JP2003274970A - 新規カルボン酸ＣｏＡ合成酵素およびその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 シュードモナス属に属する微生物由来の新規
カルボン酸ＣｏＡ合成酵素およびその遺伝子、ならびに
これらの利用方法の提供。 【解決手段】 以下の（c）または（d）のDNAからなる
遺伝子、および該遺伝子を利用したカルボン酸ＣｏＡ合
成酵素の製造方法の提供。（c）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｃｈｏｌｏｒｏｒａｐｈｉｓＢ２３のゲノムＤＮＡ
中のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素をコードする塩基配列か
らなるDNA（d）該塩基配列からなるDNAと相補的な塩基
配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性を有す
るタンパク質をコードするDNA。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シュードモナス属
に属する微生物由来の新規カルボン酸ＣｏＡ合成酵素お
よびその遺伝子、ならびに該遺伝子を利用したカルボン
酸ＣｏＡ合成酵素の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、微生物や微生物由来の酵素を
利用して、有用物質を生物学的に工業生産することが行
われている。最近では、特定酵素の遺伝子を単離し、遺
伝子工学的手法を用いて該酵素を大量生産して反応に供
するなど、生物学的生産はさらに拡大している。それゆ
え、微生物から新規酵素や該遺伝子を単離し、その機能
を解析して新しい利用法を探索することは極めて重要と
いえる。

【０００３】ニトリルヒドラターゼは、ニトリル化合物
をアミド化合物へ変化させる酵素として、古くからアク
リルアミド等の工業的生産に利用されている。このニト
リルヒドラターゼ活性の高い菌株としては、例えば、ロ
ドコッカス・ロドクロスＪ−１株（Rhodococcus rhodoc
hrous J-1）や、シュードモナス・クロロラフィスＢ23
株（Pseudomonas chlororaphis B23）等が知られ、その
遺伝子も単離されている。

【０００４】このニトリルヒドラターゼは、微生物のニ
トリル代謝系（ニトリラーゼ系とニトリルヒドラターゼ
系がある）で機能する一連の酵素の１つである。ニトリ
ルヒドラターゼ系では、ニトリル化合物はアミドを経て
カルボン酸に分解され、さらにＣｏＡと結合してカルボ
ン酸ＣｏＡ（アシルＣｏＡ）となり、β酸化系によって
代謝されることが知られている。

【０００５】カルボン酸にＣｏＡを結合させる酵素は、
カルボン酸ＣｏＡ合成酵素（シンセターゼまたはリガー
ゼ）と呼ばれ、大腸菌においては、いくつかの遺伝子が
単離されている（Kumari,S. et al., Cloning, charact
erization, and functionalexpression of acs, the ge
ne which encodes acetyl coenzyme A synthetase in E
scherichia coli J. Bacteriol. 177 (10), 2878-2886
(1995)）、（Black,P.N. et al, Cloning, sequencin
g, and expression of the fadD gene of Escherichia
coli encoding acyl coenzyme A synthetase J. Biol.
Chem. 267 (35), 25513-25520 (1992) ）。カルボン酸
ＣｏＡ合成酵素によって合成されるアセチルＣｏＡ、ア
シルＣｏＡ等のカルボン酸ＣｏＡは、脂質代謝の重要な
中間体でもあるため、該酵素は研究用試薬としての価値
が高い。しかしながら、シュードモナス属微生物由来の
カルボン酸ＣｏＡ合成酵素や該遺伝子については、いま
だ単離されたという報告はない。また、１つの代謝系で
機能する一連の酵素は、それぞれ相互に関連しあうこと
が予測され、ニトリルヒドラターゼ系で機能する他の酵
素の機能解析は、ニトリルヒドラターゼを利用した有用
物質の生産への何らかの応用も期待できる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、シュードモ
ナス属に属する微生物より新規カルボン酸ＣｏＡ合成酵
素をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を利用したカ
ルボン酸ＣｏＡ合成酵素の製造方法を提供することを目
的とする。

【０００７】

【発明を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究し、Pseudomonas chlororaphis
B23のゲノムDNA中、ニトリルヒドラターゼ遺伝子下流
域の配列を探索して、カルボン酸ＣｏＡ合成酵素をコー
ドすると考えられる遺伝子の単離に成功した。そして、
該遺伝子を利用した、カルボン酸ＣｏＡ合成酵素の遺伝
子工学的生産方法を見出し、本発明を完成させた。

【０００８】すなわち、本発明は、以下の（１）〜
（６）を提供するものである。 （１） 以下の（a）または（b）の組換えタンパク質。 （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において1また
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性
を有するタンパク質 （２） 以下の（a）または（b）のタンパク質をコード
する遺伝子。 （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において1また
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性
を有するタンパク質 （３） 以下の（c）または（d）のDNAからなる遺伝
子。 （c）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA （d）配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補
的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活
性を有するタンパク質をコードするシュードモナス属微
生物由来のDNA （４） 請求項２または３記載の遺伝子を含有する、組
換えベクター。 （５） 請求項２または３記載の遺伝子を導入して得ら
れる、形質転換体。 （６） 請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる
培養物からカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性を有するタン
パク質を採取する、カルボン酸ＣｏＡ合成酵素の製造方
法。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 １．本発明のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素遺伝子 （１）カルボン酸ＣｏＡ合成酵素遺伝子 本発明にかかる遺伝子は、カルボン酸コエンザイムＡ
（以下、ＣｏＡと記載する。）合成酵素をコードする、
シュードモナス属に属する微生物由来の遺伝子である。
該遺伝子によってコードされる、カルボン酸ＣｏＡ合成
酵素は、微生物におけるニトリル代謝経路、あるいは脂
質代謝経路で生じるカルボン酸をＣｏＡと結合し、β酸
化の出発物質であるカルボン酸ＣｏＡを合成する（図
１）。

【００１０】本発明において、前記カルボン酸ＣｏＡを
構成する、カルボン酸は、脂肪族カルボン酸であって
も、芳香族カルボン酸であってもよく、また炭素鎖長、
飽和／不飽和のいかんも問わない。該カルボン酸ＣｏＡ
において、各種カルボン酸はそのカルボキシル基とＣｏ
ＡのＳＨ基の間で、チオエステル結合（Ｒ−ＣＯ−Ｓ-
ＣｏＡ）によって結合している。なお、ＣｏＡ（コエン
ザイムＡ）は、補酵素Ａともよばれ、生体内のアシル基
転移反応におけるアシル基担体として機能することが知
られている。

【００１１】（２）カルボン酸ＣｏＡ合成酵素遺伝子の
単離 本発明の遺伝子の存在は、微生物におけるニトリル代謝
経路から予測された。すなわち、微生物のニトリル代謝
系の１つである、ニトリルヒドラターゼ系では、ニトリ
ル化合物からアミド、カルボン酸を経て、カルボン酸Ｃ
ｏＡを生成する。これら一連の反応に関わる酵素の遺伝
子は、染色体上近接して存在すると予測され、したがっ
てニトリルヒドラターゼ系で機能する既知の遺伝子やそ
の周辺領域の塩基配列をプローブとして、ゲノムDNAを
探索すれば、本発明のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素遺伝子
候補を見つけることができる。以下、本発明の遺伝子の
単離について説明する。

【００１２】1) プローブの作製 まず、既知のニトリルヒドラターゼ系で機能する遺伝子
やその周辺領域の塩基配列を基にプローブを作製する。
プローブは既知の配列を基に化学合成してもよいし、あ
るいは前記ニトリルヒドラターゼ系で機能する遺伝子や
その周辺領域がクローニングされている場合は、該領域
DNAを含むプラスミドから、適当な制限酵素を用いて調
製することもできる。

【００１３】例えば、Pseudomonas chlororaphis B23由
来のニトリルヒドラターゼ系に関連する遺伝子のコーデ
ィング領域は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を中心とし
て、その上流域にアミダーゼ遺伝子が、また下流域に約
47kDaのニトリルヒドラターゼアクセリータンパク、機
能未知の２つのORFが存在することがわかっている（図
２）。そこで、この下流域のORFをカルボン酸ＣｏＡ合
成酵素遺伝子候補の標的として、図２に示すよう、ニト
リルヒドラターゼ遺伝子の3'側領域の「SacIおよびSalI
切断部位に挟まれた領域」をプローブ配列として選択す
る。

【００１４】2) プローブによる検索 次に、得られたプローブを用いて、シュードモナス属に
属する微生物のゲノムDNAライブラリーあるいはゲノムD
NAを検索する。前記ゲノムDNAライブラリーは、常法に
従い、微生物より抽出したゲノムDNAを制限酵素で部分
分解後、プラスミド、λファージ等の適当なベクターに
連結して作製することができる。DNAライブラリーの検
索は、該ライブラリーを導入した大腸菌に対し、前記プ
ローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行う
ことにより実施できる。目的とするクローンを含むコロ
ニーが特定できれば、これより本発明の遺伝子を含むDN
A断片を回収すればよい。

【００１５】また、目的とする遺伝子領域付近の配列や
制限酵素切断部位がある程度わかっている場合は、微生
物より抽出したゲノムDNAを対象として検索することが
できる。すなわち、目的とする遺伝子領域を含むように
ゲノムDNAを制限酵素で切断後、得られた断片を電気泳
動により分離し、前記プローブを用いてサザン・ハイブ
リダイゼーションを行えばよい。目的とするDNA断片が
特定できれば、これをpUC18等の適当なベクターにサブ
クローニングする。

【００１６】3） 塩基配列の決定 本発明の遺伝子を含むDNAがクローニングできたら、該D
NAの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-
ギルバートの化学修飾法、またはM13ファージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等、公知の手法により
行うことができるが、自動塩基配列解析装置（PERKIN-E
LMER社製等）を用いる方法が簡便で好ましい。

【００１７】次に、本発明の遺伝子を含むDNAの塩基配
列から、該DNA中のORF領域が特定できれば、このORF領
域を本発明の遺伝子候補として選択する。得られた本発
明の遺伝子候補は、後述する既知のカルボン酸ＣｏＡ合
成酵素とのホモロジー検索、あるいは、該遺伝子の発現
実験により、目的とする新規カルボン酸ＣｏＡ合成酵素
であることを確認する。

【００１８】4) ホモロジー検索 前記ORF領域、すなわち本発明の遺伝子候補のアミノ配
列について、ＮＣＢＩ等のタンパク質データベースを対
象として、既知のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素、例えば、
大腸菌由来のアセチルＣｏＡ合成酵素(Acetyl-CoA synt
hetase)、アシルＣｏＡ合成酵素(Acyl-CoA synthetas
e)、Rhodopseudomonas palustris由来の４−ヒドロキシ
安息香酸−ＣｏＡリガーゼ等、との相同性を調べる。こ
れら既知のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素との相同性がかな
り高い場合は、前記ORF領域は目的とするカルボン酸Ｃ
ｏＡ合成酵素遺伝子である可能性が高いと推定できる。

【００１９】２．組換えベクター 本発明の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベク
ターに本発明の遺伝子を連結（挿入）して得ることがで
きる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば
特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等
が挙げられる。

【００２０】前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来
のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC11
9, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド
（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、フ
ァージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。

【００２１】前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクロー
ニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用
される。

【００２２】宿主内で外来遺伝子を発現させるために
は、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させ
る必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿
主内で機能することが知られている任意のものを用いる
ことができる。なおプロモーターについては、後述する
形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要
であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシ
ングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配
列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよ
い。

【００２３】３．形質転換体 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的
遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによっ
て得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDN
Aを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、
エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシ
ェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudom
onas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メ
リロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属
する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharo
myces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Sch
izosaccharomyces. pombe）等の酵母、その他COS細胞、
CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細
胞を挙げることができる。

【００２４】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であると
ともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝
子、転写終結配列により構成されていることが望まし
い。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
ても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. c
oli）K12、DH1、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としては
バチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21
等が挙げられる。大腸菌等の宿主で発現できるものであ
れば特に限定されず、例えばtrpプロモーター、lacプロ
モーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌
由来のプロモータを用いることができる。

【００２５】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されない
が、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN
et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (197
2)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【００２６】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セルビシエ（S. cervisiae）、チゾサッカロミ
セス・ポンベ（Shizosaccharomyces. pombe）、ピヒア
・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。こ
の場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、
例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒート
ショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモータ
ー、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げるこ
とができる。

【００２７】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. e
t al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、ス
フェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. A
cad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法
（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を
挙げることができる。

【００２８】４．本発明のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素の
製造 本発明の酵素は、本発明の形質転換体を適当な培地で培
養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を
採取することによって得ることができる。本発明の形質
転換体を培養する方法は、宿主に応じて、常法に従って
行えばよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主と
する形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、
窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培
養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを
用いても良い。

【００２９】培養中は必要に応じてアンピシリンやテト
ラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プ
ロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてイ
ンデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプ
ロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物
を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラ
ノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベ
クターで形質転換した微生物を培養する場合は、インド
ールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。

【００３０】培養後、本発明の酵素タンパク質が菌体内
または細胞内に生産される場合は、菌体内または細胞を
破砕する。一方、本発明のタンパク質が菌体外または細
胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、
遠心分離等によって回収する。タンパク質の単離・精製
には、例えば硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用い
ればよい。

【００３１】また本発明のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活
性の確認は、適当な脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン
酸およびＣｏＡを含む基質に該酵素に添加し、その反応
をみればよい。あるいは、本発明のカルボン酸ＣｏＡ合
成酵素に特異的に結合する抗体を作製し、該抗体を用い
たウェスタンブロッティングによって発現を確認するこ
ともできる。

【００３２】５．本発明の遺伝子と酵素タンパク質の範
囲 かくして、Pseudomonas chlororaphis B23のゲノムDNA
より単離された、本発明のカルボン酸ＣｏＡ合成酵素の
塩基配列を配列番号１に、またそのアミノ酸配列を配列
番号２に示す。

【００３３】しかしながら、本発明にかかるカルボン酸
ＣｏＡ合成酵素タンパク質をコードする遺伝子は、上記
配列に限定されず、この遺伝子（配列番号1）とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる
他の遺伝子も、該遺伝子がカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活
性を有する限り、本発明の遺伝子に含まれるものとす
る。なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が300-2000mMで温度が40-75℃、好ましくは
ナトリウム濃度が600-900mMで温度が65℃の条件をい
う。

【００３４】また、本発明の組換えタンパク質も、上記
配列（配列番号２）に限定されず、本発明のカルボン酸
ＣｏＡ合成酵素活性を有する限り、前記アミノ酸配列に
おいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
加された他のアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発
明の組換えタンパク質に含まれるものとする。かかる欠
失、置換、付加等の変異の数は、全アミノ酸数に対して
好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。

【００３５】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではな
い。 [実施例１] Pseudomonas chlororaphis B23株ニトリル
ヒドラターゼ遺伝子下流域のXhoI断片の取得 （１）pPCN4の調製 ニトリルヒドラターゼ遺伝子近傍の配列を含むプラスミ
ドpPCN4を、これを含む大腸菌JM105/pPCN4株（寄託番号
FERM BP-2779；特開平３−２５１１８４号）より、常法
に従って調製した。

【００３６】（２）プローブの調製 プラスミドpPCN4を制限酵素SacIおよびSalIで消化し、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した。ア
ガロースゲルを臭化エチジウム染色後、約2.4 kbの Sac
I-SalI断片を含むバンドを切り出した。このゲル片より
MagExtractor -PCR &Gel Clean up-キット（東洋紡社）
を用いて、約2.4kbのSacI-SalI断片を抽出し、これをプ
ローブとした（図２参照）。

【００３７】（３）XhoI断片の取得 Pseudomonas chlororaphis B23株より、常法に従い、染
色体DNAを調製した。この染色体DNAを制限酵素XhoIで消
化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、上記（２）
で作製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その結果、約５ｋｂの位置に強いシグナ
ルが検出された。そこで、この約５ｋｂのDNA断片を含
むバンドを切り出し、ゲル片よりXhoI断片を回収した。

【００３８】（４）クローニング 得られたXhoI断片を、制限酵素SalIで切断したpUC18と
を連結させ、XhoI断片を含むプラスミドライブラリーを
作製した。これらを大腸菌DH10B株に導入し、得られた
形質転換体を培養し、上記プローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行い、陽性クローンを選択し
た。このプラスミドをpPCN4Xと命名した。

【００３９】[実施例２] カルボン酸ＣｏＡ合成酵素遺
伝子候補の検索 （１）XhoI断片の塩基配列の決定 実施例１で得られた陽性クローンからプラスミドpPCN4X
を抽出し、プラスミド中の挿入断片（XhoI断片）の塩基
配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号３に示
す。この配列中にはプローブとして用いたSacI-SalI断
片の塩基配列の一部が含まれており、目的の断片である
ことが確認できた。

【００４０】（２）新規オープンリーディングフレーム
（OrfF）のホモロジー検索 XhoI断片の塩基配列（配列番号３）を解析し、この中に
545のアミノ酸からなるオープンリーディングフレーム
（OrfF）を見いだした。OrfFの塩基配列を配列番号１
に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。OrfFのアミノ酸
配列（配列番号２）について、NCBIのタンパク質データ
ベースを対象としてホモロジー検索をしたところ、大腸
菌由来のアセチルCoA合成酵素(Acetyl-CoA synthetase)
と30%の相同性、アシルCoA合成酵素(Acyl-CoA syntheta
se)と25%の相同性、Rhodopseudomonas palustris由来の
４−ヒドロキシ安息香酸−CoAリガーゼと29%の相同性を
示した（図３）。

【００４１】[実施例３] OrfF（カルボン酸ＣｏＡ合成
酵素遺伝子）の発現 （１）制限酵素部位を導入したOrfF断片の増幅 実施例２で作製したpPCN4Xを鋳型として、制限酵素部位
EcoRI、NdeIを導入したセンスプライマー、および制限
酵素部位BamHIを導入したアンチセンスプライマーを用
いたＰＣＲにより、OrfFを増幅した。用いたプライマー
の塩基配列を以下に、またその構造を図４に示す。 Sense Primer: 5'-GGAATTCTAAGGAGGAATAGCATATGCGCGATT
ATGAACACGTTGTTG-3'（配列番号４） Antisense primer: 5'-CGGGATCCTTAACCAAGCGCCTGTTGCTT
GGCA-3'（配列番号５）

【００４２】（２）発現ベクターの構築 得られた増幅断片を回収し、制限酵素NdeIおよびBamHI
で処理後、同じく制限酵素NdeIおよびBamHIで処理した
発現用ベクターpET24a(+)に連結することにより、カル
ボン酸ＣｏＡ合成酵素遺伝子と考えられるOrfF発現用プ
ラスミド（pET24a(+)::OrfF）を構築した。

【００４３】（３）形質転換体による発現実験 次いで、pET24a(+)またはpET24a(+)::orfFを大腸菌BL21
-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）に導入し、
得られた形質転換体を用いて発現実験を行った。すなわ
ち、形質転換体よりタンパクを抽出し、SDS-PAGEにより
分離したところ、OrfFを含まないプラスミドpET-21a(+)
が導入された大腸菌では見られず、OrfFを含むプラスミ
ドpET24a(+)::orfFが導入された大腸菌でのみ現れる、
約60kDaのバンドが検出された（図５）。このサイズ60k
Daのタンパクは、37℃、IPTG 0.1 mMで形質転換体を培
養した場合は、すべてインクルージョンボディを形成
し、不溶性画分に発現した。しかし、28℃、IPTG 0.1 m
Mで培養を行った場合は、可溶性画分に発現していた。

【００４４】

【発明の効果】本発明は、シュードモナス属に属する微
生物由来の新規カルボン酸ＣｏＡ合成酵素およびその遺
伝子を提供する。該カルボン酸ＣｏＡ合成酵素やその遺
伝子は、微生物の代謝経路の解明や、ニトリルヒドラタ
ーゼ系を利用した生産系に有用である。

【００４５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co. Ltd. <120> New Carboxylic acid - CoA Lygase and Genes thereof <130> P02-0201 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1638 <212> DNA <213> Pseudomonas chlororaphis <220> <221> CDS <222> (1)..(1638) <400> 1 atg cgc gat tat gaa cac gtt gtt gaa tcc ttc gat tat ctg cag agc 48 Met Arg Asp Tyr Glu His Val Val Glu Ser Phe Asp Tyr Leu Gln Ser 1 5 10 15 gcc acc cag gat ttg cat ggc gaa ctt act gct ttg aac gcc tgc gtc 96 Ala Thr Gln Asp Leu His Gly Glu Leu Thr Ala Leu Asn Ala Cys Val 20 25 30 gaa tgc tgc gac cgg cat gcc cac ggc gag gcc gtg gcg ttg tat tgc 144 Glu Cys Cys Asp Arg His Ala His Gly Glu Ala Val Ala Leu Tyr Cys 35 40 45 gaa gcg cag gat ggc cat gcc gag cgc tac agg ttt cgc gac ctg caa 192 Glu Ala Gln Asp Gly His Ala Glu Arg Tyr Arg Phe Arg Asp Leu Gln 50 55 60 cgc cag gcg gcg cgc ttc ggc aat ttc ttg cgt gaa caa ggc gtc aag 240 Arg Gln Ala Ala Arg Phe Gly Asn Phe Leu Arg Glu Gln Gly Val Lys 65 70 75 80 ccg ggc gat cgc gtc gcc ggc ctg atg cca cgc acg gtt gaa ctg ttg 288 Pro Gly Asp Arg Val Ala Gly Leu Met Pro Arg Thr Val Glu Leu Leu 85 90 95 att gcc att ttg ggc acc tgg cgc atc ggc gcg gtc tac caa ccg ctg 336 Ile Ala Ile Leu Gly Thr Trp Arg Ile Gly Ala Val Tyr Gln Pro Leu 100 105 110 ttt acg gcc ttc ggc ccc aag gcc atc gaa caa cgc ttg aac tgc tcg 384 Phe Thr Ala Phe Gly Pro Lys Ala Ile Glu Gln Arg Leu Asn Cys Ser 115 120 125 aac gcc cgc tgg atc gtg acc gac ccg cac aac cgt ccg aag ctg gac 432 Asn Ala Arg Trp Ile Val Thr Asp Pro His Asn Arg Pro Lys Leu Asp 130 135 140 gac gtc act gac tgc ccc agc atc gtt gtg acc ggt ggc gcc cca cag 480 Asp Val Thr Asp Cys Pro Ser Ile Val Val Thr Gly Gly Ala Pro Gln 145 150 155 160 aac ccc gct gat cac cac ttc tgg agc gca ctg aac cgc cag gct gac 528 Asn Pro Ala Asp His His Phe Trp Ser Ala Leu Asn Arg Gln Ala Asp 165 170 175 gat tgc gcg ccg gtg ctg ctg gat gcc agt gcg ccg ttc ctg ttg atg 576 Asp Cys Ala Pro Val Leu Leu Asp Ala Ser Ala Pro Phe Leu Leu Met 180 185 190 tgt acc tct ggc acc acg ggg ccg gcc aaa ccg ctg gag gtg ccg tta 624 Cys Thr Ser Gly Thr Thr Gly Pro Ala Lys Pro Leu Glu Val Pro Leu 195 200 205 agc gcg att ctg gcc ttc aag ggc tat atg cgt gat gcg att gac ttg 672 Ser Ala Ile Leu Ala Phe Lys Gly Tyr Met Arg Asp Ala Ile Asp Leu 210 215 220 cgt gcg gac gac cgc ttc tgg aac ctg gct gac ccg ggt tgg gcc tat 720 Arg Ala Asp Asp Arg Phe Trp Asn Leu Ala Asp Pro Gly Trp Ala Tyr 225 230 235 240 ggt ttg tat tac gcg gtg acc ggc ccg ctg gct tgt ggg tac gca acg 768 Gly Leu Tyr Tyr Ala Val Thr Gly Pro Leu Ala Cys Gly Tyr Ala Thr 245 250 255 ctg ttc tac gac ggc ccc ttc acg gtg gaa agt acc cgt cac atc att 816 Leu Phe Tyr Asp Gly Pro Phe Thr Val Glu Ser Thr Arg His Ile Ile 260 265 270 gcc aag tac gca atc aac aac ctg gcc ggt tcg ccc acc gcc tac cgc 864 Ala Lys Tyr Ala Ile Asn Asn Leu Ala Gly Ser Pro Thr Ala Tyr Arg 275 280 285 ttc ctg atc gcc gcg ggg gcc gag ttc gcc gac gcc gtt cgt ggg cgc 912 Phe Leu Ile Ala Ala Gly Ala Glu Phe Ala Asp Ala Val Arg Gly Arg 290 295 300 ctg cgg gcc gtc agc agc gcc gga gaa ccg ctc aac ccg caa gtc gtg 960 Leu Arg Ala Val Ser Ser Ala Gly Glu Pro Leu Asn Pro Gln Val Val 305 310 315 320 cgg tgg ttt gcc gaa cag ctt ggc gtg gtg att cac gac cac tac ggg 1008 Arg Trp Phe Ala Glu Gln Leu Gly Val Val Ile His Asp His Tyr Gly 325 330 335 caa acg gaa atc ggc atg gtg ctg tgc aat cac cac ggt ttg cgt cac 1056 Gln Thr Glu Ile Gly Met Val Leu Cys Asn His His Gly Leu Arg His 340 345 350 ccg gtc cgc gaa ggc tca gcg ggt tat gcg gtg ccc gga tac cgc atc 1104 Pro Val Arg Glu Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Val Pro Gly Tyr Arg Ile 355 360 365 gtc gtg ttg gat aag gca cac cgg gaa ttg cca gcc ggc cag ccg ggc 1152 Val Val Leu Asp Lys Ala His Arg Glu Leu Pro Ala Gly Gln Pro Gly 370 375 380 gta ctg gcc gtt gat cgc gag cgc tcg ccg ttg tgc tgg ttc gac ggc 1200 Val Leu Ala Val Asp Arg Glu Arg Ser Pro Leu Cys Trp Phe Asp Gly 385 390 395 400 tac ctc ggc atg ccc acc cag gcc ttt gca ggg cgc tat tac ctg agc 1248 Tyr Leu Gly Met Pro Thr Gln Ala Phe Ala Gly Arg Tyr Tyr Leu Ser 405 410 415 ggc gat att gtg gag ctc aat gac gac ggc agt atc agc ttc gtc ggc 1296 Gly Asp Ile Val Glu Leu Asn Asp Asp Gly Ser Ile Ser Phe Val Gly 420 425 430 cgc aat gat gac ctg att acc acg tcc ggc tac cgc gtc ggg ccg ttc 1344 Arg Asn Asp Asp Leu Ile Thr Thr Ser Gly Tyr Arg Val Gly Pro Phe 435 440 445 gat gtg gaa agc gcg ctg atc gaa cac cca gcg gtg gtc gag gcg gcc 1392 Asp Val Glu Ser Ala Leu Ile Glu His Pro Ala Val Val Glu Ala Ala 450 455 460 gtg atc ggc aaa ccc gat ccg caa cgc acc gag ttg ata aag gcg ttt 1440 Val Ile Gly Lys Pro Asp Pro Gln Arg Thr Glu Leu Ile Lys Ala Phe 465 470 475 480 gtc gtg ctg aac aca ccc tac ctg cca agc cct gag ttg gcg gag gaa 1488 Val Val Leu Asn Thr Pro Tyr Leu Pro Ser Pro Glu Leu Ala Glu Glu 485 490 495 ctg cgc ctg cat gta cgc cag cgt cta gcc gca cat gct tat ccg cgg 1536 Leu Arg Leu His Val Arg Gln Arg Leu Ala Ala His Ala Tyr Pro Arg 500 505 510 gaa atg gag ttt gtc gac cat ctg ccc aag acc cca agt ggc aag ttg 1584 Glu Met Glu Phe Val Asp His Leu Pro Lys Thr Pro Ser Gly Lys Leu 515 520 525 caa cgg ttc att ctg cgc aac cag gag att gcc aag caa cag gcg ctt 1632 Gln Arg Phe Ile Leu Arg Asn Gln Glu Ile Ala Lys Gln Gln Ala Leu 530 535 540 ggt taa 1638 Gly 545 <210> 2 <211> 545 <212> PRT <213> Pseudomonas chlororaphis <400> 2 Met Arg Asp Tyr Glu His Val Val Glu Ser Phe Asp Tyr Leu Gln Ser 1 5 10 15 Ala Thr Gln Asp Leu His Gly Glu Leu Thr Ala Leu Asn Ala Cys Val 20 25 30 Glu Cys Cys Asp Arg His Ala His Gly Glu Ala Val Ala Leu Tyr Cys 35 40 45 Glu Ala Gln Asp Gly His Ala Glu Arg Tyr Arg Phe Arg Asp Leu Gln 50 55 60 Arg Gln Ala Ala Arg Phe Gly Asn Phe Leu Arg Glu Gln Gly Val Lys 65 70 75 80 Pro Gly Asp Arg Val Ala Gly Leu Met Pro Arg Thr Val Glu Leu Leu 85 90 95 Ile Ala Ile Leu Gly Thr Trp Arg Ile Gly Ala Val Tyr Gln Pro Leu 100 105 110 Phe Thr Ala Phe Gly Pro Lys Ala Ile Glu Gln Arg Leu Asn Cys Ser 115 120 125 Asn Ala Arg Trp Ile Val Thr Asp Pro His Asn Arg Pro Lys Leu Asp 130 135 140 Asp Val Thr Asp Cys Pro Ser Ile Val Val Thr Gly Gly Ala Pro Gln 145 150 155 160 Asn Pro Ala Asp His His Phe Trp Ser Ala Leu Asn Arg Gln Ala Asp 165 170 175 Asp Cys Ala Pro Val Leu Leu Asp Ala Ser Ala Pro Phe Leu Leu Met 180 185 190 Cys Thr Ser Gly Thr Thr Gly Pro Ala Lys Pro Leu Glu Val Pro Leu 195 200 205 Ser Ala Ile Leu Ala Phe Lys Gly Tyr Met Arg Asp Ala Ile Asp Leu 210 215 220 Arg Ala Asp Asp Arg Phe Trp Asn Leu Ala Asp Pro Gly Trp Ala Tyr 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Tyr Ala Val Thr Gly Pro Leu Ala Cys Gly Tyr Ala Thr 245 250 255 Leu Phe Tyr Asp Gly Pro Phe Thr Val Glu Ser Thr Arg His Ile Ile 260 265 270 Ala Lys Tyr Ala Ile Asn Asn Leu Ala Gly Ser Pro Thr Ala Tyr Arg 275 280 285 Phe Leu Ile Ala Ala Gly Ala Glu Phe Ala Asp Ala Val Arg Gly Arg 290 295 300 Leu Arg Ala Val Ser Ser Ala Gly Glu Pro Leu Asn Pro Gln Val Val 305 310 315 320 Arg Trp Phe Ala Glu Gln Leu Gly Val Val Ile His Asp His Tyr Gly 325 330 335 Gln Thr Glu Ile Gly Met Val Leu Cys Asn His His Gly Leu Arg His 340 345 350 Pro Val Arg Glu Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Val Pro Gly Tyr Arg Ile 355 360 365 Val Val Leu Asp Lys Ala His Arg Glu Leu Pro Ala Gly Gln Pro Gly 370 375 380 Val Leu Ala Val Asp Arg Glu Arg Ser Pro Leu Cys Trp Phe Asp Gly 385 390 395 400 Tyr Leu Gly Met Pro Thr Gln Ala Phe Ala Gly Arg Tyr Tyr Leu Ser 405 410 415 Gly Asp Ile Val Glu Leu Asn Asp Asp Gly Ser Ile Ser Phe Val Gly 420 425 430 Arg Asn Asp Asp Leu Ile Thr Thr Ser Gly Tyr Arg Val Gly Pro Phe 435 440 445 Asp Val Glu Ser Ala Leu Ile Glu His Pro Ala Val Val Glu Ala Ala 450 455 460 Val Ile Gly Lys Pro Asp Pro Gln Arg Thr Glu Leu Ile Lys Ala Phe 465 470 475 480 Val Val Leu Asn Thr Pro Tyr Leu Pro Ser Pro Glu Leu Ala Glu Glu 485 490 495 Leu Arg Leu His Val Arg Gln Arg Leu Ala Ala His Ala Tyr Pro Arg 500 505 510 Glu Met Glu Phe Val Asp His Leu Pro Lys Thr Pro Ser Gly Lys Leu 515 520 525 Gln Arg Phe Ile Leu Arg Asn Gln Glu Ile Ala Lys Gln Gln Ala Leu 530 535 540 Gly 545 <210> 3 <211> 4817 <212> DNA <213> Pseudomonas chlororaphis <220> <221> CDS <222> (1849)..(3486) <400> 3 ctcgagtttc tacagaagcc ctggcacaac ggtcgcttgt tgcgcagcaa aggttacttc 60 tggctcgcca gccgccacct ggaaatcggc ctgctggcgc aaagcggcaa gcagttccag 120 tgggattatg tcgggcgctg gtggaacttc atcgagccat cgcaatggcc gcgggacgaa 180 tatcggttgc agggcatcat ggccaagtgg gacagcgttg tcggcgactg ccgacaggag 240 ctggtcttca tcggccaggg gctcgacacc cgcgtcttgc agcgcgaact cgaccattgt 300 ttgctgagtg cccaggaaat agccgccggc ccactggcct ggcaggccct gccggcggcg 360 acggcctttg acaccgaggc cttatcggca cgccccacgc cccccatggc ggttcaaccg 420 acttgacctg gtagaggtac accatgctct tttttagccg taccacccgc tgggtcttgg 480 cgccgcttgc cgacagactg gaccagcctg accaggcatg cacgccgttg tcgtcgaaca 540 accctttgtt gcgacgcatc ctgaccggcg tcgagcaatt actgcaagag cgcagcgccc 600 tgaaagaaca ggcacgcgcg ctgacacagg aagtcaccca actggacgag cgcgtggcct 660 gccgtgacgc gcttttgcgg caatgggagg ctcgctgggc cctggtcagc cacggcgcag 720 gtgaactgtt ctgggagctg gaggtgaatg gaaccgctgc accgtcactg gcatgcgcaa 780 tgaggtggac ggggtctgcg tcgatcctgg ctccgggcat tgatcagctt ggccattgga 840 acgaacagct ccatccggcc gaccgtcaac gccatttgga taccctcgcc aggcacctgg 900 ccgatcgcag cgggcgtacg ccgtttgtgt tggacgtgcg gatacagccc ccatcgggcg 960 acgactatcg ctggtgcagg atcagcggtg attcacgccg cgatgcgcaa ggcctgcctg 1020 tggcgatggg tggcagcctg cgggacattc accaacaaca cctgcaagac gaggtgctgg 1080 aactggcggc gacacgcttc gacatctccc gggaaatgct ccatgacggg ctctgggata 1140 tcgaggtcgt ggccggcgac ccggcgaacc cgaaaaatac catctggtgg tcatcgcaaa 1200 tgcgtcgact gctggggtac accacggtcg aggagtttcc caatacattg gaaagctgga 1260 cctcgcgcct gcaccccgac gacagcgaac gggctatcgc tgcgttcgtc gcccatgtcg 1320 acgaccgcag cggcaaaaca ccgtttgacg tggattatcg actcaagcac aacaacggca 1380 cttaccgctg gtttcgcggc cgcggccaaa cccggcgcgc ggacgatggc tccccgcaaa 1440 gagtcgtggg cgccattacg gatatccatg ccagccatga agagcgtgcg ctgcgcgagg 1500 ctcaggaaca gcaacaccgc atgatgcagg aaaccttgag caagctgacg cagattgtcg 1560 ccaccatcca gggcatcgcc agccagacca acctcctggc gctgaacgca gccattgagg 1620 ctgcgcgcgc aggcgaagcc ggacgcggct tcgcagtggt cgccgatgaa gtccgcaagt 1680 tggccacgcg aaccagccag gccacccagc aagcagccga catgatggac ggctagcccc 1740 atgaacacac cccaggcggt ggcgacagcc agccgttgcc atgcctgcat gtacaggctg 1800 ctggggtttt cgcaagaccg atccccacaa taataatcag gtgtcgat atg cgc gat 1857 Met Arg Asp 1 tat gaa cac gtt gtt gaa tcc ttc gat tat ctg cag agc gcc acc cag 1905 Tyr Glu His Val Val Glu Ser Phe Asp Tyr Leu Gln Ser Ala Thr Gln 5 10 15 gat ttg cat ggc gaa ctt act gct ttg aac gcc tgc gtc gaa tgc tgc 1953 Asp Leu His Gly Glu Leu Thr Ala Leu Asn Ala Cys Val Glu Cys Cys 20 25 30 35 gac cgg cat gcc cac ggc gag gcc gtg gcg ttg tat tgc gaa gcg cag 2001 Asp Arg His Ala His Gly Glu Ala Val Ala Leu Tyr Cys Glu Ala Gln 40 45 50 gat ggc cat gcc gag cgc tac agg ttt cgc gac ctg caa cgc cag gcg 2049 Asp Gly His Ala Glu Arg Tyr Arg Phe Arg Asp Leu Gln Arg Gln Ala 55 60 65 gcg cgc ttc ggc aat ttc ttg cgt gaa caa ggc gtc aag ccg ggc gat 2097 Ala Arg Phe Gly Asn Phe Leu Arg Glu Gln Gly Val Lys Pro Gly Asp 70 75 80 cgc gtc gcc ggc ctg atg cca cgc acg gtt gaa ctg ttg att gcc att 2145 Arg Val Ala Gly Leu Met Pro Arg Thr Val Glu Leu Leu Ile Ala Ile 85 90 95 ttg ggc acc tgg cgc atc ggc gcg gtc tac caa ccg ctg ttt acg gcc 2193 Leu Gly Thr Trp Arg Ile Gly Ala Val Tyr Gln Pro Leu Phe Thr Ala 100 105 110 115 ttc ggc ccc aag gcc atc gaa caa cgc ttg aac tgc tcg aac gcc cgc 2241 