CN109337879B - 一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一个来自于蒌叶假单胞菌Pseudomonas beteli的苹果酸脱氢酶PbMDH，该苹果酸脱氢酶的编码基因及其应用。本发明提供的带有苹果酸脱氢酶PbMDH核苷酸序列的克隆质粒可以通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节所述编码基因的表达，能够高效表达苹果酸脱氢酶PbMDH，为苹果酸脱氢酶的生产提供有效途径。本发明提供的海洋来源的苹果酸脱氢酶具有耐盐耐高温的性能，具有重要的工业化应用前景。

Description

一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，涉及一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用，具体涉及一种海洋来源的蒌叶假单胞菌(Pseudomonas beteli)的苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码基因和应用。
背景技术
苹果酸脱氢酶(EC:1.1.1.37)在动物、植物和各种生物体内广泛存在，具有高度的保守性，能够催化苹果酸和草酰胺乙酸的相互转化，在包括三羧酸循环、C4循环、氨基酸合成等的代谢中起着重要的作用。苹果酸脱氢酶的分类有不同的方法。根据其在真核细胞中分布不同而分类，苹果酸脱氢酶主要可分为细胞质苹果酸脱氢酶、线粒体苹果酸脱氢酶和叶绿体苹果酸脱氢酶，它们分别存在于细胞质、线粒体和叶绿体中，另外，亚细胞定位，发现苹果酸脱氢酶也存在于乙醛酸体以及锥虫甘油体内。
苹果酸脱氢酶PbMDH在临床医药和农业生产等领域，都具有非常重要的应用。在临床中，苹果酸脱氢酶活性异常增高，有可能是由于心机梗死、溶血性疾病、巨幼红细胞贫血、镰刀型红细胞贫血、急性肝病、癌转移等疾病，因此苹果酸脱氢酶可作为临床诊断试剂盒的用途。在农业生产领域中，某些地区的土壤中含有超量的金属离子，这会对植物产生一定的毒害作用，而苹果酸脱氢酶PbMDH能够催化草酰乙酸得到苹果酸，从而跟金属离子共价结合，降低其对农作物的毒害作用，有利于农作物增产和促进农业的大规模发展。
1981年，Tanaka团队从极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中克隆到了一个3-异丙基苹果酸脱氢酶。2006年，福州大学汪少芸等人首次发现了豆科植物来源的苹果酸脱氢酶，发现钾离子能够提高苹果酸脱氢酶酶活性，锌离子、铅离子和铜离子会降低酶活性。2007年，江南大学龚韧等人从猪心肌中克隆表达了苹果酸脱氢酶，并研究了其酶学性质，该酶的最适温度为50℃。2011年，江南大学李倩团队以大肠杆菌基因组为模板，克隆得到苹果酸脱氢酶，并构建了重组菌成功表达了目的苹果酸脱氢酶，该酶的最适温度为37℃。2013年，西南大学孙芳等人分离纯化了鸭心来源的苹果酸脱氢酶，其最适温度为55℃。
当苹果酸脱氢酶处于温度比较极端的环境下，大多数种属的的酶活力会有比较显著的下降。苹果酸脱氢酶的应用也很广泛，在食品工业苹果酸脱氢酶用于L-苹果酸、柠檬酸等有机酸的检测；在临床上苹果酸脱氢酶用于肝炎、DIC等疾病的早期诊断。总之，苹果酸脱氢酶是生物体内的关键酶，国内外学者都对其进行着跟踪研究，并且具有广泛的应用。目前海洋来源的苹果酸脱氢酶的挖掘并未多见。
发明内容
本发明的目的在于一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用，所述苹果酸脱氢酶PbMDH具有耐盐性耐高温，具有良好的工业生产前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种苹果酸脱氢酶PbMDH，其具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(I)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(II)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；
(III)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，所述氨基酸序列具有苹果酸脱氢酶的活性。
本发明中，发明人通过大量的实验对海洋来源的苹果酸脱氢酶进行研究，发现其中来源于蒌叶假单胞菌的苹果酸脱氢酶比酶活高，耐盐性耐高温，有利于工业氧化还原，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
MSDFKTAALDYHSQPRPGKLSVELTKPTATARDLSLAYSPGVAAPVREIARDAELAYRYTGKGNLVAVISDGTAILGLGNLGPLASKPVMEGKGVLFKRFAGVDVFDIEVDAESPQAFIDTVKRISITFGGINLEDIKAPECFEIERALIEQCDIPVFHDDQHGTAIVTAAGMLNALEIAGKSIEDAKIVCLGAGAAATSCMKLLVSIGAKIENIFMIDRKGVIHAGRDDLNQYKAIFAHETDKRTLDDALDGADVFVGLSGANLLSPEGLKRMAANPIVFACSNPDPEISPELAHATRSDVIMATGRSDYPNQVNNVLGFPFIFRGALDVRAKRINEEMKIAAALALRDLAKLPVPAEVCEAYGGQSLEFGREYIIPKPMDPRLITLVSDAVAKAAIESGVATLPYPANYPLKSVDDVFNG.
