CN104673808B - 一种苹果酸酶基因及其重组表达载体 - Google Patents

Abstract

一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，本发明公开了一种从深黄被孢霉M6‑22中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中表达，表达产物具有苹果酸酶功能。

Description

一种苹果酸酶基因及其重组表达载体

技术领域

本发明涉及一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，具体涉及从（Mortierella isabellina）M6-22中克隆的苹果酸酶基因以及将该基因直接与不同载体连接，转入不同宿主细胞中，利用其编码苹果酸酶催化苹果酸脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO₂和NADPH，其产生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促进脂肪酸的合成等功能，属于微生物基因工程领域。

背景技术

苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸和CO₂以及NAD(P)+的还原。苹果酸酶广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种：NAD-苹果酸酶（NAD-Malicenzyme，NAD-ME，EC 1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-苹果酸酶（ NADP-Malicenzyme，NADP-ME，EC 1.1.1.40）。本发明主要是针对NADP- 苹果酸酶基因进行研究。

通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH（Song Y D,Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH 和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters, 2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D,Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME 参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH 调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代谢途径（CAM）植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17（2）: 200-204.)。

苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新苹果酸酶基因MIME2，进一步将其插入pET-32a(+)构建重组表达质粒，并实现在E.coli BL21中表达重组苹果酸酶，为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种从深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中分离的苹果酸酶基因MIME2及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1815bp（碱基），其中1-1815为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的多肽或其片段。

本发明另一目的是提供一种含有所分离的苹果酸酶基因MIME2的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。

本发明另一目的是提供一种含有该苹果酸酶基因MIME2或上述重组表达载体的宿主细胞大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21。

本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。

附图说明

图1为利用本发明的深黄被孢霉M6-22苹果酸酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aMIME2质粒图谱；

图2为本发明所构建重组表达质粒pET32aMIME2的酶切分析图；其中：1为DNAMarker；2为基因MIME2的PCR扩增产物；3为pET32aMIME2酶切后条带；4为pET32a(+)酶切后条带；

图3为本发明的苹果酸酶基因MIME2诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中：1为1为蛋白电泳Marker；2为转化了pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为转化了pET32aMIME2并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；4为纯化的目的蛋白条带。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：深黄被孢霉苹果酸酶基因MIME2的克隆

采用OMEGA试剂盒E.Z.N.A Fungal RNA Kit从深黄被孢霉(Mortierella isabellina)中提取总RNA，用反转录试剂盒Thermo Scientific Maxima H Minus FirstStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1ul为模板进行聚合酶链式反应。设计引物（引物1和引物2）进行PCR 扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物1：MIME2F2：5`-CGGGATCCATGCTGCAAAGACGTTTGGC-3` （SEQ ID NO:3）

引物2：MIME2R2：5`-CCCTCGAGTTAGGGAGAATAGACCAGAGG-3`（SEQ ID NO:4）

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5μmol/L） 5μL

cDNA 1μL

MIMEF1（10μmol/L） 1μL

MIMER1（10μmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50 μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 45s、57.5℃ 45s、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min，反应完后取产物1μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1815bp长的序列，命名为MIME2，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：重组表达质粒pET32aMIME2的构建

采用实施例1中测cDNA为模板进行PCR 扩增，反应所用引物组合、反应组分和扩增条件如下：

引物1：MIME2F2：5`- CGGGATCCATGCTGCAAAGACGTTTGGC-3` （SEQ ID NO:3）

引物3：MIME2R3：5`-CCCTCGAGGGGAGAATAGACCAGAGG-3`（SEQ ID NO:5）

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5μmol/L） 5μL

MI3410cDNA 1μL

MI2410MEF1（10μmol/L） 1μL

MI2410MER1（10μmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 45s、57.5℃ 45s、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min；

将按照上述条件PCR获得基因片段MIME2和表达载体pET-32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ核酸内切酶进行双酶切，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pET32aMIME2，该质粒图谱如图1所示。进一步进行双酶切分析鉴定，如图2第3泳道所示，用BamH I和Xho I双酶切，重组质粒产生两条带，小分子条带与泳道2中该基因的PCR产物大小一致，大分子条带与泳道4中用相同两个内切酶酶切pET32a（+）产生的条带大小一致，表明所构建的重组表达质粒正确，进一步测序分析也证明这一点。此外，通过核苷酸序列所编码的氨基酸相似性搜索表明，该基因编码的蛋白与真菌来源的苹果酸酶相似，但不完全相同。

实施例3：苹果酸酶基因MIME2在大肠杆菌BL21中的诱导表达

1、MIME2苹果酸酶蛋白的诱导表达

为了验证该基因编码蛋白的活性，将1μg重组质粒pET32aMIME2加入50μl 大肠杆菌BL21感受态细胞中，将整个体系冰浴30min之后于42℃热击90s，再次冰浴2min，然后将连接体系吸取并加入至950µl LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡孵育1h。孵育结束后于2000×g离心3~5 min，留下约50μl上清液从新悬浮沉淀的菌体后涂布于含有氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。经菌落PCR筛选阳性克隆后，挑取阳性转化子于100 mLLB（含100 μg/mL氨苄霉素）培养基中，37 ℃振荡培养至OD ₆₀₀达到0.6左右，按1%比例接种到1L新鲜的 LB液体培养基中，于37℃、160rpm培养至OD ₆₀₀值约为0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃恒温摇床80 rpm诱导培养12小时。12000 rpm离心10min收集菌体，SDS-PAGE分析显示，pET32aMIME2转化的大肠杆菌中表达出一条分子量约为70kD的蛋白（见图3泳道3），但在空载体pET32a（+）转化的大肠杆菌中没有（见图3泳道2）。进一步用该菌体悬浮于适量（使菌悬液的OD₆₀₀≈20）30 mM的咪唑缓冲液中，冰上超声破碎细胞，4℃、14000 rpm离心15 min。将离心后的上清液用0.2 μm的微型滤膜过滤，滤液上样于已用30mM咪唑缓冲液平衡好的His Trap HP柱（1 ml， GE Healthcare），用200mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一纯蛋白条带（见图3泳道4）。

2、MIME2苹果酸酶的酶活测定

苹果酸酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO₂和NADPH。 由于苹果酸酶的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH的浓度变化呈线性关系，所以ME的活性可通过检测NADPH的浓度变化来测定，NADPH浓度升高越多则ME活力越大。以苹果酸和NAD⁺为底物加入苹果酸酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活。酶活单位定义：一个酶活力单位是指30℃时每分钟生成1 nmolNADPH所需的酶量。

苹果酸酶MIME2酶活按如下公式计算：

E=[V/(ε×D×p×v)]/ [(Δe/Δt) ] ×1000

=[2/(6.22×1×0.2×0.4633)] ×(2.033/30) ×1000

=235.14U/mg

V-----反应溶液最终体积(ml)

ε-----340nm处测定的NADPH的吸光度（6.22）

D-----光路长（1cm）（比色皿直径）

v-----酶液体积（ml）

p-----蛋白质浓度（mg/ml）

Δe/Δt----单位时间内吸光度的变化

结果显示，所纯化的MIME2苹果酸酶的酶活为235.14 u/mg，表明基因重组载体在大肠杆菌 BL21中诱导表达出来的MIME2苹果酸酶具有苹果酸酶的活性。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种苹果酸酶基因及其重组表达载体