Phe Gly Pro Lys Ala Ile Glu Gln Arg Leu Asn Cys Ser Asn Ala Arg 120 125 130 tgg atc gtg acc gac ccg cac aac cgt ccg aag ctg gac gac gtc act 2289 Trp Ile Val Thr Asp Pro His Asn Arg Pro Lys Leu Asp Asp Val Thr 135 140 145 gac tgc ccc agc atc gtt gtg acc ggt ggc gcc cca cag aac ccc gct 2337 Asp Cys Pro Ser Ile Val Val Thr Gly Gly Ala Pro Gln Asn Pro Ala 150 155 160 gat cac cac ttc tgg agc gca ctg aac cgc cag gct gac gat tgc gcg 2385 Asp His His Phe Trp Ser Ala Leu Asn Arg Gln Ala Asp Asp Cys Ala 165 170 175 ccg gtg ctg ctg gat gcc agt gcg ccg ttc ctg ttg atg tgt acc tct 2433 Pro Val Leu Leu Asp Ala Ser Ala Pro Phe Leu Leu Met Cys Thr Ser 180 185 190 195 ggc acc acg ggg ccg gcc aaa ccg ctg gag gtg ccg tta agc gcg att 2481 Gly Thr Thr Gly Pro Ala Lys Pro Leu Glu Val Pro Leu Ser Ala Ile 200 205 210 ctg gcc ttc aag ggc tat atg cgt gat gcg att gac ttg cgt gcg gac 2529 Leu Ala Phe Lys Gly Tyr Met Arg Asp Ala Ile Asp Leu Arg Ala Asp 215 220 225 gac cgc ttc tgg aac ctg gct gac ccg ggt tgg gcc tat ggt ttg tat 2577 Asp Arg Phe Trp Asn Leu Ala Asp Pro Gly Trp Ala Tyr Gly Leu Tyr 230 235 240 tac gcg gtg acc ggc ccg ctg gct tgt ggg tac gca acg ctg ttc tac 2625 Tyr Ala Val Thr Gly Pro Leu Ala Cys Gly Tyr Ala Thr Leu Phe Tyr 245 250 255 gac ggc ccc ttc acg gtg gaa agt acc cgt cac atc att gcc aag tac 2673 Asp Gly Pro Phe Thr Val Glu Ser Thr Arg His Ile Ile Ala Lys Tyr 260 265 270 275 gca atc aac aac ctg gcc ggt tcg ccc acc gcc tac cgc ttc ctg atc 2721 Ala Ile Asn Asn Leu Ala Gly Ser Pro Thr Ala Tyr Arg Phe Leu Ile 280 285 290 gcc gcg ggg gcc gag ttc gcc gac gcc gtt cgt ggg cgc ctg cgg gcc 2769 Ala Ala Gly Ala Glu Phe Ala Asp Ala Val Arg Gly Arg Leu Arg Ala 295 300 305 gtc agc agc gcc gga gaa ccg ctc aac ccg caa gtc gtg cgg tgg ttt 2817 Val Ser Ser Ala Gly Glu Pro Leu Asn Pro Gln Val Val Arg Trp Phe 310 315 320 gcc gaa cag ctt ggc gtg gtg att cac gac cac tac ggg caa acg gaa 2865 Ala Glu Gln Leu Gly Val Val Ile His Asp His Tyr Gly Gln Thr Glu 325 330 335 atc ggc atg gtg ctg tgc aat cac cac ggt ttg cgt cac ccg gtc cgc 2913 Ile Gly Met Val Leu Cys Asn His His Gly Leu Arg His Pro Val Arg 340 345 350 355 gaa ggc tca gcg ggt tat gcg gtg ccc gga tac cgc atc gtc gtg ttg 2961 Glu Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Val Pro Gly Tyr Arg Ile Val Val Leu 360 365 370 gat aag gca cac cgg gaa ttg cca gcc ggc cag ccg ggc gta ctg gcc 3009 Asp Lys Ala His Arg Glu Leu Pro Ala Gly Gln Pro Gly Val Leu Ala 375 380 385 gtt gat cgc gag cgc tcg ccg ttg tgc tgg ttc gac ggc tac ctc ggc 3057 Val Asp Arg Glu Arg Ser Pro Leu Cys Trp Phe Asp Gly Tyr Leu Gly 390 395 400 atg ccc acc cag gcc ttt gca ggg cgc tat tac ctg agc ggc gat att 3105 Met Pro Thr Gln Ala Phe Ala Gly Arg Tyr Tyr Leu Ser Gly Asp Ile 405 410 415 gtg gag ctc aat gac gac ggc agt atc agc ttc gtc ggc cgc aat gat 3153 Val Glu Leu Asn Asp Asp Gly Ser Ile Ser Phe Val Gly Arg Asn Asp 420 425 430 435 gac ctg att acc acg tcc ggc tac cgc gtc ggg ccg ttc gat gtg gaa 3201 Asp Leu Ile Thr Thr Ser Gly Tyr Arg Val Gly Pro Phe Asp Val Glu 440 445 450 agc gcg ctg atc gaa cac cca gcg gtg gtc gag gcg gcc gtg atc ggc 3249 Ser Ala Leu Ile Glu His Pro Ala Val Val Glu Ala Ala Val Ile Gly 455 460 465 aaa ccc gat ccg caa cgc acc gag ttg ata aag gcg ttt gtc gtg ctg 3297 Lys Pro Asp Pro Gln Arg Thr Glu Leu Ile Lys Ala Phe Val Val Leu 470 475 480 aac aca ccc tac ctg cca agc cct gag ttg gcg gag gaa ctg cgc ctg 3345 Asn Thr Pro Tyr Leu Pro Ser Pro Glu Leu Ala Glu Glu Leu Arg Leu 485 490 495 cat gta cgc cag cgt cta gcc gca cat gct tat ccg cgg gaa atg gag 3393 His Val Arg Gln Arg Leu Ala Ala His Ala Tyr Pro Arg Glu Met Glu 500 505 510 515 ttt gtc gac cat ctg ccc aag acc cca agt ggc aag ttg caa cgg ttc 3441 Phe Val Asp His Leu Pro Lys Thr Pro Ser Gly Lys Leu Gln Arg Phe 520 525 530 att ctg cgc aac cag gag att gcc aag caa cag gcg ctt ggt taa 3486 Ile Leu Arg Asn Gln Glu Ile Ala Lys Gln Gln Ala Leu Gly 535 540 545 gccccctgat cggtcaagct cagcgccgtg tccttgcatg atcgacaccc cgctccggag 3546 ccgccatgga cctcgccacc ggcgccctcc tcctccccgc cggcttcgac ctgtggggtt 3606 atgggcactg gcgcgtcagg actttctggt ggtgacaggc aagcctggtg gtgggctata 3666 tgaaatatcc tagacggttg ctcctggctg ttttcaggct ttcgtacggt cgaaaaccgg 3726 ccagcggttg ccacttggct ggatcctttc gtttgattaa cggatagggt ttatcccgtc 3786 ctcgacaagt gaagagaacg cttgaaccgt aggctcggct ctaggagtac acggtaccgg 3846 gtggcatttt tataccgcac agtgttcggt agaaaatacc atttccatat accaagcatt 3906 tatcgtgggc ttgggcttta agcattaacg ctcgcaatct ttcgacaatc cgaacggctc 3966 gacgtctgaa taacagcggt ttgattggcc gcttttcttg ccctggatgt tggatttcac 4026 cgagatactc ctgccaactc tttggttgct gacagagctg tgtttcgaga tcgttcaaaa 4086 ttgccagtac gtcatctaga tcgtcatttc tcaagcggaa cgttacattc attgattcaa 4146 tgcctatccc tgcatttctt tgtgcatatc gttcaaaagc aggtgctata agggaaaaat 4206 atccaaacgt atgaaagcag tcagacctga aagtaactcg gtcttctggg tctagcggac 4266 ccaaatgctc tgtttttttc gatgcatata agccgattat atgacgcatg gtgactgtac 4326 caaactactg acatacttat ggacgaaggc aagctcacac tcctgcgagg acacagccta 4386 gaaggttcgt ggcatctatc ggccacttcc tctgaccgtt ttctggcggc tgtcaccggc 4446 atctatgggg tccaggttgt gtgaacagtg ccgatgaatc taaagagcat tagacaaaca 4506 acctcaggtc tttcacattc cctctaaagc gggtcaggaa aaagacatgc cttcacgttt 4566 ggcatccagc tacccaaata ttcaacatgc attggacgcg atcattccaa gcaaaaaatt 4626 ggacgtggct actcgtattg tcctatgggc ggcgagtgac gccgggctag atccagccga 4686 aattatggtc acgctgtcaa agctagatcc agtgcttttc gacaaccttt gttctgaaat 4746 ggaggtgcag tatttcagac ttttcgagcg cggagatgag aggcacctat cgtttttctg 4806 taaggctcga g 4817 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 ggaattctaa ggaggaatag catatgcgcg attatgaaca cgttgttg 48 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 cgggatcctt aaccaagcgc ctgttgcttg gca 33