在本发明的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。
在本发明的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少92％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。
在本发明的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。
在本发明的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。
在本发明的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。
根据本发明，所述苹果酸脱氢酶的来源为海洋来源，优选为海洋来源的蒌叶假单胞菌，其中所述蒌叶假单胞菌(Pseudomonas beteli)。
第二方面，本发明提供一种核苷酸，具有(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列中的任意一个：
(I)编码如第一方面所述的苹果酸脱氢酶PbMDH的核苷酸序列；
(II)具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(III)与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有≥85％，优选≥90％，更优选≥92％，最优选≥95％同源性的核苷酸序列。
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
ATG TCA GAT TTT AAA ACT GCT GCT CTT GAC TAC CAT TCC CAGCCG CGT CCGGGA AAG CTG AGC GTA GAG TTG ACC AAG CCT ACT GCCACC GCT CGT GAT CTG TCG TTGGCC TAC AGT CCA GGC GTT GCC GCACCC GTT CGT GAG ATC GCT CGT GAT GCC GAG CTGGCC TAC CGC TACACC GGT AAG GGC AAC CTG GTG GCG GTC ATC TCC GAC GGC ACC GCAATTCTG GGG CTG GGT AAC CTG GGG CCG CTG GCG TCC AAG CCG GTAATG GAA GGC AAG GGCGTT CTG TTC AAG CGC TTC GCT GGC GTG GACGTG TC GAT ATC GAA GTC GAT GCC GAA AGCCCG CAG GCT TTC ATCGATACC GTC AAG CGC ATC TCC ATT ACC TTC GGC GGC ATC AACCTCGAAGAC ATC AAG GCG CCC GAG TGC TTC GAG ATC GAG CGC GCG CTCATCGAG CAG TGCGAT ATC CCG GTC TTC CAT GAC GAC CAG CAC GGCACTGCG ATC GTT ACC GCG GCC GGC ATGCTC AAT GCG CTG GAG ATCGCGGGC AAG AGC ATC GAA GAC GCG AAG ATC GTC TGC CTG GGTGCTGGTGCG GCG GCT ACC TCC TGC ATG AAG CTG CTG GTG AGC ATC GGGGCGAAG ATC GAGAAC ATC TTC ATG ATC GAC CGC AAG GGT GTG ATTCATGCC GGG CGC GAC GAT CTC AAC CAGTAC AAG GCG ATT TTC GCTCACGAA ACC GAC AAG CGA ACC CTC GAC GAC GCG CTG GAC GGCGCTGATGTG TTC GTC GGC CTT TCC GGT GCC AAC CTG CTG AGC CCC GAAGGTCTC AAG CGCATG GCA GCC AAT CCG ATC GTG TTC GCC TGC TCGAACCCC GAT CCC GAA ATC AGC CCG GAACTG GCG CAT GCC ACA CGTTCCGAC GTG ATC ATG GCG ACC GGT CGT TCC GAC TAT CCG AATCAGGTCAAC AAC GTA CTC GGC TTT CCG TTC ATC TTC CGG GGG GCA CTGGATGTC CGC GCCAAG CGC ATC AAC GAA GAG ATG AAG ATT GCT GCTGCGCTG GCG CTG CGT GAT CTG GCC AAGCTG CCG GTT CCT GCC GAAGTATGT GAG GCC TAT GGC GGG CAG AGC CTG GAG TTC GGC CGCGAATACATC ATT CCC AAG CCG ATG GAC CCG CGG CTG ATC ACC CTG GTGTCCGAT GCG GTGGCC AAG GCG GCC ATC GAA AGT GGT GTT GCG ACGCTGCCC TAT CCG GCC AAC TAC CCG CTGAAG TCG GTG GAT GAT GTCTTCAAC GGT TGA.
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少86％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少88％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少92％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少98％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
在本发明的一些实施例中，核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的序列，且能够编码苹果酸脱氢酶。
第三方面，本发明提供一种载体，所述载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述核苷酸的序列。
本发明中，所述载体的获得为本领域的常规技术手段，只要能够获得带有所述核苷酸序列的载体的方法都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要选择合适的载体制备方法。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，包含如第三方面所述的载体。
根据本发明，所述宿主细胞为真核细胞和/或原核细胞。
优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述酵母细胞例如可以是多形汉逊式酵母、毕氏酵母或酿酒酵母中的任意一种或至少两种的组合，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不作特殊限定。
优选地，所述原核生物包括大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌，优选为大肠杆菌。
第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的苹果酸脱氢酶PbMDH的方法，包括如下步骤：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码如第二方面所述核苷酸的序列；
(2)适合表达所述苹果酸脱氢酶的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述苹果酸脱氢酶的多肽。
本发明中，所述重组载体导入所述宿主细胞的方法为本领域的常规技术手段，如宿主细胞是真核细胞，可用电穿孔、DNA转染、显微镜注射等方法；当宿主细胞是原核细胞时，可用电穿孔、Cacl2等方法。
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的苹果酸脱氢酶的多肽。
根据本发明，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述苹果酸脱氢酶PbMDH或如第二方面所述的核苷酸用于氧化还原。
本发明中，苹果酸脱氢酶PbMDH在农业生产领域中，某些地区的土壤中含有超量的金属离子，这会对植物产生一定的毒害作用，而苹果酸脱氢酶PbMDH能够催化草酰乙酸得到苹果酸，从而跟金属离子共价结合，降低其对农作物的毒害作用，有利于农作物增产和促进农业的大规模发展。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
(1)本发明通过对海洋来源的苹果酸脱氢酶的研究，发现来自于蒌叶假单胞菌的苹果酸脱氢酶具有较高的比酶活，通过将其克隆表达，调节所述编码基因的表达，高效表达了来自于蒌叶假单胞菌苹果酸脱氢酶PbMDH；
(2)本发明中的苹果酸脱氢酶蛋白大小在45.8kDa，最大的比酶活可达31.33U/mg，具有耐盐性耐高温性，为工业化应用奠定了基础。
附图说明
图1为苹果酸脱氢酶PbMDH基因PCR扩增产物凝胶电泳图，其中1-9均为目的苹果酸脱氢酶PCR扩增产物；
图2为构建有本发明所提供的苹果酸脱氢酶PbMDH的重组表达质粒PET28a质粒图谱；
图3为本发明的苹果酸脱氢酶PbMDH在重组大肠杆菌里经过诱导表达和纯化后的SDS-PAGE图，其中泳道1为蛋白电泳Maker，泳道2为粗酶液，泳道3为目的纯化的苹果酸脱氢酶PbMDH；
图4为反应体系温度对本发明的苹果酸脱氢酶PbMDH催化活性的影响；