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1815

<212> DNA

<213> 深黄被孢霉

<400> 1

atgctgcaaa gacgtttggc tgcaacattg cgctcccacg ctttcaagcg ttcctattcc 60

tccattggcg tttttcctga tctggtcaag gacaagaccg tccagatcac aaactcccgg 120

ggtgttaatg tcattcatga cccattgctc tccaagggta ccgctttcag tattgccgag 180

cgagaacgct tgtccctgcg tgggctcgtc ccccctcggt gccaggaaat ggataagcag 240

ttggctcgcg tcaaggccaa cttggacgct tgcgaaactc ccttgtccaa gtttgtgttt 300

gtcacagctt tgcaagatcg taacgagaca ctgttctatc gcttgttgat cgataatttg 360

gaagaattgg ccggtattat ctacacgcca acagtcggtt tggcctgcca aaaattccat 420

tctatctaca gacgttcaag aggcatgtac ttttctactc aagatcgtgg agccatgtct 480

gccatggtct acaattggcc tcaagatgaa gtggatgtca ttgtagtaac tgacggatca 540

agagtcctgg gtttgggtga cctgggagct aatggcatgc agattcctat tggcaaactg 600

agtttgtatg ttgctgcagg aggtattcgc cccaaggcca ttttgccagt ggttttggat 660

gttggaacaa ataatgaaaa actgttgcat gatcctctct acctcggaat gggccatcct 720

cgcttggaaa gtgaagatta ctatgaattc gttgatgagt gggttaacgc cgtcaaagcc 780

agatggccaa atgcgcttat tcaattcgaa gatttcaagt acccgcatgc ctacaatttg 840

ctgaacaaat accgtgatga aatcacttgc ttcaatgacg atattcaatc tacttccgca 900

atcaccctgg ctggtatcct cgctgccctc aaggctcgtg gtaaaaagat tgacgacctc 960

gctgaagaac gaattgtctg tgtcggtgct ggttcagctg gtgtcggtgt ttgtgaaggc 1020

attgtcgatt gcatggtcgc gcagggcaag gtccgcactc gcgaagaagc ttattcccgt 1080

atttggatgt tggatcagta tggtttgata ggtaactctg ccatcgctga cggtgaaccc 1140

aatcgcatcg gccaaggccc caaccgtcct gacaaactgg atgagcgcca aagaagttat 1200

accaagatgg atttgcctga tcgcataagt ttggaagaag tggttgaaaa ggtcaaacct 1260

acagtattgc tcggattgac tggtgtcaag ggcgccttca ctgagaaatc cattcgcacc 1320

atggctcagc ataccgagaa acctgtggtt ttccccttga gcaaccctga tacgcatgcc 1380

gaatgttcgg ctgaagaagc tttcaagtgg accaacggaa aggctatctt tgcttccggt 1440

tctcctttca aggatgtcac ccttcctaat ggccaggttt gcaaaaccaa ccaatgcaac 1500

aactcttatt ctttccccgg tctaggcctc ggcattactg tctctcgtgc caccaaggta 1560

acccctacca tgttcctcga aactgccaaa actattgccg agcttgcttc acctgctcag 1620

ctcaaggaag gtatcttgtt cccgggtgtt gcccaacttc gacaggtgtc ttgcgctgtc 1680

ggtactcgtg tgtgtgaggt cgcttacgag gaaggcgtgg ctagtgccaa actcaaggaa 1740

ggagaaattt tgtcagaggt cgtcaaggct tccatgtttg agccagaata cgttcctctg 1800

gtctattctc cctaa 1815

<210> 2

<211> 604

<212> PRT

<213> 深黄被孢霉

<400> 2

MET Leu Gln Arg Arg Leu Ala Ala Thr Leu Arg Ser His Ala Phe

1 10 15

Lys Arg Ser Tyr Ser Ser Ile Gly Val Phe Pro Asp Leu Val Lys

20 30

Asp Lys Thr Val Gln Ile Thr Asn Ser Arg Gly Val Asn Val Ile

40 45

His Asp Pro Leu Leu Ser Lys Gly Thr Ala Phe Ser Ile Ala Glu

50 60

Arg Glu Arg Leu Ser Leu Arg Gly Leu Val Pro Pro Arg Cys Gln

70 75

Glu MET Asp Lys Gln Leu Ala Arg Val Lys Ala Asn Leu Asp Ala

80 90

Cys Glu Thr Pro Leu Ser Lys Phe Val Phe Val Thr Ala Leu Gln

100 105

Asp Arg Asn Glu Thr Leu Phe Tyr Arg Leu Leu Ile Asp Asn Leu

110 120

Glu Glu Leu Ala Gly Ile Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Leu Ala

130 135

Cys Gln Lys Phe His Ser Ile Tyr Arg Arg Ser Arg Gly MET Tyr

140 150

Phe Ser Thr Gln Asp Arg Gly Ala MET Ser Ala MET Val Tyr Asn

160 165

Trp Pro Gln Asp Glu Val Asp Val Ile Val Val Thr Asp Gly Ser

170 180

Arg Val Leu Gly Leu Gly Asp Leu Gly Ala Asn Gly MET Gln Ile

190 195

Pro Ile Gly Lys Leu Ser Leu Tyr Val Ala Ala Gly Gly Ile Arg

200 210

Pro Lys Ala Ile Leu Pro Val Val Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn

220 225

Glu Lys Leu Leu His Asp Pro Leu Tyr Leu Gly MET Gly His Pro

230 240

Arg Leu Glu Ser Glu Asp Tyr Tyr Glu Phe Val Asp Glu Trp Val

250 255

Asn Ala Val Lys Ala Arg Trp Pro Asn Ala Leu Ile Gln Phe Glu

260 270

Asp Phe Lys Tyr Pro His Ala Tyr Asn Leu Leu Asn Lys Tyr Arg

280 285

Asp Glu Ile Thr Cys Phe Asn Asp Asp Ile Gln Ser Thr Ser Ala

290 300

Ile Thr Leu Ala Gly Ile Leu Ala Ala Leu Lys Ala Arg Gly Lys

310 315

Lys Ile Asp Asp Leu Ala Glu Glu Arg Ile Val Cys Val Gly Ala

320 330

Gly Ser Ala Gly Val Gly Val Cys Glu Gly Ile Val Asp Cys MET

340 345

Val Ala Gln Gly Lys Val Arg Thr Arg Glu Glu Ala Tyr Ser Arg

350 360

Ile Trp MET Leu Asp Gln Tyr Gly Leu Ile Gly Asn Ser Ala Ile

370 375

Ala Asp Gly Glu Pro Asn Arg Ile Gly Gln Gly Pro Asn Arg Pro

380 390

Asp Lys Leu Asp Glu Arg Gln Arg Ser Tyr Thr Lys MET Asp Leu

400 405

Pro Asp Arg Ile Ser Leu Glu Glu Val Val Glu Lys Val Lys Pro

410 420

Thr Val Leu Leu Gly Leu Thr Gly Val Lys Gly Ala Phe Thr Glu

430 435

Lys Ser Ile Arg Thr MET Ala Gln His Thr Glu Lys Pro Val Val

440 450

Phe Pro Leu Ser Asn Pro Asp Thr His Ala Glu Cys Ser Ala Glu

460 465

Glu Ala Phe Lys Trp Thr Asn Gly Lys Ala Ile Phe Ala Ser Gly

470 480

Ser Pro Phe Lys Asp Val Thr Leu Pro Asn Gly Gln Val Cys Lys

490 495

Thr Asn Gln Cys Asn Asn Ser Tyr Ser Phe Pro Gly Leu Gly Leu

500 510

Gly Ile Thr Val Ser Arg Ala Thr Lys Val Thr Pro Thr MET Phe

520 525

Leu Glu Thr Ala Lys Thr Ile Ala Glu Leu Ala Ser Pro Ala Gln

530 540

Leu Lys Glu Gly Ile Leu Phe Pro Gly Val Ala Gln Leu Arg Gln

550 555

Val Ser Cys Ala Val Gly Thr Arg Val Cys Glu Val Ala Tyr Glu

560 570

Glu Gly Val Ala Ser Ala Lys Leu Lys Glu Gly Glu Ile Leu Ser

580 585

Glu Val Val Lys Ala Ser MET Phe Glu Pro Glu Tyr Val Pro Leu

590 600

Val Tyr Ser Pro ***

604

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccat gctgcaaaga cgtttggc 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccctcgagtt agggagaata gaccagagg 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctcgaggg gagaatagac cagagg 26

Claims (3)

1.一种苹果酸酶基因MIME2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。

2.一种含有权利要求1所述苹果酸酶基因MIME2的重组表达载体。

3.一种宿主表达细胞，所述宿主细胞含有权利1所述的苹果酸酶基因MIME2或权利要求2所述的重组表达载体。