizado. Los tampones amina tales como Tris y Bis-Tris proporcionaron la mejor actividad. En tampones fosfato y pirofosfato, ambas enzimas fueron aproximadamente un tercio de activas que a pH 6,0. Los tampones sulfonato tales como MES y HEPES proporcionaron actividades intermedias. La preferencia de la DKGRd por el pH ácido fue ligeramente más pronunciada.

Con unas pocas excepciones, las aldo-ceto reductasas son absolutamente específicas de NADPH como cosustrato, incluyendo las ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasas de Corynebacterium (Ratnam, et al., Biochemistry 38(24): 7856-7864 (1999); Todaka, et al., Superfamily Arch. Biochem. Biophys 374(2): 189-197 (2000)). Cuando se fraccionaron extractos de células inducidas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante y se incubaron con NADH o NADPH, se observaron bandas de oxidación dependiente del ácido 2,5-diceto-D-glucónico de ambos cofactores (datos no mostrados). Estas bandas, que estaban ausentes en células no inducidas, se localizaron en la misma posición en el gel, sugiriendo que una enzima catalizaba ambas reacciones. Los análisis de las enzimas purificadas confirmaron que eran responsables de la reacción observada (Figura 7A). Sin embargo, la catálisis era menos eficaz con NADH como cosustrato (Tabla 4). El valor de K_{m} para NADH era casi tres órdenes de magnitud mayor que para NADPH. Los valores de k_{cat} y k_{cat}/K_{m} aparentes eran también mucho menores que los medidos con NADPH como sustrato. La sustitución de NADH por NADPH afectó también drásticamente a la K_{m} aparente para el ácido 2,5-diceto-D-glucónico, aumentando de 17 a 40 veces (Tablas 4 y 5). La actividad dependiente de NADH se potenció mediante la inclusión de fosfato inorgánico en el tampón de reacción (Figura 7B). La estimulación fue saturable, con una K_{m} aparente de 1,3 mM, indicando que el fenómeno era debido a la unión de fosfato inorgánico a la enzima.

TABLA 4 Comparación de parámetros cinéticos con NADH como cofactor

7

Las reductasas de Corynebacterium son algo termolábiles (Powers, D.B. y S. Anderson, patente de EE.UU. 5.795.761 (1998); Sonoyama, T. y K. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311-317 (1987)). Para establecer la estabilidad térmica de las reductasas ambientales, se incubó cada reductasa ambiental a 44ºC durante diversos periodos de tiempo. Se utilizó un ciclador térmico robótico de PCR (Robocycler Gradient 96, Stratagene Inc.) para establecer las temperaturas rápida y precisamente. En estas condiciones, la DKGRc era bastante lábil, perdiendo más de la mitad de su actividad en el primer momento temporal, a 0,5 min. Se estimó su semivida en 0,4 min. En contraste, la DKGRd era relativamente estable en estas condiciones, con una semivida de 53,4 min. La temperatura de inactivación térmica de la DKGRd se determinó incubando la enzima durante 10 minutos con un gradiente de temperatura establecido por el Robocycler (Figura 8). La enzima retenía una actividad casi completa hasta 45ºC, después de lo cual la actividad se reducía rápidamente. Se estimó que la temperatura a la que se perdía la mitad de la actividad en estas condiciones era de 47ºC.

Ejemplo 4 Construcción de mutantes específicos de sitio de reductasa ambiental DKGRc Materiales y métodos

Se construyeron mutantes específicos de sitio de DKGRc mediante PCR de extensión por superposición. Se diseñaron oligonucleótidos para convertir dos residuos cargados positivamente implicados en la unión del 2'-fosfato de adenosina de NADPH, K232 y R238, en residuos neutros. Los oligonucleótidos:

5-ATCAGGGTTCGAAGACTGTGG (SEC ID NO:42)