图5为反应体系pH对本发明的苹果酸脱氢酶PbMDH催化活性的影响；
图6为金属离子对本发明的苹果酸脱氢酶PbMDH催化活性的影响。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1蒌叶假单胞菌(Pseudomonas beteli)的活化和培养
按1％接种量将-80℃保存的蒌叶假单胞菌(Pseudomonas beteli)接到10mL的2216L培养基中，置于25℃的温度和200rpm的转速下的恒温摇床中，活化12小时。将活化的菌株，按1％比例接种到50mL的2216L培养基中，置于25℃的温度和200rpm的转速下的恒温摇床中培养至OD600约为0.8。
实施例2蒌叶假单胞菌(Pseudomonas beteli)苹果酸脱氢酶PbMDH的基因克隆及重组载体的构建
采用Takara公司生产的基因组提取试剂盒提取蒌叶假单胞菌(Pseudomonasbeteli)总RNA，然后反转录合成cDNA，取1μL的cDNA为模板进行聚合酶链式反应。
根据SEQ ID NO.2的核苷酸序列设计一对引物进行PCR扩增，引物设计如下：
上游引物PbMDHF1(SEQ ID No.9)：5’-GGAATTCCATATGTCHGATYTYAAAACYGCYG-3’；
下游引物PbMDHR1(SEQ ID No.10)：5’-CCGCTCGAGTYARCCSTTGAASACRTCRTC-3’；
其中，YRS代表兼并碱基，具体为Y＝C/T，R＝A/G，S＝G/C，下划线序列为限制性内切酶位点NdeI和XhoI；
以提取Pseudomonas beteli基因组cDNA为模板，PCR扩增体系如下：
Figure BDA0001916103000000091
PCR扩增温度和循环数设置如下：
Figure BDA0001916103000000101
提纯的PCR产物和质粒pET-28a分别用Nde I和Xho I酶进行37℃下3小时酶切反应，各自酶切体系如下：
Figure BDA0001916103000000102
目的基因片段酶切体系：
Figure BDA0001916103000000103
电泳检测酶切的产物，然后用凝胶回收试剂盒，对目标产物进行纯化回收。回收后的基因片段与质粒载体以摩尔比5:1到10:1的比例，在16℃条件下用T4DNA连接酶(Takara)连接过夜。pET-28a与目的基因片段连接体系如下：
Figure BDA0001916103000000111
得到所述重组载体。
实施例3重组大肠杆菌的构建
将连接成功的重组质粒转入大肠杆菌中具体步骤为：
(1)取100μL感受态细胞放置于冰浴中融化10min；
(2)向感受态细胞中加入0.1ng-10ng(3μL-10μL)的转化重组质粒，轻轻混匀冰中放置30min；
(3)将上述菌液放置于45℃热激45s，然后迅速放入冰浴中1-2min；
(4)加入890μL 37℃预热的新鲜LB培养基，在37℃，200rpm培养1h；
(5)100-200μL菌液用涂布棒均匀涂布于含卡那霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养；
挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，PCR结果如图1所示，目的条带的大小为1200bp，并进行序列鉴定，重组得到的质粒pET-28a-PbMDH的质粒图谱如图2所示，将阳性克隆的菌液保存在终浓度为40％的甘油中，在-80℃下保存。
实施例4苹果酸脱氢酶PbMDH转化诱导表达纯化
取100μL甘油管中保存的菌液接至10mL含卡那霉素抗性(终浓度为50μg/mL)LB培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。
以1％的接种量将培养过夜的菌液接种于100mL含卡那霉素抗性(终浓度为50μg/mL)LB培养基中，在37℃温度下200rpm的培养箱里培养3h左右，将菌液培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，将菌液放在20℃、200rpm的培养箱诱导培养16-18h，收集菌液，在6000rpm下离心10分钟，除去上清液，将菌体收集起来。
将收集的菌体和PBS缓冲液按1g:20mL的比例进行重悬，冰上用超声破碎细胞后，在4℃，12000rpm离心20min，收集上清液。将上清液用0.22μm的滤膜过滤后，用AKTA蛋白纯化仪(GE Healthcare Corp.,Piscataway,NJ,USA)，使用5mL HisTrap HP柱对PbMDH进行纯化。纯化的过程缓冲溶液流速为5mL/min，具体步骤如下：用10倍柱体积的30mM咪唑结合缓冲液平衡HisTrapHP柱；用注射器将经过0.45μm滤膜过滤后的上清液注入AKTA蛋白纯化仪中上样环，同时收集穿透部分；用10倍柱体积结合缓冲溶液洗至UV 280nm基线至水平为止，随后用500mM咪唑洗脱缓冲液进行一步洗脱，UV 280nm出现洗脱峰时，收集有峰的洗脱液。
对收集的洗脱液进行超滤除盐后，收集的样品进行酶活测定和SDS-PAGE鉴定，如图3所示，苹果酸脱氢酶PbMDH蛋白大小为45.8kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例5苹果酸脱氢酶PbMDH重组菌的蛋白活力检测和酶学性质研究
苹果酸脱氢酶是氧化还原酶，其正反应能催化L-苹果酸形成草酰乙酸伴随生成NADH，逆反应可催化草酰乙酸合成L-苹果酸伴随生成NAD(+)，为NAD(+)或NADH依赖型酶。因为NADH在340nm波长附近有吸光度，以草酰乙酸和NADH作为反应底物和辅酶，通过计算NADH在340nm处的吸光值变化来计算苹果酸脱氢酶的活性。
把每分钟催化生成或者消耗1μmol NADH所需的酶量定义为一个酶活力单位，酶活的计算公式：
Figure BDA0001916103000000131
VS：酶液的体积
VT：反应溶液的总体积
ΔA：每分钟340nm处吸光值变化
K：酶的稀释的倍数
L：仪器的光程(0.5cm)
ε：摩尔吸光系数(ε＝6.22L/(mmol×cm))
苹果酸脱氢酶的反应体系如下：1×PBS缓冲液(Solarbio)185μL,草酰乙酸25mM，NADH 8mM，苹果酸脱氢酶20μL，总的反应体系220μL。利用酶标仪测量ΔA，计算得到的纯化后的苹果酸脱氢酶最大的比酶活为31.33U/mg。
实施例6最适温度与最适pH
考察在不同温度(30、40、50、60、70、80、90、100)进行酶促反应时的比活力，确定酶反应的最适温度。定义最高酶活的活性为100％，计算出其它温度条件下对应的酶活，以温度值为横坐标，相对酶活为纵坐标作图，得到温度对酶活的影响曲线，结果如图4。从图4可以看出，该MDH的酶活随温度呈先增大后减小的趋势，最适温度为60度，在50-80度酶活都能保持在80％以上，说明该MDH具有耐高温性能。
在最适反应温度下，测定不同pH的缓冲液体系中(磷酸盐缓冲溶液：pH＝6.0、7.0、8.0；Tris-HCl缓冲溶液：pH＝8.0、8.5、9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液：pH＝9.0、10.0、11.0、12.0)的酶活力，以最适pH的酶活为100％，计算相对酶活，最适pH实验结果如图5所示，从图5可以看出pH的大小对本发明所提供的苹果酸脱氢酶PbMDH酶活力影响很大，其最适pH为8.0，只有在pH在8.0-9.0时，酶活保持在80％以上，pH过高或过低，酶活都迅速下降，说明该MDH对pH较为敏感。
实施例7金属离子对MDH活性的影响
金属离子在一定的浓度下，对本发明所提供的苹果酸脱氢酶PbMDH酶活性有抑制作用。配制不同的金属离子溶液，金属离子包括Cu2+、Al3+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ni2+，在缓冲液中加入终浓度为10mM的金属离子测定MDH酶活，以不添加金属离子测得MDH酶活作为100％计算相对酶活，做三次平行。结果见图6所示，从图6可以看出Cu2+、Al3+、Mn2+、Ca2+、Zn2 +、K+、Mg2+、Ni2+对MDH的酶活有不同程度的抑制作用，Mn2+相对其他6种金属离子，对MDH酶活的抑制作用最强。
实施例8具有一定序列同一性的苹果酸脱氢酶
通过基因突变或全基因合成等手段获得三条与苹果酸脱氢酶PbMDH具有一定序列同一性的基因序列，分别为SEQ ID NO.3(98％)、SEQ ID NO.4(87％)和SEQ ID NO.5(80％)，具体为：
SEQ ID NO.3的序列如下：AAAACTGCCGCTCTTGACTACCATTCCCAGCCGCGTCCGGGAAAGCTGAGCGTAGAGTTGACCAAGCCTACTGCCACCGCTCGTGATCTGTCGTTGGCCTACAGTCCAGGCGTTGCCGCACCCGTTCGTGAGATCGCTCGTGATGCCGAGCTGGCCTACCGCTACACCGGTAAGGGCAACCTGGTGGCGGTCATCTCCGACGGCACCGCAATTCTGGGGCTGGGTAACCTGGGGCCGCTGGCGTCCAAGCCGGTAATGGAAGGCAAGGGCGTTCTGTTCAAGCGCTTCGCTGGCGTGGACGTGTTCGATATCGAAGTCGATGCCGAAAGCCCGCAGGCTTTCATCGATACCGTCAAGCGCATCTCCATTACCTTCGGCGGCATTAACCTCGAGGACATCAAGGCGCCCGAGTGCTTCGAAATCGAGCGCGCGCTCATCGAGCAGTGCGATATCCCGGTCTTCCATGACGACCAGCATGGCACTGCGATCGTTACCGCGGCCGGCATGCTCAATGCGTTGGAGATCGCGGGCAAGAGCATCGAAGACGCGAAGATCGTCTGCCTGGGTGCTGGTGCGGCGGCTACCTCCTGCATGAAGCTGCTGGTGAGCATCGGGGCGAAGATCGAGAACATCTTCATGATCGACCGCAAGGGTGTGATTCATGCCGGGCGCGACGATCTCAACCAGTACAAGGCGATTTTCGCTCACGAAACCGACAAGCGAACCCTCGACGACGCGCTGGACGGCGCTGATGTGTTCGTCGGCCTTTCCGGTGCCAACCTGCTGAGCCCCGAAGGTCTCAAGCGCATGGCAGCCAATCCGATCGTGTTCGCCTGCTCGAACCCCGATCCCGAAATCAGCCCGGAACTGGCGCATGCCACACGTTCCGACGTGATCATGGCGACCGGTCGTTCCGACTATCCGAATCAGGTCAACAACGTACTCGGCTTCCCGTTCATCTTCCGGGGCGCACTGGATGTCCGCGCCAAGCGCATCAACGAAGAGATGAAGATTGCTGCTGCGCTGGCGCTGCGTGATCTGGCCAAGCTGCCGGTTCCTGCCGAGGTATGTGAGGCCTATGGCGGGCAGAGCCTGGAGTTCGGCCGCGAATACATCATTCCCAAGCCGATGGATCCGCGGCTGATCACCCTGGTGTCCGATGCGGTGGCCAAGGCGGCCATCGAAAGTGGTGTTGCGACGCTGCCCTATCCGGCCAACTATCCGCTGAAGTCGGTGGATGACGTCTT；
SEQ ID NO.4的序列如下：AAAACTGCCGCGCTCGAATACCATGCCCAGCCCCGTCCGGGGAAGTTGAGCGTCGAGCTCACCAAGCCCACCGCCACTGCTCGTGACCTGTCTCTGGCCTATAGCCCAGGCGTCGCCGAGCCGGTTCGCGAGATTGCTCGCGATGCGGAGCTGGCTTACCGCTACACCGGCAAGGGCAACCTGGTGGCGGTTATCTCCGATGGCACCGCTATTCTCGGTCTGGGTAATCTCGGTCCGCTGGCTTCCAAGCCGGTGATGGAAGGCAAGGGTGTGTTGTTCAAGCGCTTCGCCGGTGTCGACGTATTCGACATCGAGGTCGATGCCGAGAGCCCGCAGGCCTTCATTGATACCGTCAAGCGCATCTCGATCACTTTTGGTGGCATCAACCTCGAAGATATCAAGGCGCCGGAGTGTTTCGAGATCGAGCGCGCACTGATCGAGCAGTGCGATATTCCGGTCTTCCATGACGACCAGCACGGCACGGCGATCGTCACTGCGGCCGGCATGCTGAACGCACTGGAAATCGCCGGCAAGACGCTGGAACAGGCGAAGATCGTCTGCCTCGGTGCTGGCGCTGCAGCGACCTCCTGCATGAAGCTGCTGGTCAGCATGGGTGCGAAGATCGAGAACATCTTCATGATCGATCGCAAGGGCGTGATCCATGCCGGCCGCGACGACCTCAATCAGTACAAGGCCGTGTTCGCCCACGAAACCGACAAGCGCACCCTGGATGACGCGCTGGATGGTGCTGACGTCTTCGTCGGTCTGTCGGGTGCCAACCTGCTGAGCCCGGAAGGTCTCAAGCGCATGGCGGCCAATCCGGTCGTGTTCGCTTGCTCCAACCCTGATCCGGAAATCAGTCCTGAGCTGGCGCATGCGACGCGTTCCGACGTGATCATGGCGACCGGCCGTTCCGACTATCCGAATCAGGTCAATAACGTGCTTGGCTTCCCGTTCATCTTCCGTGGCGCCTTGGACGTTCGCGCCAAGCGCATCAACGAAGAGATGAAGATCGCCGCCGCGCTGGCCCTTCGTGATCTGGCCAAGCTGCCGGTGCCGGCCGAAGTCGCCGCTGCCTATGGTGTGGACAGCCTGGAGTTCGGCCGCGAGTACATCATTCCGAAGCCTATGGACCCGCGCCTGATCACTCTGGTTTCGGACGCTGTAGCCAAGGCTGCGATCGAAAGTGGTGTAGCTACGTTGCCTTACCCGTCGCACTATCCGCTGAAGTCGGTGAACGACGTCTTCAACGGTTGA；
SEQ ID NO.5的序列如下：ATGTCAGACCTGAAAACCGCCGCTCTCGAATATCACGCTCAACCTCGTCCGGGGAAACTGAGCGTTGAACTCTCCAAGCCCACTGCCACCGCCCGTGACCTCGCCCTGGCCTACAGCCCAGGTGTTGCAGAGCCGGTGCGCGAAATTGGCCGTGATCCAGAGCTGGCTTACAAATACACCGGCAAAGGCAACCTGGTTGCGGTGATTTCCGATGGCACTGCCATCCTCGGTCTGGGTGACCTCGGCCCACTGGCTTCCAAGCCGGTCATGGAAGGCAAGGGTGTTCTGTTCAAGCGTTTCGCCGGTATCGATGTGTTCGACATCGAAGTCGAATCGGAAAGCCCGCAAGCGTTCATCGACACCGTTCGCCGCATTTCGATCACCTTCGGTGGCATCAACCTTGAAGACATCAAGGCTCCTGAGTGCTTTGAGATCGAACGTACCCTGATCGAACAGTGCGACATCCCGGTGTTCCACGATGACCAGCACGGTACTGCCATCGTGACTGCCGCCGGCATGATCAACGCCCTGGAAATCGCTGGCAAGAAACTGGAAGACGCCAAGATCGTCTGCCTGGGCGCCGGCGCTGCTGCCATTTCCTGCATGAAGCTGCTGGTAAGCATGGGTGCGAAGGTCGAGAACATCTTCATGATCGACCGTAGTGGCGTGATCCACGCTGGCCGTGACGACCTGAACCAGTACAAGGCGCAGTTCGCCCACGCGACCGACAAGCGCACCCTGGCCGACGCCCTTGACGGTGCCGACGTATTCGTAGGTCTGTCTGGCCCGAACCTGCTGAGCCCGGAAGGCCTGAAGTCGATGGCTGCCAACCCGATCGTGTTCGCTTGCTCGAACCCGGACCCGGAAATCTCGCCAGAGCTGGCGCATGCCACTCGCAACGACGTGATCATGGCTACTGGTCGTTCCGACTACCCGAACCAGGTCAACAACGTACTGGGCTTCCCGTTCATCTTCCGTGGTGCTCTGGACGTTCGCGCCAAGCGTATCAACGAAGAAATGAAGATCGCTGCCGCTATCGCCCTGAAAGACCTGGCCAAGCTGCCAGTGCCTAAGGAAGTTTGCGAAGCCTATGGTGTTGAAGGCCTGGAGTTCGGCCGTGAGTACATCATTCCGAAGCCGCTGGATGCACGCTTGATCACCGTCGTTTCCGATGCTGTGGCCAAGGCTGCCATCGAATCCGGCGTGGCTACCCTGCCTTATCCGAAGCACTACCCGCTGACCAGCGTGGATGAAGTGTTCAACGGCTGA；
分别编码如SEQ ID NO.6(99.5％)、SEQ ID NO.7(95.7％)和SEQ ID NO.8(90.3％)所示的氨基酸序列，具体为：
SEQ ID NO.6的序列如下：MTDLKTAALDYHSQPRPGKLSVELTKPTATARDLSLAYSPGVAAPVREIARDAELAYRYTGKGNLVAVISDGTAILGLGNLGPLASKPVMEGKGVLFKRFAGVDVFDIEVDAESPQAFIDTVKRISITFGGINLEDIKAPECFEIERALIEQCDIPVFHDDQHGTAIVTAAGMLNALEIAGKSIEDAKIVCLGAGAAATSCMKLLVSIGAKIENIFMIDRKGVIHAGRDDLNQYKAIFAHETDKRTLDDALDGADVFVGLSGANLLSPEGLKRMAANPIVFACSNPDPEISPELAHATRSDVIMATGRSDYPNQVNNVLGFPFIFRGALDVRAKRINEEMKIAAALALRDLAKLPVPAEVCEAYGGQSLEFGREYIIPKPMDPRLITLVSDAVAKAAIESGVATLPYPANYPLKSVDDVFV；
SEQ ID NO.7的序列如下：MTDLKTAALEYHAQPRPGKLSVELTKPTATARDLSLAYSPGVAEPVREIARDAELAYRYTGKGNLVAVISDGTAILGLGNLGPLASKPVMEGKGVLFKRFAGVDVFDIEVDAESPQAFIDTVKRISITFGGINLEDIKAPECFEIERALIEQCDIPVFHDDQHGTAIVTAAGMLNALEIAGKTLEQAKIVCLGAGAAATSCMKLLVSMGAKIENIFMIDRKGVIHAGRDDLNQYKAVFAHETDKRTLDDALDGADVFVGLSGANLLSPEGLKRMAANPVVFACSNPDPEISPELAHATRSDVIMATGRSDYPNQVNNVLGFPFIFRGALDVRAKRINEEMKIAAALALRDLAKLPVPAEVAAAYGVDSLEFGREYIIPKPMDPRLITLVSDAVAKAAIESGVATLPYPSHYPLKSVNDVFNG；
