CN104894147B - 一种苹果酸酶基因及其重组表达载体 - Google Patents

Abstract

一种苹果酸酶基因及其重组表达载体。本发明公开了一种从深黄被孢霉M6‑22中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中表达，表达产物具有苹果酸酶功能。

Description

一种苹果酸酶基因及其重组表达载体

技术领域

本发明涉及一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，具体涉及从深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中克隆的苹果酸酶基因以及将该基因直接与不同载体连接，转入不同宿主细胞中，利用其编码苹果酸酶催化苹果酸脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO₂和NADPH，其产生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促进脂肪酸的合成等功能，属于微生物基因工程领域。

背景技术

苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸和CO₂以及NAD(P)⁺的还原。苹果酸酶广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种：NAD-苹果酸酶（NAD-Malicenzyme，NAD-ME，EC 1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-苹果酸酶（ NADP-Malicenzyme，NADP-ME，EC 1.1.1.40）。本发明主要是针对NADP- 苹果酸酶基因进行研究。

通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH（Song Y D,Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH 和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters, 2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D,Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME 参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH 调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代谢途径（CAM）植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17（2）: 200-204.)。

苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新苹果酸酶基因MIME1，进一步将其插入pET-32a(+)构建重组表达质粒，并实现在E.coli BL21中表达重组苹果酸酶，为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种从深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中分离的苹果酸酶基因MIME1及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1821bp（碱基），其中1-1821为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的多肽或其片段。

本发明另一目的是提供一种含有所分离的苹果酸酶基因MIME1的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。

本发明另一目的是提供一种含有该苹果酸酶基因MIME1或上述重组表达载体的宿主细胞大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21。

本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。

附图说明

图1为利用本发明的深黄被孢霉M6-22苹果酸酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aMIME1质粒图谱；

图2为本发明所构建重组表达质粒pET32aMIME1的酶切分析图；其中：1为DNAMarker；2为基因MIME1的PCR扩增产物；3为pET32aMIME1酶切后条带；4为pET32a(+)酶切后条带；

图3为本发明的苹果酸酶基因MIME1诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中：1为转化了pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；2为转化了pET32aMIME1并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为纯化的目的蛋白条带；4为蛋白电泳Marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：深黄被孢霉苹果酸酶基因MIME1的克隆

采用OMEGA试剂盒E.Z.N.A Fungal RNA Kit从深黄被孢霉(Mortierella isabellina)中提取总RNA，用反转录试剂盒Thermo Scientific Maxima H Minus FirstStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1μl为模板进行聚合酶链式反应。设计引物（引物1和引物2）进行PCR 扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物1：MIME1F1：5`- CGGGATCCATGTCACCTACCGTATCCGT -3` （SEQ ID NO:3）

引物2：MIME1R1：5`- CCCTCGAGTTAGATCTTGCTGATAGACTTTTC-3`（SEQ ID NO:4）；

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5 µmol/L） 5μL

cDNA 1μL

MIME1F2（10 µmol/L） 1μL

MIME1R2（10 µmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/µL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50 μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 45s、57.5℃ 45s、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min，反应完后取产物1μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1821bp长的序列，命名为MIME1，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：重组表达质粒pET32aMIME1的构建

采用实施例1中测cDNA为模板进行PCR 扩增，反应所用引物组合、反应组分和扩增条件如下：

引物1：MIME1F1：5`-CGGGATCCATGTCACCTACCGTATCCGT-3`（SEQ ID NO:3）

引物2：MIME1R2：5`-CCCTCGAGGATCTTGCTGATAGACTTTTC-3`（SEQ ID NO:5）；

PCR扩增体系（50 µL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5 µmol/L） 5μL

cDNA 1μL

MIMEF1（10 µmol/L） 1μL

MIMER1（10 µmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/µL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 45s、57.5℃ 45s、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min；

将按照上述条件PCR获得基因片段MIME1和表达载体pET-32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ核酸内切酶进行双酶切，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pET32aMIME1，该质粒图谱如图1所示。进一步进行双酶切分析鉴定，如图2第3泳道所示，用BamH I和Xho I双酶切，重组质粒产生两条带，小分子条带与泳道2中该基因的PCR产物大小一致，大分子条带与泳道4中用相同两个内切酶酶切pET32a（+）产生的条带大小一致，表明所构建的重组表达质粒正确，进一步测序分析也证明这一点。此外，通过核苷酸序列所编码的氨基酸相似性搜索表明，该基因编码的蛋白与真菌来源的苹果酸酶相似，但不完全相同。

实施例3：苹果酸酶基因MIME1在大肠杆菌BL21中的诱导表达

1、MIME1苹果酸酶蛋白的诱导表达

为了验证该基因编码蛋白的活性，将1μg重组质粒pET32aMIME1加入50μl 大肠杆菌BL21感受态细胞中，将整个体系冰浴30min之后于42℃热击90s，再次冰浴2min，然后将连接体系吸取并加入至950µl LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡孵育1h。孵育结束后于2000×g离心3~5 min，留下约50μl上清液从新悬浮沉淀的菌体后涂布于含有氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。经菌落PCR筛选阳性克隆后，挑取阳性转化子于100 mLLB（含100 μg/mL氨苄霉素）培养基中，37℃振荡培养至OD ₆₀₀达到0.6左右，按1%比例接种到1L新鲜的 LB液体培养基中，于37℃、160rpm培养至OD ₆₀₀值约为0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃恒温摇床80 rpm诱导培养12小时。12000 rpm离心10min收集菌体，SDS-PAGE分析显示，pET32aMIME1转化的大肠杆菌中表达出一条分子量约为70kD的蛋白（见图3泳道2），但在空载体pET32a（+）转化的大肠杆菌中没有（见图3泳道1）。进一步用该菌体悬浮于适量（使菌悬液的OD₆₀₀≈20）30 mM的咪唑缓冲液中，冰上超声破碎细胞，4℃、14000 rpm离心15 min。将离心后的上清液用0.2 μm的微型滤膜过滤，滤液上样于已用30mM咪唑缓冲液平衡好的His Trap HP柱（1 ml，GE Healthcare），用200mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一纯蛋白条带（见图3泳道3）。

2、MIME1苹果酸酶的酶活测定

苹果酸酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO₂和NADPH。 由于苹果酸酶的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH的浓度变化呈线性关系，所以ME的活性可通过检测NADPH的浓度变化来测定，NADPH浓度升高越多则ME活力越大。以苹果酸和NAD⁺为底物加入苹果酸酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活。酶活单位定义：一个酶活力单位是指30℃时每分钟生成1 nmol NADPH所需的酶量。

MIME1苹果酸酶酶活按如下公式计算：

E=[V/(ε×D×P×V)] ×[Δe/Δt] ×1000

=[2/(6.220×1×0.4625×0.4)] ×[(1.314-0.293)/10min] ×1000

=177.46 u/mg

V-----反应溶液最终体积(ml)

ε-----340nm处测定的NADPH的吸光度（6.220）

D-----光路长（1cm）（比色皿直径）

V-----酶液体积（ml）

P-----蛋白质浓度（mg/ml）

Δe/Δt----单位时间内吸光度的变化

结果显示，所纯化的MIME1苹果酸酶的酶活为292.84 u/mg，表明基因重组载体在大肠杆菌 BL21中诱导表达出来的MIME1苹果酸酶具有苹果酸酶的活性。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种苹果酸酶基因及其重组表达载体

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1821

<212> DNA

<213> 深黄被孢霉

<400> 1

atgtcaccta ccgtatccgt gtcgtccgct ggaattcccg tttccaccaa gtcacattct 60

ggtgtaggag caaacaacca aactggtgtc tctgtggatc tggtatctaa gagtcattat 120

cacaatgaag gtactgccat gcatcacaca acccgtaagg ctttgggtgt tcacggtctt 180

gctccttccc gcattgagag tcttgaaatt caaaagcgta gagctatggt tcaacttcgt 240

tccaaggaat ccatgatgga aaaatatatt ttcatggctc aaatgcgaaa taccaacatt 300

cgcttgttct acaagattgt ttgtgatgaa ttagaggaac tcgcacctgt catctacacc 360

cctactgttg ggcatgcttg tgttgaatgg tctaatatct acccattcct tgccccacct 420

ggaaccccag atggtctcta tctcacccaa gccgacttgc ccaacattaa ggagttgatc 480

cgaacctatc agccattccc taccgaccct cacccattct cccccgagat tgctgtcatt 540

tctgatggtt cccgtatctt gggtcttggt gatcttggtg tcaacggcat gggtattcct 600

attggcaagc ttcaactcta tgttgctggt gctggtattg atcctcgtcg taccttgccc 660

atcatgttgg atcttggtac taacaacgag aagtttttgg aggatgactt ctatctcggt 720

gttcgtaaca agcgtcccaa cgatgatgtc ttttatgatg ccgttgacca agtgctctct 780

gctttgtata gcgaattccc tgagttgctc gttcaattcg aagattggtc ttctgagcac 840

gctttcggac ttcttgagaa gtatcaacac aagaccttct gtttcaatga tgacattcaa 900

ggcactggtg ctgtcattct ttctggtctc atgaacgcct acaaggttgt tgcaaacgaa 960

gataaggtcg ctcccaagga tcaccgtatc gtctttttcg gtgccggctc tgctggtatt 1020

ggtgttgcta agcaaatcaa ggattacttt gtcatcgagc acggatttac cgaagaggaa 1080

gctcgcaagg tgttctacat tgttgattct aagggtttga tcaccaacga tcgtggtgac 1140

cgtcttgctg aacacaagaa gtatttcagc cgcgatgata acaacggcca acaatttaag 1200

gatcttcttg agatcatcaa ctatgtcaag cccacaactt tgattggtct ttcatctcaa 1260

ccccagactt tcactgaacc catcttgcgt cgcatggctg agctcaacaa gcaacccatt 1320

gtattcccct tgtccaaccc aagcactcaa gccgaatgta cctttgccca agctatggag 1380

ttcactgaca accgtgtact ctttgcttct ggtactgctt tcccaaccta caccatcact 1440

gagactggtg ctgttaagat tcccggccaa ggcaacaact tctatatctt ccctggactt 1500

ggtcttggtg cctccattgc caagcctgct catatcaccg ataacatggt gtatcaatct 1560

gccgctgctc ttgccgactg cttgactccc gaagaaaagg ccgatcgtcg cttgtatccc 1620

aacttaaagc gtattagaca aatcagtgca gaagttgctg ctgctgtctg tatcgaggct 1680

gttaaggagg gccttgctcg caactcagaa attgagaccg ttgtcaagga tcgtgatcaa 1740

ctcatcaaat acgttatgga gcgtatgtgg accccagagt ctgacggcta tggtgccgaa 1800

aagtctatca gcaagatcta a 1821

<210> 2

<211> 606

<212> PRT

<213> 深黄被孢霉

<400> 2

MET Ser Pro Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Gly Ile Pro Val Ser

1 10

Thr Lys Ser His Ser Gly Val Gly Ala Asn Asn Gln Thr Gly Val

20 30

Ser Val Asp Leu Val Ser Lys Ser His Tyr His Asn Glu Gly Thr

40

Ala MET His His Thr Thr Arg Lys Ala Leu Gly Val His Gly Leu

50 60

Ala Pro Ser Arg Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gln Lys Arg Arg Ala

70

MET Val Gln Leu Arg Ser Lys Glu Ser MET MET Glu Lys Tyr Ile

80 90

Phe MET Ala Gln MET Arg Asn Thr Asn Ile Arg Leu Phe Tyr Lys

100

Ile Val Cys Asp Glu Leu Glu Glu Leu Ala Pro Val Ile Tyr Thr

110 120

Pro Thr Val Gly His Ala Cys Val Glu Trp Ser Asn Ile Tyr Pro

130

Phe Leu Ala Pro Pro Gly Thr Pro Asp Gly Leu Tyr Leu Thr Gln

140 150

Ala Asp Leu Pro Asn Ile Lys Glu Leu Ile Arg Thr Tyr Gln Pro

160

Phe Pro Thr Asp Pro His Pro Phe Ser Pro Glu Ile Ala Val Ile

170 180

Ser Asp Gly Ser Arg Ile Leu Gly Leu Gly Asp Leu Gly Val Asn

190

Gly MET Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu Gln Leu Tyr Val Ala Gly

200 210

Ala Gly Ile Asp Pro Arg Arg Thr Leu Pro Ile MET Leu Asp Leu

220

Gly Thr Asn Asn Glu Lys Phe Leu Glu Asp Asp Phe Tyr Leu Gly

230 240

Val Arg Asn Lys Arg Pro Asn Asp Asp Val Phe Tyr Asp Ala Val

250

Asp Gln Val Leu Ser Ala Leu Tyr Ser Glu Phe Pro Glu Leu Leu

260 270

Val Gln Phe Glu Asp Trp Ser Ser Glu His Ala Phe Gly Leu Leu

280

Glu Lys Tyr Gln His Lys Thr Phe Cys Phe Asn Asp Asp Ile Gln

290 300

Gly Thr Gly Ala Val Ile Leu Ser Gly Leu MET Asn Ala Tyr Lys

310

Val Val Ala Asn Glu Asp Lys Val Ala Pro Lys Asp His Arg Ile

320 330

Val Phe Phe Gly Ala Gly Ser Ala Gly Ile Gly Val Ala Lys Gln

340

Ile Lys Asp Tyr Phe Val Ile Glu His Gly Phe Thr Glu Glu Glu

350 360

Ala Arg Lys Val Phe Tyr Ile Val Asp Ser Lys Gly Leu Ile Thr

370

Asn Asp Arg Gly Asp Arg Leu Ala Glu His Lys Lys Tyr Phe Ser

380 390

Arg Asp Asp Asn Asn Gly Gln Gln Phe Lys Asp Leu Leu Glu Ile

400

Ile Asn Tyr Val Lys Pro Thr Thr Leu Ile Gly Leu Ser Ser Gln

410 420

Pro Gln Thr Phe Thr Glu Pro Ile Leu Arg Arg MET Ala Glu Leu

430

Asn Lys Gln Pro Ile Val Phe Pro Leu Ser Asn Pro Ser Thr Gln

440 450

Ala Glu Cys Thr Phe Ala Gln Ala MET Glu Phe Thr Asp Asn Arg

460

Val Leu Phe Ala Ser Gly Thr Ala Phe Pro Thr Tyr Thr Ile Thr

470 480

Glu Thr Gly Ala Val Lys Ile Pro Gly Gln Gly Asn Asn Phe Tyr

490

Ile Phe Pro Gly Leu Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ala Lys Pro Ala

500 510

His Ile Thr Asp Asn MET Val Tyr Gln Ser Ala Ala Ala Leu Ala

520

Asp Cys Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ala Asp Arg Arg Leu Tyr Pro

530 540

Asn Leu Lys Arg Ile Arg Gln Ile Ser Ala Glu Val Ala Ala Ala

550

Val Cys Ile Glu Ala Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Asn Ser Glu

560 570

Ile Glu Thr Val Val Lys Asp Arg Asp Gln Leu Ile Lys Tyr Val

580

MET Glu Arg MET Trp Thr Pro Glu Ser Asp Gly Tyr Gly Ala Glu

590 600

Lys Ser Ile Ser Lys Ile***

606

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccat gtcacctacc gtatccgt 28

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccctcgagtt agatcttgct gatagacttt tc 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctcgagga tcttgctgat agacttttc 29

Claims (3)

1.一种苹果酸酶基因MIME1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。

2.一种含有权利要求1所述苹果酸酶基因MIME1的重组表达载体。

3.一种宿主表达细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的苹果酸酶基因MIME1或权利要求2所述的重组表达载体。