【００４６】

【配列表フリーテキスト】配列番号４−人工配列の説
明：プライマー 配列番号５−人工配列の説明：プライマー

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、予想される Pseudomonas chlororaphi
s B23 のニトリル代謝経路を示す。

【図２】図２は、Pseudomonas chlororaphis B23 の ニ
トリルヒドラターゼ遺伝子周辺領域の構造を示す。

【図３】図３は、OrfFのアミノ酸配列と既知のカルボン
酸ＣｏＡ合成酵素のアミノ酸配列を比較した図である。

【図４】図４は、pET24a(+)::OrfFの構築に用いたプラ
イマーの構造を示す。

【図５】図５は、OrfF発現実験におけるSDS-PAGEの結果
を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（a）または（b）の組換えタンパク
   質。 （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質 （b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において1また
   は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
   ノ酸配列からなり、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性
   を有するタンパク質
2. 【請求項２】以下の（a）または（b）のタンパク質をコ
   ードする遺伝子。 （a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質 （b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において1また
   は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
   ノ酸配列からなり、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性
   を有するタンパク質
3. 【請求項３】以下の（c）または（d）のDNAからなる遺
   伝子。 （c）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA （d）配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補
   的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし、かつカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活
   性を有するタンパク質をコードするシュードモナス属に
   属する微生物由来のDNA
4. 【請求項４】請求項２または３記載の遺伝子を含有す
   る、組換えベクター。
5. 【請求項５】請求項２または３記載の遺伝子を導入して
   得られる、形質転換体。
6. 【請求項６】請求項５記載の形質転換体を培養し、得ら
   れる培養物からカルボン酸ＣｏＡ合成酵素活性を有する
   タンパク質を採取する、カルボン酸ＣｏＡ合成酵素の製
   造方法。