SEQ ID NO.8的序列如下：MSDLKTAALEYHAQPRPGKLSVELSKPTATARDLALAYSPGVAEPVREIGRDPELAYKYTGKGNLVAVISDGTAILGLGDLGPLASKPVMEGKGVLFKRFAGIDVFDIEVESESPQAFIDTVRRISITFGGINLEDIKAPECFEIERTLIEQCDIPVFHDDQHGTAIVTAAGMINALEIAGKKLEDAKIVCLGAGAAAISCMKLLVSMGAKVENIFMIDRSGVIHAGRDDLNQYKAQFAHATDKRTLADALDGADVFVGLSGPNLLSPEGLKSMAANPIVFACSNPDPEISPELAHATRNDVIMATGRSDYPNQVNNVLGFPFIFRGALDVRAKRINEEMKIAAAIALKDLAKLPVPKEVCEAYGVEGLEFGREYIIPKPLDARLITVVSDAVAKAAIESGVATLPYPKHYPLTSVDEVFNG；
利用实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中提及的克隆、表达、纯化与酶活检测手段，可获得表达苹果酸脱氢酶的重组菌株以及其苹果酸脱氢酶纯酶，并具有在NADH存在条件下催化草酰乙酸合成L-苹果酸伴随生成NAD(+)的苹果酸脱氢酶酶活，具体如下：
此三个PbMDH分别达到的酶活为：SEQ ID NO.3的PbMDH的酶活为31.12U/mg，SEQID NO.4的PbMDH的酶活为25.13U/mg，SEQ ID NO.5的PbMDH的酶活为18.92U/mg。
综上所述，本发明中的苹果酸脱氢酶蛋白大小在45.8kDa，最大的比酶活可达31.33U/mg，具有耐盐性耐高温性，为工业化应用奠定了基础。
最后需要说明的是，以上实施例仅用说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优化的实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用
<130> 2018
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asp Phe Lys Thr Ala Ala Leu Asp Tyr His Ser Gln Pro Arg
1 5 10 15
Pro Gly Lys Leu Ser Val Glu Leu Thr Lys Pro Thr Ala Thr Ala Arg
20 25 30
Asp Leu Ser Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Ala Pro Val Arg Glu
35 40 45
Ile Ala Arg Asp Ala Glu Leu Ala Tyr Arg Tyr Thr Gly Lys Gly Asn
50 55 60
Leu Val Ala Val Ile Ser Asp Gly Thr Ala Ile Leu Gly Leu Gly Asn
65 70 75 80
Leu Gly Pro Leu Ala Ser Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val Leu
85 90 95
Phe Lys Arg Phe Ala Gly Val Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Asp Ala
100 105 110
Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile Asp Thr Val Lys Arg Ile Ser Ile Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu
130 135 140
Ile Glu Arg Ala Leu Ile Glu Gln Cys Asp Ile Pro Val Phe His Asp
145 150 155 160
Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Val Thr Ala Ala Gly Met Leu Asn Ala
165 170 175
Leu Glu Ile Ala Gly Lys Ser Ile Glu Asp Ala Lys Ile Val Cys Leu
180 185 190
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ser Cys Met Lys Leu Leu Val Ser Ile
195 200 205
Gly Ala Lys Ile Glu Asn Ile Phe Met Ile Asp Arg Lys Gly Val Ile
210 215 220
His Ala Gly Arg Asp Asp Leu Asn Gln Tyr Lys Ala Ile Phe Ala His
225 230 235 240
Glu Thr Asp Lys Arg Thr Leu Asp Asp Ala Leu Asp Gly Ala Asp Val
245 250 255
Phe Val Gly Leu Ser Gly Ala Asn Leu Leu Ser Pro Glu Gly Leu Lys
260 265 270
Arg Met Ala Ala Asn Pro Ile Val Phe Ala Cys Ser Asn Pro Asp Pro
275 280 285
Glu Ile Ser Pro Glu Leu Ala His Ala Thr Arg Ser Asp Val Ile Met
290 295 300
Ala Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn Val Leu Gly
305 310 315 320
Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Lys Arg Ile
325 330 335
Asn Glu Glu Met Lys Ile Ala Ala Ala Leu Ala Leu Arg Asp Leu Ala
340 345 350
Lys Leu Pro Val Pro Ala Glu Val Cys Glu Ala Tyr Gly Gly Gln Ser
355 360 365
Leu Glu Phe Gly Arg Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Met Asp Pro Arg
370 375 380
Leu Ile Thr Leu Val Ser Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Ile Glu Ser
385 390 395 400
Gly Val Ala Thr Leu Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Leu Lys Ser Val
405 410 415
Asp Asp Val Phe Asn Gly
420
<210> 2
<211> 1268
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtcagatt ttaaaactgc tgctcttgac taccattccc agccgcgtcc gggaaagctg 60
agcgtagagt tgaccaagcc tactgccacc gctcgtgatc tgtcgttggc ctacagtcca 120
ggcgttgccg cacccgttcg tgagatcgct cgtgatgccg agctggccta ccgctacacc 180
ggtaagggca acctggtggc ggtcatctcc gacggcaccg caattctggg gctgggtaac 240
ctggggccgc tggcgtccaa gccggtaatg gaaggcaagg gcgttctgtt caagcgcttc 300
gctggcgtgg acgtgtcgat atcgaagtcg atgccgaaag cccgcaggct ttcatcgata 360
ccgtcaagcg catctccatt accttcggcg gcatcaacct cgaagacatc aaggcgcccg 420
agtgcttcga gatcgagcgc gcgctcatcg agcagtgcga tatcccggtc ttccatgacg 480
accagcacgg cactgcgatc gttaccgcgg ccggcatgct caatgcgctg gagatcgcgg 540
gcaagagcat cgaagacgcg aagatcgtct gcctgggtgc tggtgcggcg gctacctcct 600
gcatgaagct gctggtgagc atcggggcga agatcgagaa catcttcatg atcgaccgca 660
agggtgtgat tcatgccggg cgcgacgatc tcaaccagta caaggcgatt ttcgctcacg 720
aaaccgacaa gcgaaccctc gacgacgcgc tggacggcgc tgatgtgttc gtcggccttt 780
ccggtgccaa cctgctgagc cccgaaggtc tcaagcgcat ggcagccaat ccgatcgtgt 840
tcgcctgctc gaaccccgat cccgaaatca gcccggaact ggcgcatgcc acacgttccg 900
acgtgatcat ggcgaccggt cgttccgact atccgaatca ggtcaacaac gtactcggct 960
ttccgttcat cttccggggg gcactggatg tccgcgccaa gcgcatcaac gaagagatga 1020
agattgctgc tgcgctggcg ctgcgtgatc tggccaagct gccggttcct gccgaagtat 1080
gtgaggccta tggcgggcag agcctggagt tcggccgcga atacatcatt cccaagccga 1140
tggacccgcg gctgatcacc ctggtgtccg atgcggtggc caaggcggcc atcgaaagtg 1200
gtgttgcgac gctgccctat ccggccaact acccgctgaa gtcggtggat gatgtcttca 1260
acggttga 1268
<210> 3
<211> 1247
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaactgccg ctcttgacta ccattcccag ccgcgtccgg gaaagctgag cgtagagttg 60
accaagccta ctgccaccgc tcgtgatctg tcgttggcct acagtccagg cgttgccgca 120
cccgttcgtg agatcgctcg tgatgccgag ctggcctacc gctacaccgg taagggcaac 180
ctggtggcgg tcatctccga cggcaccgca attctggggc tgggtaacct ggggccgctg 240
gcgtccaagc cggtaatgga aggcaagggc gttctgttca agcgcttcgc tggcgtggac 300
gtgttcgata tcgaagtcga tgccgaaagc ccgcaggctt tcatcgatac cgtcaagcgc 360
atctccatta ccttcggcgg cattaacctc gaggacatca aggcgcccga gtgcttcgaa 420
atcgagcgcg cgctcatcga gcagtgcgat atcccggtct tccatgacga ccagcatggc 480
actgcgatcg ttaccgcggc cggcatgctc aatgcgttgg agatcgcggg caagagcatc 540
gaagacgcga agatcgtctg cctgggtgct ggtgcggcgg ctacctcctg catgaagctg 600
ctggtgagca tcggggcgaa gatcgagaac atcttcatga tcgaccgcaa gggtgtgatt 660
catgccgggc gcgacgatct caaccagtac aaggcgattt tcgctcacga aaccgacaag 720
cgaaccctcg acgacgcgct ggacggcgct gatgtgttcg tcggcctttc cggtgccaac 780
ctgctgagcc ccgaaggtct caagcgcatg gcagccaatc cgatcgtgtt cgcctgctcg 840
aaccccgatc ccgaaatcag cccggaactg gcgcatgcca cacgttccga cgtgatcatg 900
gcgaccggtc gttccgacta tccgaatcag gtcaacaacg tactcggctt cccgttcatc 960
ttccggggcg cactggatgt ccgcgccaag cgcatcaacg aagagatgaa gattgctgct 1020
gcgctggcgc tgcgtgatct ggccaagctg ccggttcctg ccgaggtatg tgaggcctat 1080
ggcgggcaga gcctggagtt cggccgcgaa tacatcattc ccaagccgat ggatccgcgg 1140
ctgatcaccc tggtgtccga tgcggtggcc aaggcggcca tcgaaagtgg tgttgcgacg 1200
ctgccctatc cggccaacta tccgctgaag tcggtggatg acgtctt 1247
<210> 4
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaactgccg cgctcgaata ccatgcccag ccccgtccgg ggaagttgag cgtcgagctc 60
accaagccca ccgccactgc tcgtgacctg tctctggcct atagcccagg cgtcgccgag 120
ccggttcgcg agattgctcg cgatgcggag ctggcttacc gctacaccgg caagggcaac 180
ctggtggcgg ttatctccga tggcaccgct attctcggtc tgggtaatct cggtccgctg 240
gcttccaagc cggtgatgga aggcaagggt gtgttgttca agcgcttcgc cggtgtcgac 300
gtattcgaca tcgaggtcga tgccgagagc ccgcaggcct tcattgatac cgtcaagcgc 360
atctcgatca cttttggtgg catcaacctc gaagatatca aggcgccgga gtgtttcgag 420
atcgagcgcg cactgatcga gcagtgcgat attccggtct tccatgacga ccagcacggc 480
acggcgatcg tcactgcggc cggcatgctg aacgcactgg aaatcgccgg caagacgctg 540
gaacaggcga agatcgtctg cctcggtgct ggcgctgcag cgacctcctg catgaagctg 600
ctggtcagca tgggtgcgaa gatcgagaac atcttcatga tcgatcgcaa gggcgtgatc 660
catgccggcc gcgacgacct caatcagtac aaggccgtgt tcgcccacga aaccgacaag 720
cgcaccctgg atgacgcgct ggatggtgct gacgtcttcg tcggtctgtc gggtgccaac 780
ctgctgagcc cggaaggtct caagcgcatg gcggccaatc cggtcgtgtt cgcttgctcc 840
aaccctgatc cggaaatcag tcctgagctg gcgcatgcga cgcgttccga cgtgatcatg 900
gcgaccggcc gttccgacta tccgaatcag gtcaataacg tgcttggctt cccgttcatc 960
ttccgtggcg ccttggacgt tcgcgccaag cgcatcaacg aagagatgaa gatcgccgcc 1020
gcgctggccc ttcgtgatct ggccaagctg ccggtgccgg ccgaagtcgc cgctgcctat 1080
ggtgtggaca gcctggagtt cggccgcgag tacatcattc cgaagcctat ggacccgcgc 1140
ctgatcactc tggtttcgga cgctgtagcc aaggctgcga tcgaaagtgg tgtagctacg 1200
ttgccttacc cgtcgcacta tccgctgaag tcggtgaacg acgtcttcaa cggttga 1257
<210> 5
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgtcagacc tgaaaaccgc cgctctcgaa tatcacgctc aacctcgtcc ggggaaactg 60
agcgttgaac tctccaagcc cactgccacc gcccgtgacc tcgccctggc ctacagccca 120
ggtgttgcag agccggtgcg cgaaattggc cgtgatccag agctggctta caaatacacc 180
ggcaaaggca acctggttgc ggtgatttcc gatggcactg ccatcctcgg tctgggtgac 240
ctcggcccac tggcttccaa gccggtcatg gaaggcaagg gtgttctgtt caagcgtttc 300
gccggtatcg atgtgttcga catcgaagtc gaatcggaaa gcccgcaagc gttcatcgac 360
accgttcgcc gcatttcgat caccttcggt ggcatcaacc ttgaagacat caaggctcct 420
gagtgctttg agatcgaacg taccctgatc gaacagtgcg acatcccggt gttccacgat 480
gaccagcacg gtactgccat cgtgactgcc gccggcatga tcaacgccct ggaaatcgct 540
ggcaagaaac tggaagacgc caagatcgtc tgcctgggcg ccggcgctgc tgccatttcc 600
tgcatgaagc tgctggtaag catgggtgcg aaggtcgaga acatcttcat gatcgaccgt 660
agtggcgtga tccacgctgg ccgtgacgac ctgaaccagt acaaggcgca gttcgcccac 720
gcgaccgaca agcgcaccct ggccgacgcc cttgacggtg ccgacgtatt cgtaggtctg 780
tctggcccga acctgctgag cccggaaggc ctgaagtcga tggctgccaa cccgatcgtg 840
ttcgcttgct cgaacccgga cccggaaatc tcgccagagc tggcgcatgc cactcgcaac 900
gacgtgatca tggctactgg tcgttccgac tacccgaacc aggtcaacaa cgtactgggc 960
ttcccgttca tcttccgtgg tgctctggac gttcgcgcca agcgtatcaa cgaagaaatg 1020
aagatcgctg ccgctatcgc cctgaaagac ctggccaagc tgccagtgcc taaggaagtt 1080
tgcgaagcct atggtgttga aggcctggag ttcggccgtg agtacatcat tccgaagccg 1140
ctggatgcac gcttgatcac cgtcgtttcc gatgctgtgg ccaaggctgc catcgaatcc 1200
ggcgtggcta ccctgcctta tccgaagcac tacccgctga ccagcgtgga tgaagtgttc 1260
aacggctga 1269
<210> 6
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Thr Asp Leu Lys Thr Ala Ala Leu Asp Tyr His Ser Gln Pro Arg
1 5 10 15
Pro Gly Lys Leu Ser Val Glu Leu Thr Lys Pro Thr Ala Thr Ala Arg
20 25 30
Asp Leu Ser Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Ala Pro Val Arg Glu
35 40 45
Ile Ala Arg Asp Ala Glu Leu Ala Tyr Arg Tyr Thr Gly Lys Gly Asn
50 55 60
Leu Val Ala Val Ile Ser Asp Gly Thr Ala Ile Leu Gly Leu Gly Asn
65 70 75 80
Leu Gly Pro Leu Ala Ser Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val Leu
85 90 95
Phe Lys Arg Phe Ala Gly Val Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Asp Ala
100 105 110
Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile Asp Thr Val Lys Arg Ile Ser Ile Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu
130 135 140
Ile Glu Arg Ala Leu Ile Glu Gln Cys Asp Ile Pro Val Phe His Asp
145 150 155 160
Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Val Thr Ala Ala Gly Met Leu Asn Ala
165 170 175
Leu Glu Ile Ala Gly Lys Ser Ile Glu Asp Ala Lys Ile Val Cys Leu
180 185 190
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ser Cys Met Lys Leu Leu Val Ser Ile
195 200 205
Gly Ala Lys Ile Glu Asn Ile Phe Met Ile Asp Arg Lys Gly Val Ile
210 215 220
His Ala Gly Arg Asp Asp Leu Asn Gln Tyr Lys Ala Ile Phe Ala His
225 230 235 240
Glu Thr Asp Lys Arg Thr Leu Asp Asp Ala Leu Asp Gly Ala Asp Val
245 250 255
Phe Val Gly Leu Ser Gly Ala Asn Leu Leu Ser Pro Glu Gly Leu Lys
260 265 270
Arg Met Ala Ala Asn Pro Ile Val Phe Ala Cys Ser Asn Pro Asp Pro
275 280 285
Glu Ile Ser Pro Glu Leu Ala His Ala Thr Arg Ser Asp Val Ile Met
290 295 300
Ala Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn Val Leu Gly
305 310 315 320
Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Lys Arg Ile
325 330 335
Asn Glu Glu Met Lys Ile Ala Ala Ala Leu Ala Leu Arg Asp Leu Ala
340 345 350
Lys Leu Pro Val Pro Ala Glu Val Cys Glu Ala Tyr Gly Gly Gln Ser
355 360 365
Leu Glu Phe Gly Arg Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Met Asp Pro Arg
370 375 380
Leu Ile Thr Leu Val Ser Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Ile Glu Ser
385 390 395 400
Gly Val Ala Thr Leu Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Leu Lys Ser Val
405 410 415
Asp Asp Val Phe Val
420
<210> 7
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Thr Asp Leu Lys Thr Ala Ala Leu Glu Tyr His Ala Gln Pro Arg
1 5 10 15
Pro Gly Lys Leu Ser Val Glu Leu Thr Lys Pro Thr Ala Thr Ala Arg
20 25 30
Asp Leu Ser Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Glu Pro Val Arg Glu
35 40 45
Ile Ala Arg Asp Ala Glu Leu Ala Tyr Arg Tyr Thr Gly Lys Gly Asn
50 55 60
Leu Val Ala Val Ile Ser Asp Gly Thr Ala Ile Leu Gly Leu Gly Asn
65 70 75 80
Leu Gly Pro Leu Ala Ser Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val Leu
85 90 95
Phe Lys Arg Phe Ala Gly Val Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Asp Ala
100 105 110
Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile Asp Thr Val Lys Arg Ile Ser Ile Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu
130 135 140
Ile Glu Arg Ala Leu Ile Glu Gln Cys Asp Ile Pro Val Phe His Asp
145 150 155 160
Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Val Thr Ala Ala Gly Met Leu Asn Ala
165 170 175
Leu Glu Ile Ala Gly Lys Thr Leu Glu Gln Ala Lys Ile Val Cys Leu
180 185 190
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ser Cys Met Lys Leu Leu Val Ser Met
195 200 205
Gly Ala Lys Ile Glu Asn Ile Phe Met Ile Asp Arg Lys Gly Val Ile
210 215 220
His Ala Gly Arg Asp Asp Leu Asn Gln Tyr Lys Ala Val Phe Ala His
225 230 235 240
Glu Thr Asp Lys Arg Thr Leu Asp Asp Ala Leu Asp Gly Ala Asp Val
245 250 255
Phe Val Gly Leu Ser Gly Ala Asn Leu Leu Ser Pro Glu Gly Leu Lys
260 265 270
Arg Met Ala Ala Asn Pro Val Val Phe Ala Cys Ser Asn Pro Asp Pro
275 280 285
Glu Ile Ser Pro Glu Leu Ala His Ala Thr Arg Ser Asp Val Ile Met
290 295 300
Ala Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn Val Leu Gly
305 310 315 320
Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Lys Arg Ile
325 330 335
Asn Glu Glu Met Lys Ile Ala Ala Ala Leu Ala Leu Arg Asp Leu Ala
340 345 350
Lys Leu Pro Val Pro Ala Glu Val Ala Ala Ala Tyr Gly Val Asp Ser
355 360 365
Leu Glu Phe Gly Arg Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Met Asp Pro Arg
370 375 380
Leu Ile Thr Leu Val Ser Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Ile Glu Ser
385 390 395 400
Gly Val Ala Thr Leu Pro Tyr Pro Ser His Tyr Pro Leu Lys Ser Val
405 410 415
Asn Asp Val Phe Asn Gly
420
<210> 8
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Ser Asp Leu Lys Thr Ala Ala Leu Glu Tyr His Ala Gln Pro Arg
1 5 10 15
Pro Gly Lys Leu Ser Val Glu Leu Ser Lys Pro Thr Ala Thr Ala Arg
20 25 30
Asp Leu Ala Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Glu Pro Val Arg Glu
35 40 45
Ile Gly Arg Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Lys Tyr Thr Gly Lys Gly Asn
50 55 60
Leu Val Ala Val Ile Ser Asp Gly Thr Ala Ile Leu Gly Leu Gly Asp
65 70 75 80
Leu Gly Pro Leu Ala Ser Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val Leu
85 90 95
Phe Lys Arg Phe Ala Gly Ile Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Glu Ser
100 105 110
Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile Asp Thr Val Arg Arg Ile Ser Ile Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu
130 135 140
Ile Glu Arg Thr Leu Ile Glu Gln Cys Asp Ile Pro Val Phe His Asp
145 150 155 160
Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Val Thr Ala Ala Gly Met Ile Asn Ala
165 170 175
Leu Glu Ile Ala Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ala Lys Ile Val Cys Leu
180 185 190
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ser Cys Met Lys Leu Leu Val Ser Met
195 200 205
Gly Ala Lys Val Glu Asn Ile Phe Met Ile Asp Arg Ser Gly Val Ile
210 215 220
His Ala Gly Arg Asp Asp Leu Asn Gln Tyr Lys Ala Gln Phe Ala His
225 230 235 240
Ala Thr Asp Lys Arg Thr Leu Ala Asp Ala Leu Asp Gly Ala Asp Val
245 250 255
Phe Val Gly Leu Ser Gly Pro Asn Leu Leu Ser Pro Glu Gly Leu Lys
260 265 270
Ser Met Ala Ala Asn Pro Ile Val Phe Ala Cys Ser Asn Pro Asp Pro
275 280 285
Glu Ile Ser Pro Glu Leu Ala His Ala Thr Arg Asn Asp Val Ile Met
290 295 300
Ala Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn Val Leu Gly
305 310 315 320
Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Lys Arg Ile
325 330 335
Asn Glu Glu Met Lys Ile Ala Ala Ala Ile Ala Leu Lys Asp Leu Ala
340 345 350
Lys Leu Pro Val Pro Lys Glu Val Cys Glu Ala Tyr Gly Val Glu Gly
355 360 365
Leu Glu Phe Gly Arg Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Leu Asp Ala Arg
370 375 380
Leu Ile Thr Val Val Ser Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Ile Glu Ser
385 390 395 400
Gly Val Ala Thr Leu Pro Tyr Pro Lys His Tyr Pro Leu Thr Ser Val
405 410 415
Asp Glu Val Phe Asn Gly
420
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaattccat atgtchgaty tyaaaacygc yg 32
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgctcgagt yarccsttga asacrtcrtc 30

Claims (13)

1.一种苹果酸脱氢酶PbMDH，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
其中，所述氨基酸序列具有苹果酸脱氢酶的活性。
2.根据权利要求1所述的苹果酸脱氢酶PbMDH，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶的来源为海洋来源的蒌叶假单胞菌。
3.一种核苷酸，其特征在于，具有编码如权利要求1或2所述的苹果酸脱氢酶PbMDH的核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述核苷酸的序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求4所述的载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞和/或原核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核生物包括大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。
9.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核生物为大肠杆菌。
10.一种制备如权利要求1或2所述的苹果酸脱氢酶PbMDH的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据权利要求3所述核苷酸的序列；
(2)适合表达所述苹果酸脱氢酶的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述苹果酸脱氢酶的多肽。
11.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1或2所述的苹果酸脱氢酶的多肽。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。
13.一种如权利要求1或2所述苹果酸脱氢酶PbMDH或如权利要求3所述的核苷酸用于氧化还原。
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