5-TCTTCGAACCCTGATCAACTTG (SEC ID NO:43)

eran complementarios de las cadenas con sentido y sin sentido, respectivamente, e introdujeron los cambios K232Q y R238Q, respectivamente. Se subrayan las bases que difieren de la secuencia nativa. Se apareó cada oligonucleótido con el cebador adaptador apropiado (concretamente cebadores para amplificar el gen para su inserción en un vector de expresión) en PCR para generar fragmentos del gen DKGRc que incorporaran uno de los dos cambios. Se sintetizaron también cebadores que coincidieran con la secuencia de ADN nativa. Cuando se utilizaron con el cebador adaptador apropiado, estos generan un fragmento no modificado del gen. Los fragmentos de gen se combinaron por parejas en reacciones de PCR de extensión por superposición, proporcionando los mutantes K232Q y R238Q. La amplificación de los genes completos se realizó mediante la adición de ambos cebadores adaptadores. El mutante R238Q se purificó mediante el procedimiento utilizado para la purificación de la DKGRc nativa, pero eluyó en una posición diferente en los gradientes salinos, como se esperaba.

Resultados

Los extractos preparados a partir de muestras inducidas de los mutantes K232Q y R238Q mostraron una fuerte sobreexpresión comparable de la proteína reductasa basándose en electroforesis en gel, pero la actividad dependiente de NADPH se redujo mucho. Se detectó una moderada actividad en extractos del mutante R238Q, pero se observó muy poca actividad para el mutante K232Q. El mutante R238Q se purificó hasta homogeneidad y se analizó cinéticamente (Tabla 5). La K_{m} para NADPH era 18 veces mayor en la reductasa mutante, como se preveía por la retirada de un residuo implicado en la interacción carga-carga con el 2'-fosfato de adenosina. Sin embargo, la actividad máxima de la enzima aumentó en presencia de la mutación, indicado por un aumento de 3,5 veces la k_{cat}. La eficacia catalítica total (con respecto a la K_{m} de NADPH) era un quinto de la enzima nativa.

La K_{m} para NADH, en contraste, no se afectó por la mutación (Tabla 5), sino que se observó un aumento similar de la k_{cat} con NADH como cosustrato. Como resultado, la eficacia catalítica con NADH como cosustrato aumentó 7 veces debido a la mutación. Sin embargo, debido a la K_{m} mucho mayor por NADH, la eficacia de la enzima mutante siguió siendo mucho mayor con NADPH como sustrato incluso después de la mutación. La sustitución de la arginina por glutamina afectó también a la interacción de la enzima con el sustrato, el ácido 2,5-diceto-D-glucónico; su K_{m} aumentó 7,7 veces de 57 a 440 \muM.

TABLA 5 Parámetros cinéticos de DKGRc y su mutante R238Q

8

Claims (19)

1. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10), y en el que el péptido tiene actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia aminoacídica tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

3. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia aminoacídica tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

4. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que dicha secuencia aminoacídica tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, que comprende una secuencia nucleotídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 7) o la Figura 2B (SEC ID Nº 9).

6. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el péptido codificado tiene una Q en una posición correspondiente a la posición 232 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 2A (SEC ID Nº 8).

7. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el péptido codificado tiene una Q en una posición correspondiente a la posición 238 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 2A (SEC ID Nº 8).

8. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicha molécula comprende una secuencia seleccionada de las secuencias indicadas en la Figura 1 (SEC ID Nº 1-6, respectivamente).

9. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 9, en la que dicha célula es Pantoea.

11. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad con una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10), en el que dicho polipéptido tiene actividad ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa.

12. El polipéptido de la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

13. El polipéptido de la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

14. El polipéptido de la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con dicha secuencia aminoacídica de la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o 2B (SEC ID Nº 10).

15. El polipéptido de la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia aminoacídica como se indica en la Figura 2A (SEC ID Nº 8) o la Figura 2B (SEC ID Nº 10).

16. El polipéptido de la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido tiene una Q en una posición correspondiente a la posición 232 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 2A (SEC ID Nº 8).

17. El polipéptido de la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido tiene una Q en una posición correspondiente a la posición 238 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 2A (SEC ID Nº 8).

18. El polipéptido de la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido tiene actividad dependiente de NADH.

19. Un proceso para convertir glucosa en ácido ascórbico que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 en condiciones adecuadas para la expresión de ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa.