KR100769932B1

KR100769932B1 - 시토크롬 씨 옥시다아제 효소 복합체

Info

Publication number: KR100769932B1
Application number: KR1020000068115A
Authority: KR
Inventors: 아사쿠라아키라; 호시노다츠오; 신조마사코
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 1999-11-17
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2007-10-24
Also published as: JP2001169792A; US6869785B1; CN1807651A; CN1303928A; BR0005443A; US7842483B2; MXPA00011249A; NO20005799L; NO20005799D0; CN100475969C; CN1325641C; ID28352A; JP4727033B2; AU7166300A; KR20010051741A; US20050123989A1; CA2324414A1

Abstract

본 발명은 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체, 이 복합체의 제조에 유용한 유전 물질, 예를 들면 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드, 재조합 DNA 단편, 발현벡터, 재조합 유기체 등에 관한 것이다. 이들 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체 및 유전 물질은 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물로부터 유래될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 제조방법 및 2-케토-L-굴론산(2KGA)의 제조방법을 제공한다.

Description

시토크롬 씨 옥시다아제 효소 복합체{CYTOCHROME C OXIDASE ENZYME COMPLEX}

도 1은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 aa3형 시토크롬 c 옥시다아제의 흡수 스펙트럼 패턴을 나타낸다. 스펙트럼은 0.5% 수크로스 모노라우레이트 및 5% 글리세롤을 함유하는 25mM Na-HEPES(pH 7.5)중 0.08mg/ml의 단백질 농도로 실온에서 기록하였다. A는 산화형의 스펙트럼을 나타낸다. B는 환원형의 스펙트럼을 나타낸다. C는 환원형과 산화형의 차 스펙트럼을 나타낸다.

도 2는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 정제된 시토크롬 c 옥시다아제 aa3의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 이 정제 효소(단백질 농도 0.5mg/ml)는 2% SDS, 50mM 디티오에리트리톨, 62.5mM 트라이스-HCl(pH 6.8) 및 10% 글리세롤을 사용하여 37℃에서 5시간 동안 배양함으로써 변성시켰다. 전기이동은 25mM 트라이스, 0.192M 글리신 및 0.1% SDS로 구성된 완충액을 사용하여 램리(Laemmli)(Nature, 227: 680-685, 1970)의 방법에 따라 12.5%의 아크릴아미드 농도에서 수행하였다. A 및 B는 각각 6 및 3㎍의 정제 효소이었다. C는 하부영역이 사전염색된 SDS-PAGE 표준(미국 캘리포니아주 소재 바이오-래드 래보러토리스(Bio-Rad Laboratories))이었다.

도 3은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터의 CO I의 부분 아미노산 서열과 기타 유기체로부터의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸다.

도 4는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터의 CO II의 부분 아미노산 서열과 기타 유기체로부터의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸다.

도 5는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터의 CO III의 부분 아미노산 서열과 기타 유기체로부터의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸다.

도 6은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 부분 CO I, II 및 III 유전자의 PCR 증폭용 프라이머를 나타낸다.

도 7은 각각 "CO I" 및 "CO II 및 III" 유전자를 함유하는 8.0kb PstI 및 9.3kb EcoRI 단편의 물리적 지도를 나타낸다.

도 8은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 CO I 소단위체의 완전 아미노산 서열과 기타 유기체로부터의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸다.

도 9는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 유전자를 발현시키는데 사용된 pVKcoxes의 유전자 지도를 나타낸다.

본 발명은 2-케토-L-굴론산의 재조합 생산방법 및 그것에 유용한 생물학적 물질에 관한 것이다.

시토크롬 c 옥시다아제(시토크롬 aa3; EC 1.9.3.1)는 미토콘드리아 및 많은 박테리아의 호기적 호흡 전자전달계에 있어서의 말단 옥시다아제 효소이다. 이 효소는 세포질막에 놓이는 복합체로서, 최종 전자배출; 페리플라즘 표면에서의 페로시토크롬 c(전자공여체) 재산화/세포질 표면에서의 분자산소(전자수용체)의 물로의 환원을 촉매한다. 이 반응은 막을 가로지르는 양성자의 방출과 결합되고 이 결합은 기질산화로부터의 생물학적 에너지 보존에 필수적이다.

시토크롬 복합체의 여러 가지 유형, 예를 들면 aa3, caa3, o, bo, co, bd형이 기능성 말단 옥시다아제로서 동정되어 왔고, 일부 말단 옥시다아제의 정제 및 특성화가 보고되어 왔다. 마츠시타(Matsushita) 등은 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti) IFO 3283이 2가지의 말단 옥시다아제, 즉 시토크롬 a1 및 o를 함유하고 있다고 보고하였고 시토크롬 a1을 정제 및 특성화하였다(Proc. Nacl. Acad. Sci., USA, 87: 9863, 1990; J. Bacteriol. 174: 122, 1992). 마츠시타 등은 또한 글루코노박터로부터의 시토크롬 o의 정제를 보고하였다(Biochem. Biophys. Acta, 894: 304, 1987). 다야마(Tayama) 등은 아세토박터 아세티의 말단 옥시다아제(시토크롬 a1) 유전자를 개시하였고, 72, 34, 21 및 13kDa의 4가지 소단위체로 구성되고 헴 a 및 헴 b를 함유한 옥시다아제 효소를 정제하였다. 아세토박터 및 글루코노박터내의 옥시다아제는 퀴놀 옥시다아제에 속한다. 시토크롬 aa3(시토크롬 c 옥시다아제)은 소 심장, 효모 그리고 파라콕커스 데니트리피칸스(Paracoccous denitrificans)(Solioz et al., J. Biol. Chem., 257: 1579-1582, 1982) 및 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)(Hosler et al., J. Biol. Chem., 267: 24264-24272, 1992)를 포함한 많은 박테리아로부터 정제되어 왔다.

포유류(미토콘드리아) 시토크롬 c 옥시다아제(aa3형) 복합체는 13가지의 상이한 소단위체를 함유하고 있고, 3가지의 코어 소단위체 I, II 및 III(CO I, II 및 III)은 미토콘드리아 DNA에 의해 암호화되는데 대하여 나머지 10가지는 핵 개시점에 의해 암호화된다. 박테리아 aa3형 시토크롬 c 옥시다아제는 또한 3가지의 코어 소단위체를 함유하고 있고, 이것은 미토콘드리아 코어 소단위체와 상동이다. 그러나 CO III은 정제 동안 쉽게 손실되어 CO I 및 CO II만으로 구성된 제제가 얻어졌다고 보고되어 있다(Ludwig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 196-200, 1980). 2가지의 소단위체(CO I 및 II)로 구성된 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 전기화학적 양성자 구배의 발생과 함께 산화환원 활성을 나타내었다. 파라콕커스 데니트리피칸스(Haltia et al., The EMBO Journal, 10: 2015-2021, 1991) 및 로도박터 스페로이데스(Cao et al., Gene, 101: 133-137, 1991)의 경우에는, 복합체의 2가지 소단위체형(CO I/II) 및 3가지 소단위체형(CO I/II/III)의 양자 모두가 상이한 정제방법으로 분리되었다. 일반적으로 CO II 및 III에 대한 유전자는 오페론내에 위치하는데 대하여 CO I에 대한 유전자는 독립적으로 위치한다(Raitio et al., The EMBO Journal, 9: 2825-2833, 1987, Shapleigh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4786-4790, 1992).

상기한 바와 같은 말단 옥시다아제는 분자산소의 환원을 이루기 위해 호기성 조건하의 성장에서 중요한 역할을 한다. 산화적 발효에서, 말단 옥시다아제를 포함하는 호흡사슬은 기질의 산화를 종료하여 산화생성물을 생성하는데 작용한다. 이와 관련하여 유효한 산화적 발효를 위해서는 호흡사슬의 유효성을 개선하는 것이 매우 중요하다.

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025는 L-소르보스로부터 L-소르보손을 거쳐 L-아스코르브산을 제조하는 방법에서 중요한 매개물질인 2-케토-L-굴론산(이하, 2KGA)을 생성한다(티. 호시노(T. Hoshino) 등의 EP 0 366 922 A). 기질인 L-소르보스의 2KGA로의 산화는 호흡 전자전달사슬에 의해 종료되는 것으로 간주되었다. 산소로의 최종 전자배출을 촉매하는 말단 옥시다아제는 2KGA 생성계 뿐만 아니라 다른 산화환원 성분에 있어서도 반응속도를 한정하는 단계의 것일 수 있다. L-소르보스로부터의 2KGA 생성의 원인이 되는 1차 탈수소효소가 분리되었고(티. 호시노 등의 EP 606621 A) 그 유전자가 클로닝 및 서열화되었다. 4가지 동질효소가 발견되었고(티. 호시노 등의 EP 832974 A) 그것의 직접적인 전자수용체인 시토크롬 c551이 정제되었고 그것의 유전자가 클로닝되었다(티. 호시노 등의 EP 0869175 A). 그러나 말단 옥시다아제는 분리되지 않았고 그것의 유전자는 클로닝되지 않았다.

본 발명은 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 유전자를 이용함으로써 시토크롬 c 옥시다아제의 양 및 질을 개선하고 시토크롬 c 옥시다아제에 의해 종료되는 산화적 발효를 개선하기 위한 물질을 제공하는 것을 목적으로 하였다. 기탁번호 DSM 4025로 글루코노박터 옥시단스로서 기탁된 미생물이 본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 및 그것의 유전 물질을 제공하는 공급원의 바람직한 예이다.

본 발명은 천연 공급원으로부터 분리되거나 또는 유전공학의 도움으로 제조되는 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체를 제공한다. 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 이러한 효소 복합체는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로서 동정되는 미생물 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 유래하는 생물학적 또는 유전 물질로부터 얻을 수 있거나 또는 얻어진다. 따라서 본 발명은 호흡사슬에서 전자전달을 매개하는 필수성분으로서 유용한 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체를 제공한다.

본 명세서에 예시된 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 다음의 물리화학적 성질을 나타내는 것이다. 즉, (i) 2가지 이상의 코어 소단위체 I(CO I) 및 II(CO II)가 존재를 나타내고, SDS-PAGE 분석에 의한 CO I의 겉보기 분자량이 약 43 ±10kDa이고, SDS-PAGE 분석에 의한 CO II의 겉보기 분자량이 약 36 ±10kDa이고, (ii) aa3형 시토크롬 c 옥시다아제를 나타내는 흡수 스펙트럼이 환원형과 산화형의 차 스펙트럼에서 605 ±1nm 피크이다. 이러한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로서 동정되는 미생물의 배양물 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 유래되는 실질적으로 균질한 분리물로서 제공될 수 있다.

본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 또한 코어 소단위체 I(CO I)로서 재조합 폴리펩티드를 포함할 수 있는 재조합 효소의 형태로 제공될 수 있고, 여기서 상기 재조합 폴리펩티드는 서열번호: 2로 동정되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공할 수 있다. 또한, 다른 코어 소단위체 II(CO II) 및 III(CO III)은 서열번호: 4, 6 및/또는 8로 동정되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 및 상기 서열중 어느 하나와 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공할 수 있는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 또 하나의 양태로서, 각 코어 소단위체, 즉 CO I, CO II 및 CO III은 본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 성분으로서 유용하다.

본원에서 CO I로서 예시되는 것은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드로서, 이 폴리펩티드는 서열번호: 2로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공할 수 있다. 재조합 CO I은 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 복합체를 제공할 수 있는 폴리펩티드로서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다:

(a) 서열번호: 1로 동정되는 DNA 서열, 및

(b) 서열번호: 2로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.

또한 본원에서 CO II로서 예시되는 것은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드로서, 이 폴리펩티드는 서열번호: 4로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 상기 복합체를 제공할 수 있다. 재조합 CO II는 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 복합체를 제공할 수 있는 폴리펩티드로서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다:

(a) 서열번호: 3으로 동정되는 DNA 서열, 및

(b) 서열번호: 4로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.

또한 본원에서 CO III으로서 예시되는 것은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드이다. 이 재조합 폴리펩티드는 각각 서열번호: 6 및 8로 동정되는 아미노산 서열중 어느 하나 또는 양자 모두, 또는 서열번호: 6 및 8의 각 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 상기 복합체를 제공할 수 있다. 재조합 CO III은 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 복합체를 제공할 수 있는 재조합 폴리펩티드로서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다:

(a) 서열번호: 5로 동정되는 DNA 서열,

(b) 서열번호: 7로 동정되는 DNA 서열,

(c) 서열번호: 6으로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 및

(d) 서열번호: 8로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.

본 발명의 추가의 양태에 있어서, 유전공학에 의해 각 코어 소단위체, 즉 CO I, CO II 및 CO III을 제조하는데 유용한 재조합 DNA 단편이 제공된다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 성분에 유용하다. 상술한 바와 같이, 이들 폴리펩티드는 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체를 제공할 수 있어야 한다.

본원에서 CO I을 위한 재조합 DNA 단편으로서 예시되는 것은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드를 암호화하고 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편이다:

(a) 서열번호: 1로 동정되는 DNA 서열, 및

또한 본원에서 CO II를 위한 재조합 DNA 단편으로서 예시되는 것은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드를 암호화하고, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 함유하는 DNA 단편이다:

(a) 서열번호: 3으로 동정되는 DNA 서열, 및

(b) 서열번호: 4로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이 상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.

또한 본원에서 CO III을 위한 재조합 DNA 단편으로서 예시되는 것은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드를 암호화하고, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 함유하는 DNA 단편이다:

(a) 서열번호: 5로 동정되는 DNA 서열,

(b) 서열번호: 7로 동정되는 DNA 서열,

또한 본 발명의 또 하나의 양태에서는 하나 이상의 상기 재조합 DNA 단편을 포함하는 발현벡터가 제공되고, 이 벡터는 유기체, 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서의 발현에 적합하다.

또한 상기 발현벡터가 도입된 재조합 유기체를 제공하는 것은 본 발명의 또 하나의 양태이다. 본 발명의 이러한 재조합 유기체는 본 발명의 재조합 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 유전적 제조에 유용하게 되고 또한 적당한 배양 배지에서 L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터 2KGA를 제조하는 방법에 적용가능하다. 본 발명의 재조합 유기체를 위한 숙주세포는 진핵생물로부터 유래된 것, 바람직하게는 포유류 또는 식물 세포일 수도 있고 원핵생물로부터 유래된 것일 수도 있다. 이들 숙주세포는 특히 박테리아, 바람직하게는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 및 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 얻어질 수 있다.

본 발명은 또한 상기한 본 발명의 재조합 유기체, 특히 본 명세서에 예시된 바람직한 DNA 서열을 함유하는 재조합 유기체를 적당한 배양 배지에서 배양하고 배양 배지로부터 시토크롬 c 옥시다아제를 회수하는 것을 포함하는 시토크롬 c 옥시다아제의 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터 2KGA를 제조하는 방법으로서, 상기한 바와 같은 본 발명의 재조합 유기체를 적당한 배양 배지에서 배양하고 배양물로부터 2KGA를 회수하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 말단 옥시다아제 및 그것의 유전자로서 기능하는 단백질의 군에 속한다. 보다 상세하게는 본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제는 알코올 및 알데히드 탈수소효소(AADH)와 같은 탈수소효소에 대한 전자공여체인 시토크롬 c를 산화시키는 말단 옥시다아제로서 유용하고, 따라서 호흡사슬에서 전자전달을 매개하는 필수성분으로서 유용하다. 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 천연 공급원으로부터 분리되거나 또는 유전공학의 도움으로 제조되는 것일 수 있다. 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 이러한 효소 복합체는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로서 동정되는 미생물 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 유래하는 생물학적 물질로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 다음의 물리화학적 특성을 나타낸다. 즉, 본 복합체는 환원형과 산화형의 차 스펙트럼에서 aa3형 시토크롬 c 옥시다아제의 흡수, 즉 605 ±1nm에서 피크를 나타내고, 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 2가지 폴리펩티드가 SDS-PAGE상에서 약 43 ±10kDa 및 36 ±10kDa의 겉보기 분자량을 갖는다.

본 발명의 신규한 재조합 효소 복합체는 유전 물질, 즉 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로서 동정되는 미생물 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 유래하는 재조합 DNA 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 하나 이상의 재조합 폴리펩티드를 코어 소단위체의 하나로서 포함할 수 있다. 상기 복합체의 코어 소단위체 I로서의 재조합 폴리펩티드는 서열번호: 2로 동정되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공할 수 있다. 또한 다른 코어 소단위체 II(CO II) 및 III(CO III) 중 어느 하나 또는 양자 모두도 재조합 폴리펩티드가 될 수 있다. CO II는 서열번호: 4로 동정되는 부분 아미노산 서열을 함유하는 재조합 폴리펩티드 및 상기 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 재조합 폴리펩티드로 구성된 군으로부터, 그러한 재조합 폴리펩티드가 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공하는 한 선택될 수 있다. CO III은 서열번호: 6 및 8로 동정되는 부분 아미노산 서열을 함유하는 재조합 폴리펩티드 및 각 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 재조합 폴리펩티드로 구성된 군으로부터, 그러한 재조합 폴리펩티드가 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공하는 한 선택될 수 있다.

"동일성"이라는 용어는 바람직하게는 각 위치에서 발생하는 아미노산이 그것의 특성에 있어서 유사할 뿐만 아니라 사실상 동일함을 의미한다. 바람직한 구체예에서는 아미노산 서열의 정렬이 최상의 방식으로 수행된다.

본 명세서에서 사용될 때 "글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물"이라는 말은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 하기의 14가지 특성중 적어도 12가지를 갖는 미생물로서, HPLC로 측정할 때 배양 배지에서 적어도 0.01g/L의 2KGA의 레벨로 L-소르보스로부터 2KGA를 생성하는 미생물을 의미한다:

(a) L-소르보스로부터 2KGA를 생성하고,

(b) 에탄올을 아세트산으로 산화시키고,

(c) D-글루코스를 D-글루콘산 및 2-케토-D-글루콘산으로 산화시키고,

(d) 다가알코올의 케톤체 생성을 나타내고,

(e) pH 4 및 5의 만니톨 배양액(24시간 배양)에서 피막 및 고리 성장을, pH 4.5의 글루코스 배양액에서 피막 성장을 나타내고,

(f) 글리세롤을 디히드록시아세톤으로 실질적으로 산화시키지 않고,

(g) 2-케토-D-글루카르산을 소르비톨 및 글루카르산으로부터는 생성하나 글루코스, 프룩토스, 글루콘산, 만니톨 또는 2-케토-D-글루콘산으로부터는 생성하지 않고,

(h) 명백한 편모 없이 다형체이고,

(i) 프룩토스로부터 갈색 안료를 생성하고,

(j) 바실러스 메가테리움(B. megaterium) 또는 그것의 세포추출액의 존재하에 공동배양할 때 양호한 성장을 나타내고,

(k) 스트렙토마이신 감수성이고,

(l) 끝이 둥근 막대 형상이고,

(m) 평균 세포직경이 약 0.3-0.6㎛이고,

(n) 평균 세포길이가 약 1-1.5㎛이다.

이것 이외에 "글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물"이라는 말은, 이러한 미생물이 아미노산 서열의 상동성에 의거하여 동정될 수 있음은 본 기술분야에 숙련된 자에게 명백므로, 서열번호: 2, 4, 6 및 8로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 아주 엄중한 조건하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 미생물을 포함하는 것으로 이해해야 한다.

본 발명은 또한 상기 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드 및 서열번호: 2, 4, 6 및 8에 기재된 아미노산 서열은 다른 시토크롬 옥시다아제에 관련된 폴리펩티드 또는 대응하는 부분 아미노산 서열과 최대 50-82%의 상동성을 나타내었다. 예를 들면 본 발명의 CO I 폴리펩티드(서열번호: 2)는 파라콕커스 데니트리피칸스로부터의 CO Iα(기탁번호 P08305) 및 CO Iβ(기탁번호 P98002) 그리고 로도박터 스페로이데스로부터의 CO I(기탁번호 P33517)과 각각 77%, 81% 및 79%의 상동성을 나타내었다. 본 발명의 부분 CO II 폴리펩티드(서열번호: 4)는 파라콕커스 데니트리피칸스 및 로도박터 스페로이데스로부터의 CO II 폴리펩티드와 각각 73% 및 68%의 상동성을 나타내었다. 본 발명의 부분 CO III 폴리펩티드(서열번호: 6)는 파라콕커스 데니트리피칸스로부터의 CO III 폴리펩티드와 54%의 상동성을 나타내었고, 또 하나의 폴리펩티드(서열번호: 8)는 파라콕커스 데니트리피칸스 및 로도박터 스페로이데스로부터의 CO III 폴리펩티드와 각각 71% 및 63%의 상동성을 나타내었다. 이러한 상동성 조사는 제네틱스-SV/RC 버전 3.2.0(일본 도쿄 소재 제네틱스 소프트웨어 디벨럽먼트사(Genetyx Software Development Co., Ltd.)의 "서치 호몰로지(Search Homology)"와 같은 컴퓨터 프로그램으로 행할 수 있다.

따라서 각 코어 소단위체, 즉 CO I, CO II 및 CO III은 본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 성분에 유용한 재조합 폴리펩티드로서 제공될 수 있다.

본 복합체의 소단위체 CO I은 상기한 바와 같이 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드일 수 있고, 이 폴리펩티드는 상기한 바와 같이 서열번호: 2로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 복합체를 제공할 수 있다. 재조합 CO I은 또한 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 복합체를 제공할 수 있는 폴리펩티드로서, 하기 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다:

(a) 서열번호: 1로 동정되는 DNA 서열, 및

또한 소단위체 CO II는 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드일 수 있고, 이 폴리펩티드는 상기한 바와 같이 서열번호: 4로 동정되는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 상기 복합체를 제공할 수 있다. 재조합 CO II는 또한 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 복합체를 제공할 수 있는 폴리펩티드로서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다:

(a) 서열번호: 3으로 동정되는 DNA 서열, 및

또한 소단위체 CO III은 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 재조합 폴리펩티드일 수 있고, 이 폴리펩티드는 상기한 바와 같이 상기 재조합 폴리펩티드가 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 상기 복합체를 제공할 수 있는 한, 각각 서열번호: 6 및 8로 동정되는 아미노산 서열중 어느 하나 또는 양자 모두 또는 서열번호: 6 및 8의 각 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 재조합 CO III은 또한 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 갖는 본 발명의 복합체를 제공할 수 있는 재조합 폴리펩티드로서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다:

(a) 서열번호: 5로 동정되는 DNA 서열,

(b) 서열번호: 7로 동정되는 DNA 서열,

또한 본 발명은 상기한 재조합 폴리펩티드의 기능성 유도체를 포함한다. 이러한 기능성 유도체는 본 발명의 아미노산 서열에 의거하여 이러한 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가, 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 정의되고, 상기 유도체를 포함하는 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 본 기술분야에 공지되었거나 또는 본 명세서에 구체적으로 기재된 분석에 의해 측정되는 시토크롬 c 옥시다아제 활성을 여전히 갖는다. 상기 기능성 유도체는 본 기술분야의 최신기술에 공지되고 삼브룩 등(상기 참조)("Molecular Cloning" 2판, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, New York)이 개시한 방법으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 DNA 서열에 의거하여 재조합방법에 의해 본 기술분야에 공지된 단백질의 화학적 펩티드합성 또는 화학적 변형에 의해 제조될 수 있다. 상기 분자의 활성을 일반적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드내의 아미노산 교환은 본 기술분야의 최신기술에 공지되어 있고, 예를 들면 에이치. 뉴라스(H. Neurath) 및 알.엘. 힐(R.L. Hill)의 문헌["The Proteins"(Academic Press, New York, 1979, 특히 14쪽 도 6 참조)]에 기재되어 있다. 가장 통상적으로 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 뿐만 아니라 이들의 역이다.

본 발명은 호흡사슬에서 전자전달을 매개하는 필수성분의 하나인 상기 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 상기 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 DNA 단편에 관한 것이다.

유전공학으로 각 코어 소단위체, 즉 CO I, CO II 및 CO III을 제조하는데 유용한 재조합 DNA 단편이 제공된다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 본 발명의 신규한 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 성분에 유용하다.

CO I을 위한 재조합 DNA 단편은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드를 암호화하고 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편일 수 있다:

(a) 서열번호: 1로 동정되는 DNA 서열, 및

CO II를 위한 재조합 DNA 단편은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴 리펩티드를 암호화하고 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편일 수 있다.

(a) 서열번호: 3으로 동정되는 DNA 서열, 및

또한 CO III을 위한 재조합 DNA 단편은 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 관련된 폴리펩티드를 암호화하고 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열을 함유하는 DNA 단편일 수 있다:

(a) 서열번호: 5로 동정되는 DNA 서열,

(b) 서열번호: 7로 동정되는 DNA 서열,

본 발명의 재조합 DNA 단편은 또한 이하에 보다 상세히 기재하는 엄중한 표준 조건하에 서열번호: 1, 3, 5 또는 7로 하이브리드화될 수 있는 DNA 서열을 포함할 수 있다.

하이브리드화에 대한 "표준 조건"이란 본 기술분야에 숙련된 자가 특이적 하이브리드화 신호를 검출하기 위해 일반적으로 사용하고, 예를 들면 삼브룩 등(상기 참조)이 기재하고 있는 조건, 또는 바람직하게는 본 기술분야에 숙련된 자에게 정통하고 예를 들면 삼브룩 등(상기 참조)의 문헌에 기재되어 있는 소위 엄중한 하이브리드화 및 엄중하지 않은 세척 조건 또는 보다 바람직하게는 소위 적당히 엄중한 조건 또는 훨씬 더 바람직하게는 소위 엄중한 하이브리드화 및 엄중한 세척 조건을 의미한다.

본 발명은 또한 하나 이상의 상기 재조합 DNA 단편을 포함하는 발현벡터로서, 유기체의 원핵생물 또는 진핵생물 숙주세포내 발현에 적합하다. 이러한 발현벡터는 하나 이상의 상기 재조합 DNA 단편을 본 기술분야에 주지되어 있는 바와 같이 발현조절효소를 포함할 수 있는 적합한 벡터에 삽입함으로써 구성될 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 유기체는 상기 발현벡터를 적당한 숙주세포에 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 본 발명의 재조합 유기체는 본 발명의 재조합 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 유전적 제조에 유용하게 되고 또한 적당한 배양 배지에서 L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터 2KGA를 제조하는 방법에 적용가능하다. 본 발명의 재조합 유기체를 위한 숙수세포는 진핵생물로부터 유래된 것, 바람직하게는 포유류 또는 식물 세포일 수도 있고 원핵생물로부터 유래된 것일 수도 있다. 이들 숙주세포는 특히 박테리아, 바람직하게는 글루코노박터 옥시단스 DSM No. 4025 및 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 및/또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 얻어질 수 있다. 또한 숙주세포는 대장균, 슈도모나스 푸티타(Psudomonas putida), 아세토박터 크실리넘(Acetobacter xylinum), 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 한세니(Acetobacter hansenii) 및 글루코노박터 옥시단스와 같은 박테리아로 구성된 군으로부터도 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기에서 정의한 바와 같은 재조합 숙주세포를 적당한 배양 배지에서 배양하고 배양물로부터 시토크롬 c 옥시다아제를 회수하는 것을 포함하는 시토크롬 c 옥시다아제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체는 또한 L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터의 2KGA의 제조를 개선하고 더욱이 알데히드, 카르복실산 및 케톤을 대응하는 기질로부터 생체내 및 시험관내에서 알코올 및 알데히드 탈수소효소의 존재하에 제조하는 것을 개선하기 위해 적용할 수 있다.

화합물 2KGA는 L-아스코르브산의 제조를 위한 중요한 매개물질로서 그것은 주지의 라이치스타인(Reichstein)법에 따라 L-아스코르브산으로 전환될 수 있다. 2KGA를 L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터 발효에 의해 제조하는 것은 공지되어 있다[티. 호시노 등의 EP 88116156 A]. 글루코노박터 균주는 문헌[Agric. Biol. Chem., 54(5), 1211-1218, 1990 [티. 호시노 등]] 및 EP 606621 A[티. 호시노 등]에 개시되어 있는 바와 같이 소르보스 및 소르보손 탈수소효소에 의해 촉매화되는 반응을 통해 2KGA를 생성하는 것으로 공지되어 있다. L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터의 2KGA 생성의 원인이 되는 1차 탈수소효소의 유전자는 얻어졌다[티. 호시노 등의 EP 832974 A]. 더욱이 이 1차 탈소소효소로부터의 전자수용체로서 기능하는 시토크롬 c 및 그것의 유전자도 또한 분리되었다[티. 호시노 등의 EP 869175 A]. 이들 탈수소효소 및 시토크롬 c는 시험관내에서 2KGA를 제조하는데 사용되어 왔다. 상기 유전자는 L-소르보스 및 D-소르비톨로부터 2KGA를 생성하는 재조합 유기체를 구성하는데 사용되어 왔다. 예를 들면 시토크롬 c와 함께 알코올/알데히드 탈수소효소(AADH)의 유전자를 포함하는 슈도모나스 푸티다는 L-소르보스로부터 2KGA를 생성할 수 있다.

따라서 2KGA의 제조를 위한 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제의 용도도 또한 본 발명의 목적이다.

본 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 말단 옥시다아제 활성은 TMPD(N,N,N',N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민 이염산염)를 인공 기질(전자공여체)로서 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 반응혼합물은 예를 들면 2.5mM TMPD, 0.05% 트윈-20 및 0.1M 나트륨 3[N-모르폴리노]프로판술폰산(Na-MOPS)(pH 6.5)으로 구성된다. TMPD 옥시다아제 활성은 520nm에서 흡광도를 증가시킴으로써 측정할 수 있고 TMPD의 몰계수는 6.1/mM/cm로서 취한다. 효소 활성 1유니트는 실온에서 1분당 TMPD 1μmol의 산화로서 정의된다.

a형 헴의 분광광도법에 의한 동정 및 정량화는 환원형과 산화형의 차 스펙트럼에 의해 605nm 부근에서 특징적인 양의 피크를 검출함으로써 수행하였다. 각 시료의 환원은 미량의 나트륨 디티오나이트를, 산화는 암모늄 퍼술페이트를 가하여 행하였다. a형 헴 피크(605nm-630nm)의 몰계수는 11.7/mM/cm로서 취해졌다.

본 발명을 보다 상세히 설명하기 전에 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터 얻을 수 있는 소단위체 CO I 및 CO II로 구성되는 정제된 시토크롬 c 옥시다아제의 물리화학적 성질을 이하에 기재한다.

(1) 흡수 스펙트럼

시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 환원형과 산화형의 차 스펙트럼에 있어서의 흡수 프로파일을 도 1에 나타낸다.

(2) 분자량

SDS-PAGE 분석 결과 시토크롬 c 옥시다아제 CO I 및 CO II 소단위체에 대한 겉보기 분자량은 도 2에 나타낸 바와 같이 각각 약 43 ±10 및 36 ±10kDa임이 밝혀졌다.

(3) CO I 및 CO II의 아미노산 서열

정제된 시토크롬 c 옥시다아제 복합체를 즉제-디스크-SDS-PAGE(NA-1800, 니폰 에이도사(Nippon Eido Co.))에 의해 CO I 및 CO II 소단위체로 해리한다. 양쪽의 N-말단 아미노잔기를 미확인 변형에 의해 차단한다. 이어서 부분 분해된 펩티드 단편(분자량 15-45kDa)을 라이실-엔도펩티다아제 처리로 유도하고 15% SDS-PAGE 시트로부터 밴드 추출에 의해 분리하고 센트리콘-10(아미콘(Amicon))에서 15% 메탄올 및 0.1% SDS로 세척하고 시퀀서에 적용하였다. CO I 및 CO II에 대해 각각 "KDIGLLYLVAAGVVGF"(서열번호: 11) 및 "KASQFTHNTPLEIVWTIVPV"(서열번호: 14) 서열이 얻어졌다.

본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제의 폴리펩티드 및 유전자를 분리하기 위해 사용되는 바람직한 균주는 부다페스트조약의 규정하에 괴팅겐(독일) 소재의 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘에 1987년 5월 17일에 DSM 4025로 기탁된 글루코노박터 옥시단스이다. 또한 이 균주의 계대배양균주도 부다페스트조약의 규정하에 일본의 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤 테크놀로지, 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트에 기탁번호: 글루코노박터 옥시단스 FERM BP-3812(기탁일: 1992년 3월 30일)로 기탁되었다. 또한 EP 278 447에 이 균주의 특성이 개시되어 있다. 상기 미생물의 기능적 균등물, 계대배양균주, 돌연변이체 및 변이체도 본 발명에 사용될 수 있다. 균주 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생의 생물학적 또는 분류학적으로 균질한 배양물도 또한 상기 시토크롬 c 옥시다아제의 폴리펩티드 및 유전자의 공급원으로서 사용될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 시토크롬 c 옥시다아제는 적당한 유기체를 배양하고 세포를 파괴하고 파괴된 세포의 무세포 추출액으로부터, 바람직하게는 유기체의 가용성 분획으로부터 그것을 분리 및 정제함으로써 제조될 수 있다.

유기체는 호기성 조건하에 적당한 영양물질로 보충된 수성 배지중에서 배양될 수 있다. 배양은 약 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0의 pH에서 수행될 수 있다. 배양기간은 사용되는 pH, 온도 및 영양배지에 따라 다르나, 보통 2 내지 6일이 유리한 결과를 가져올 것이다. 배양을 수행하는데 바람직한 온도범위는 약 13 내지 36℃, 바람직하게는 약 18 내지 33℃이다.

보통 배양 배지는 영양물질, 예를 들면 동화성 탄소원, 분해성 질소원 및 무기물질, 비타민, 미량원소 및 다른 성장촉진인자를 함유할 것이 요구된다. 동화성 탄소원으로서는 글리세롤, D-글루코스, D-만니톨, D-프룩토스, D-아라비톨, L-소르보스, D-소르비톨 등이 사용될 수 있다.

효모추출액, 고기추출액, 펩톤, 카제인, 옥수수 담근 액, 요소, 아미노산, 질산염, 암모늄염 등과 같은 각종 유기 또는 무기 물질도 또한 사용될 수 있다. 무기 물질로서는 황산마그네슘, 인산칼륨, 염화제1철, 염화제2철, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.

이하에, 배양후 유기체로부터의 시토크롬 c 옥시다아제의 분리 및 정제 그리고 그것의 유전자/DNA 서열 클로닝에 대한 구체예를 기재한다.

(1) 세포를 발효배양액으로부터 원심분리 또는 여과에 의해 수거한다.

(2) 세포를 완충용액에 현탁시키고 호모지나이저, 소니케이터 또는 라이소자임처리로 파괴하여 세포의 파괴용액을 얻는다.

(3) 시토크롬 c 옥시다아제를 파괴된 세포의 무세포 추출액, 바람직하게는 유기체의 가용성 분획으로부터 황산암모늄침강, 투석, 이온교환크로마토그래피, 겔여과크로마토그래피 및 친화성크로마토그래피와 같은 통상의 단백질 정제방법에 의해 분리 및 정제한다.

본 발명에 의해 제공되는 시토크롬 c 옥시다아제는 알코올 및 알데히드로부터 알데히드, 카르복실산 및 케톤을 제조하기 위한, 특히 L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터 L-소르보손을 거쳐 2KGA를 제조하기 위한 탈수소효소에 속하는 효소 유래의 전자수용체인 시토크롬 c를 산화시키는 말단 옥시다아제로서 유용하다.

요약해서 말하면, 본 발명에서 사용되는 시토크롬 c 옥시다아제 유전자, DNA 서열, 재조합 발현벡터 및 재조합 유기체(형질전환 숙주세포라고도 함)는 다음 단계로 얻어질 수 있다.

(1) 본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제를 제공할 수 있는 유기체로부터 염색 체 DNA를 분리하고 대장균내 염색체 DNA와 함께 유전자 라이브러리를 구성하는 단계.

(2) 염색체 DNA로부터 콜로니, 플라크 또는 서던 하이브리드화, PCR(중합효소연쇄반응) 클로닝, 웨스턴블롯 분석 등에 의해 시토크롬 c 옥시다아제 유전자를 클로닝하는 단계.

(3) 상기와 같이 얻어진 시토크롬 c 옥시다아제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 통상의 방법에 의해 결정하여 상기 시토크롬 c 옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 DNA 단편을 선택하고 시토크롬 c 옥시다아제 유전자가 효과적으로 발현될 수 있는 발현벡터를 구성하는 단계.

(4) 형질전환, 형질도입, 형질접합 및 일렉트로포레이션에 의해 재조합 유기체를 구성하는 단계.

본 발명의 상기 양태에서 사용되는 재료 및 방법을 다음과 같이 상세히 예시한다.

전체 염색체 DNA는 본 기술분야에 주지된 방법에 의해 정제할 수 있다. 시토크롬 c 옥시다아제를 암호화하는 유전자는 다음 방법에 의해 전체 염색체 DNA로부터 플라스미드 또는 파지 벡터에 클로닝시킨다.

(i) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기이동후 겔로부터 펩티다아제 처리에 의해 얻어지는 전체 단백질 또는 펩티드 단편을 분리하고, 그것을 어플라이드 바이오시스템스 오토메틱 기상 시퀀서 470A(미국 코네티컷주 노르웍 소재의 퍼킨 엘머사(Perkin Elmer Corp.))와 같은 단백질 시퀀서에 적용함으로써 정제 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체로부터 부분 아미노산 서열을 결정하고, 상기와 같이 얻어진 아미노산 서열에 따라 어플라이드 바이오시스템스 오토메틱 DNA 시퀀서 381A(퍼킨 엘머)와 같은 DNA 합성장치에 의해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하고, 이 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 목적 유전자를 포함하는 균주의 유전자 라이브러리로부터 목적 유전자를 포함하는 클론을 서던, 콜로니 또는 플라크 하이브리드화를 통해 분리하거나; (ii) 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체에 대한 항체를 사용하여 면역학적 방법에 의해 유전자 라이브러리로부터 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체를 발현하는 클론을 선택하거나; 또는 (iii) 상기와 같이 결정된 아미노산 서열에 따라 합성된 올리고뉴클레오티드 2개의 세트를 사용하여 PCR법으로 전체 염색체 DNA로부터 DNA를 증폭시키고, 프로브로서 상기와 같이 얻어진 PCR 생성물과의 서던, 콜로니 또는 플라크 하이브리드화에 의해 대장균에서 구성된 유전자 라이브러리로부터 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체의 전체 유전자를 포함하는 클론을 분리한다. 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체에 대해 반응하는 상술한 항체는 문헌[Enzymology, vol 73, p 46, 1981]에 기재된 방법에 의해 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체의 정제 단백질 또는 그것의 펩티드 단편을 사용하여 제조될 수 있다.

시토크롬 c 옥시다아제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 M13 파지(Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977)를 사용하여 디데옥시사슬종결법과 같은 주지의 방법으로 결정될 수 있다.

시토크롬 c 옥시다아제 복합체 소단위체의 유전자를 발현시키기 위해 각종 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들면 상기 시토크롬 c 옥시다아제 소단위체 유전 자의 상류에 존재하는 본래 프로모터, Tn5(Berg, D. E., and C. M. Berg. 1983. Bio/Technology 1:417-435)의 카나마이신 내성 유전자, pBR322의 암피실린 내성 유전자 및 대장균의 β-갈락토시다아제 유전자(lac)와 같은 항생물질 내성 유전자의 프로모터, trp-, tac-, trc-프로모터, 람다 파지의 프로모터 및 대장균, 슈도모나스 푸티다, 아세토박터 크실리넘, 아세토박터 파스퇴리아누스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 한세니 및 글루코노박터 옥시단스, 특히 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025와 같은 박테리아, 포유류 세포 및 식물 세포를 포함한 유기체로 구성되는 숙주에서 기능성일 수 있는 모든 프로모터가 있다.

상기 목적을 위해, 코딩서열이 도입될 숙주세포에서 작동가능한 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열(예를 들면 숙주세포에서 작동가능한 천연 및 합성 서열을 포함하는 AGGAGG 등)과 같은 다른 조절요소 및 전사종결인자(숙주세포에서 작동가능한 모든 천연 및 합성 서열을 포함한 역방향반복배열 구조)가 상기 프로모터와 함께 사용된다.

아주 다양한 숙주/클로닝 벡터 조합체가 두 가닥 사슬 DNA를 클로닝하는데 사용될 수 있다. 클로닝 벡터는 일반적으로 복제개시점, 조절요소, 다클로닝부위를 포함하는 클로닝부위 및 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 스펙티노마이신 등에 대한 내성 유전자를 포함하는 항생물질 내성 유전자와 같은 선택 마커를 함유하는 플라스미드 또는 파지이다.

대장균에서의 목적 유전자의 발현에 바람직한 벡터는 pBR322 또는 pUC18 및 pBluescript II를 포함한 그것의 유도체, pACYC177 및 pACYC184[J. Bacteriol., 134: 1141-1156, 1978] 및 그것의 유도체와 같은, 대장균에서 통상 사용되는 모든 벡터, 및 PK2 및 RSF1010과 같은 광역 숙수범위 벡터로부터 유도되는 벡터로부터 선택된다. 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025를 포함한 글루코노박터 및 슈도모나스 푸티다에서의 목적 유전자의 발현에 바람직한 벡터는 대장균과 같은 바람직한 클로닝 유기체 뿐만 아니라 글루코노박터 및/또는 슈도모나스 푸티다에서 복제할 수 있는 모든 벡터로부터 선택된다. 바람직한 벡터는 pVK102 및 그것의 유도체 그리고 RSF1010 및 그것의 유도체와 같은 광역 숙주범위 벡터, 및 글로코노박터에서 기능성인 복제개시점 및 대장균에서 기능성인 또 하나의 개시점을 함유하는 벡터이다. 벡터의 카피수 및 안정성은 클로닝된 유전자의 안정하고 효과적인 발현 및 클로닝된 유전자를 포함한 숙주세포의 효과적인 배양을 위해 주의하여 고려되어야 한다. Tn5와 같은 전위성 유전인자를 함유하는 DNA 서열도 또한 목적 유전자를 바람직한 숙주에, 특히 염색체상에 도입하기 위해 벡터로서 사용될 수 있다. 목적 유전자와 함께 바람직한 숙주로부터 분리된 임의적인 DNA를 함유하는 DNA 서열도 또한 원하는 DNA 서열을 바람직한 숙주에, 특히 염색체상에 도입하는데 유용하다. 이러한 DNA 서열은 형질전환, 형질도입, 형질접합 또는 일렉트로포레이션에 의해 바람직한 숙주로 전달될 수 있다.

유용한 숙주는 원핵생물 또는 진핵생물 유래의 것이고 유기체, 포유류 세포 및 식물 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 유기체로서는 대장균, 슈도모나스 푸티다, 아세토박터 크실리넘, 아세토박터 파스퇴리아누스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 한세니, 글루코노박터 옥시단스, 및 재조합 시토크롬 c 옥시다아제를 생성할 수 있는 모든 그램음성균을 들 수 있다. 상기 유기체의 기능적 균등물, 계대배양균주, 돌연변이체, 변이체도 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직한 균주는 대장균 K12 및 그것의 유도체, 슈도모나스 푸티다 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 그리고 균주 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적 또는 분류학적으로 균질한 배양물이다.

본 발명의 시토크롬 c 옥시다아제를 암호화하는 DNA 서열은 발현벡터를 제조하는 본 기술분야의 주지의 방법에 의해 프로모터 및 리보솜결합부위와 같은 조절영역 및 상기한 숙주에서 작동가능한 전사종결인자를 함유하는 적당한 벡터에 라이게이션된다.

발현벡터를 포함한 숙주세포를 구성하기 위해, 형질전환, 형질도입, 접합교배(conjugal mating)(14 및 15장, Methods for general and molecular bacteriology, Philipp Gerhardt et al. ed., American Society for Microbiology, 1994) 및 일렉트로포레이션을 포함한 여러 가지 DNA 전달방법이 사용될 수 있다. 형질전환 숙주세포를 구성하는 방법은 분자생물학의 분야에 잘 알려진 방법중에서 선택될 수 있다. 대장균, 슈도모나스 및 아세토박터에는 통상의 형질전환계가 사용될 수 있다. 대장균에는 형질도입계도 또한 사용될 수 있다. 접합매칭계는 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터 옥시단스를 포함하여 그램양성 및 그램음성균에 광범위하게 사용될 수 있다. 바람직한 접합정렬방법은 WO 89/06688에 기본적으로 개시되었다. 접합은 액체 배지내 또는 고체표면상에서 일어날 수 있다. 시토크롬 c 옥시다아제에 바람직한 수용균은 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터 옥시단스중에서 선택된다. 2KGA 제조에 바람직한 수용균은 적합한 재조합 발현벡터에 의해 활성 AADH 및 시토크롬 c를 생성할 수 있는 대장균, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터 옥시단스중에서 선택된다. 2KGA 제조에 바람직한 수용균은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025이다. 접합매칭용 수용균에는 선택 마커가 보통 가해진다. 예를 들면 날리딕스산 또는 리팜피신에 대해 내성인 것이 보통 선택된다.

하기의 실시예는 본 발명을 더 예시하기 위해 제공되는 것으로 어떤 식으로든 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1:

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 시토크롬 c 옥시다아제의 동정 및 정제

말단 옥시다아제 활성을 인공기질(전자공여체)로서 TMPD(N,N,N',N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민 이염산염)를 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 반응혼합물은 2.5mM TMPD, 0.05% 트윈-20 및 0.1M 나트륨 3[N-모르폴리노]프로판술폰산(Na-MOPS)(pH 6.5)으로 구성된다. TMPD 옥시다아제 활성은 520nm에서 흡광도를 증가시킴으로써 측정하였고 TMPD의 몰계수는 6.1/mM/cm로서 취하였다. 효소 활성 1유니트는 실온에서 1분당 TMPD 1μmol의 산화로서 정의하였다. a형 헴의 분광광도법에 의한 동정 및 정량화는 환원형과 산화형의 차 스펙트럼에 의해 605nm 부근에서 특징적인 양의 피크를 검출함으로써 수행하였다. 각 시료를 미량의 나트륨 디티오나이트로 환원시키고 암모늄 퍼술페이트로 산화시켰다. a형 헴 피크(605nm-630nm)의 몰계수는 11.7/mM/cm로서 취해졌다.

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025를 10% L-소르보스(별도로 멸균됨), 0.05% 글리세롤, 1.6% 요소(별도로 멸균됨), 0.25% MgSO₄×7H₂O, 6.25% 베이커의 효모세포, 1.5% CaCO₃(제조등급, 일본 교토의 나칼라이 테스크) 및 3.0% 옥수수 담근 액(pH 7.5)(멸균전)으로 구성된 FYC 배지 5리터를 사용하여 30℃에서 27시간 동안 호기성 배양하였다. 배양후, CaCO₃및 효모세포와 같은 고체물질을 저속 원심분리(5분 동안 1,000rpm)에 의해 침강시켜 제거하였다. 배양 상청액에 잔존하는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 세포를 8,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 수집하고 0.25M NaCl 및 2mM MgCl₂를 함유하는 25mM 나트륨 N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[4-부탄술폰산](Na-HEPES)(pH 7.5)으로 1회 세척하였다.

얻어진 세포(습중량 약 35g)를 0.5mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5mM 에틸렌글리콜-비스-β-아미노에틸에테르(EGTA), 0.5mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF), 1㎍/ml의 펩스타틴 A, 1㎍/ml의 류펩틴, 10㎍/ml의 DN아제 I 및 10㎍/ml의 RN아제 A를 함유하는 약 200ml의 25mM Na-HEPES(pH 7.5)에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 프렌치 프레스 호모지나이저에 의해 1500kg/㎠로 2회 처리하였다. 얻어진 현탁액을 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고, 상청액을 무세포 추출액(단백질 424.0mg)으로서 수집하였다. 이 무세포 추출액에 55,000rpm에서 1시간 동안 조작하는 초원심분리를 실시하여 침전물을 조(crude) 막분획으로서 회수하였다. 이 조 막분획을 1.2% 트윈 20, 0.25M NaCl, 2mM MgCl₂, 0.5mM PMSF, 1㎍/ml의 펩스타틴 A 및 1㎍/ml의 류펩틴을 함유하는 약 50ml의 25mM Na-HEPES(pH 7.5)에 재현탁하고 막을 세척하기 위해 1시간 동안 배양하였다. 이 분획에 다시 55,000rpm에서 1시간 동안 조작하는 초원심분리를 실시하여 침전물을 세척된 막분획으로서 회수하였다. 세척된 막 분획을 1.5% 수크로스 모노라우레이트(일본 구마모토 소재의 도진 래보러토리스(DOJIN Laboratories)), 2mM EDTA 및 5% 글리세롤을 함유하는 50ml의 25mM Na-HEPES(pH 7.5)와 함께 1시간 동안 배양하여 막 결합된 단백질을 가용화하고, 얻어진 현탁액에 55,000rpm에서 1시간 동안 조작되는 초원심분리를 실시하여 상청액(50ml)을 가용화된 막 분획으로서 얻었다. 이 가용화된 막 분획의 환원형과 산화형의 차 스펙트럼은 605nm 부근에서 특징적인 양의 피크를 나타내었다. 이 피크는 함유물인 조 단백질 1mg당 0.41nmol의 a형 헴에 대응한다. 이어서 가용화된 막 분획중의 막 결합된 단백질을, 0.5% 수크로스 모노라우레이트 및 5% 글리세롤을 함유하는 25mM Na-HEPES로 평형화된 DEAE-도요펄(Toyopearl) 650M(일본 도쿄 소재의 토쇼(TOSHO)) 컬럼(ID 2.2 ×5cm)상에 충전하였다. 동일한 완충액중에서 0-0.35M NaCl의 선형구배로 분획화를 수행하였다. a형 헴 스펙트럼(환원형과 산화형의 차 스펙트럼에서 605nm 부근에 양의 피크) 및 TMPD 옥시다아제 활성을 나타내는 분획은 NaCl의 0.28M 농도 부근에서 용출되었다. 이들 분획을 수집하고(64ml), 45mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.5% 수크로스 모노라우레이트를 함유하는 45mM 인산칼륨 완충액[KPB](pH 7.6)에 대해 투석하고, 효소용액을 동일한 완충액으로 평형화된 히드록시아파타이트(일본 도쿄 소재 토넨사(TONEN Co.)) 컬럼(ID 1.5×6cm)상에 충전하였다. 컬럼을 동일한 완충액으로 세척한 다음 500mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.5% 수크로스 모노라우레이트를 함유하는 500mM KPB(pH 7.6)로 세척하고 수집하였다. 히드록시아파타이트 컬럼으로부터의 분획(단백질 8.6mg)을 0.5% 수크로스 모노라우레이트 및 5% 글리세롤을 함유하는 25mM Na-HEPES(pH 7.5)에 대해 투석하고 YM-30 멤브레인(미국 매사추세츠주 소재의 아미콘사(Amicon Inc.))을 사용하여 한외여과에 의해 농축하고 -30℃에서 정제 단백질로서 저장하였다.

이 정제 단백질을 0.5% 수크로스 모노라우레이트의 존재하에 네이티브-폴리아크릴아미드겔 전기이동(Native-PAGE)으로 분석하였다. 이 단백질은 녹색을 띤(단백질 염색은 없음) 가시적 밴드를 나타내었고 이것은 단 하나의 단백질 밴드(단백질 염색 있음)에 대응하였다. 이 정제 단백질은 2.6유니트/mg의 TMPD 옥시다아제 활성을 가졌고 aa3형 시토크롬 c 옥시다아제의 전형적인 흡수 스펙트럼 패턴을 나타내었다(도 1). a형 헴의 함량은 정제 단백질의 19.2nmol/mg인 것으로 추정되었다. 세척된 멤브레인으로부터의 a형 헴의 함량에 대한 정제 배수는 약 100배이었고 회수율을 거의 90%이었다. 이들 결과로 이 정제 단백질은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025에서 TMPD 옥시다아제 활성을 갖는 주성분이었고 호흡계에서 말단 옥시다아제로서 기능할 수 있음을 알 수 있었다. SDS-PAGE 분석에서 이 정제 단백질은 2가지의 단백질 성분으로 해리되었다. 하나는 광역 밴드를 나타내었고 겉보기 분자량이 약 43,000이었으며(CO I로 명명함) 다른 하나는 샤프한 밴드를 나타내었고 겉보기 분자량이 약 36,000이었다(CO II로 명명함)(도 2).

실시예 2:

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 시토크롬 c 옥시다아제의 아미노산 서열 및 다른 시토크롬 c 옥시다아제 복합체와의 상동성

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 정제된 시토크롬 c 옥시다아제의 2가지 성분(CO I 및 CO II)을 즉제 SDS-PAGE에 의해 해리하였다. 양 성분으로부터 천연 N-말단 아미노산 서열은 얻어지지 않았다. 내부 아미노산 서열을 얻기 위해 각 성분을 라이실-엔도펩티다아제로 분해하고 얻어진 단편을 즉제 SDS-PAGE로 분리하고 아미노산 시퀀서(어플라이드 바이오시스템스 모델 470A, 미국 코네티컷주 소재의 퍼킨 엘머사)로 아미노산 서열화를 실시하였다. 결과로서 부분 아미노산 서열이 얻어졌다. KDIGLLYLVAAGVVGF[서열번호: 11]는 CO I 단편(본래의 것보다 약간 더 작은 분자량)으로부터, KASQFTHNTPLEIVWTIVPV[서열번호: 14]는 CO II 단편(본래의 것보다 약 10000 더 작은 분자량)으로부터 얻어졌다. CO I 및 CO II는 SDS-PAGE 및 분광광도적 특성이 파라콕커스 덴트리피칸스의 시토크롬 c 옥시다아제(B. Ludwig and G. Schatz, Proc. Nacl. Acad. Sci. USA, 77, 196-200, 1980)의 것과 유사하였기 때문에 CO I 및 CO II 소단위체의 부분 아미노산 서열을 서열정렬장치에 의해 파라콕커스 덴트리피칸스 및 로도박터 스페로이데스 그리고 소 미토콘드리아의 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 전체 아미노산 서열과 비교하였다(도 3 내지 4). 3가지 시토크롬 c 옥시다아제 복합체간의 아미노산 서열의 전체 상동성은 이전에 보고되었다(C. Jianli et al., Biol. Chem., 267, 24273-24278, 1992). 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 시토크롬 c 옥시다아제 CO I 및 CO II의 아미노산 서열은 다른 것의 상동성 정렬에 일부 할당되었다. 특히 2개의 박테리아 서열(파라콕커스 덴트리피칸스 및 로도박터 스페로이데스)과는 현저한 상동성이 관찰되었다.

실시예 3:

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 시토크롬 c 옥시다아제 유전자의 클로닝

(1) PCR법에 의한 부분 시토크롬 c 옥시다아제 유전자(들)의 증폭

정제된 CO I 및 CO II 폴리펩티드(서열번호: 11 및 14)의 아미노산 서열과 함께 파라콕커스 덴트리피칸스, 로도박터 스페로이데스 및 소 미토콘드리아의 전체 아미노산 서열 정렬에 따라 다음의 아미노산 서열을 PCR 증폭을 위해 선택하여 CO I 및 CO II 유전자의 부분 DNA 서열을 증폭시켰다. 즉 CO I 유전자에 대해서는 서열번호: 9 및 서열번호: 10을, CO II 유전자에 대해서는 서열번호: 15 및 서열번호: 16을 선택하였다. 시토크롬 c 옥시다아제 복합체에 포함되는 것으로 보고된 제 3 성분(CO III)은 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025로부터 정제된 제제에는 존재하지 않았다. 이러한 부재는 정제 동안의 해리에 기인하는 것으로 보였다. 만일 존재한다면 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 추정된 CO III 유전자를 암호화하는 부분 DNA 서열을 확인 및 증폭하기 위해 파라콕커스 덴트리피칸스, 로도박터 스페로이데스 및 소 미토콘드리아의 3가지 CO III 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드내에 보존된 2개의 아미노산 서열을 선택하였다(도 5). 즉 CO III 유전자에 대해 서열번호: 17 및 서열번호: 18을 선택하였다. 각 쌍의 프라이머를 CO I, CO II 및 CO III에 대해 지정하였다(도 6). PCR 반응은 공급자의 권장에 따라 파킨-엘머 세터스 인스트루먼트스의 서멀 사이클러와 함께 등록상표 진엠프(GeneAmp) DNA 증폭시약키트(Amplification Reagent Kit; 일본 쿄토 소재의 다카라 슈조(Takara Shuzo))를 사용하여 수행하였다. 반응은 1) 94℃에서 1분간의 변성단계, 2) 42 또는 50℃에서 2분간의 어닐링단계 및 3) 72℃에서 3분간의 합성단계로 된 30주기로 구성되었다. 반응혼합물(100μl)은 200μM의 dNTP, 2.9μM(32 축퇴에 대해) 및 5.8μM(64 축퇴에 대해)의 각 프라이머, 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 2.2ng의 염색체 DNA 및 2.5유니트의 Taq 중합효소를 공급된 완충액중에 함유하였다. PCR 생성물은 브롬화에티듐 염색을 사용하여 아가로스겔 전기이동[AGE]에 의해 검출하였다. 결과로서, 예상한 길이(CO I에 대해서는 약 180bp, CO II에 대해서는 약 180bp, CO III에 대해서는 약 300bp)를 갖는 DNA 단편이 증폭되었다.

(2) PCR에 의해 증폭된 DNA 단편의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열화

PCR 증폭된 DNA 단편을 아가로스겔로부터 정제하고 pCRTMII 벡터(미국의 인비트로젠사(Invitrogen Corp.))로 직접 클로닝하고 DNA 서열을 공급자의 지시에 따라 결정하였다. PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 정렬시에 표적 위치의 서열과 상당한 상동성을 나타내었다(도 3 내지 5). CO I, CO II 및 CO III의 부분 아미노산 서열을 암호화하는 PCR 생성물을 ³²P로 표지하여 각각 프로브 Pco1, Pco2 및 Pco3을 얻었다. 이 프로브를 서던 또는 콜로니 하이브리드화에 사용하여 완전한 CO I, CO II 및 CO III 유전자를 검출하였다.

(3) PCR 생성물을 프로브로서 사용한 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 염색체 DNA의 서던블롯 분석

여러 가지 제한 엔도뉴클레아제로 분해된 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 염색체 DNA를 프로브를 사용하여 서던 하이브리드화하였다. 프로브 Pco1은 Pst I 단편(8.0kb)으로, 프로브 Pco2 및 Pco3은 EcoRI 단편(9.3kb)으로 하이브리드화하였다.

(4) 8.0kb PstI 단편(CO I) 및 9.3kb EcoRI 단편(CO II 및 CO III)내 완전한 시토크롬 c 옥시다아제 유전자의 클로닝

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 염색체 DNA를 PstI 또는 EcoRI로 완전히 분해하고 얻어진 단편을 아가로스겔 전기이동하였다. 크기 9.3kb 부근(7-12kb)의 EcoRI 분해물 및 8kb 부근(6-10kb)의 PstI 분해물을 절단해내고 겔로부터 용출시켰다. 회수된 DNA 단편을 PstI 또는 EcoRI로 분해된 pUC19 벡터와 라이게이션하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 약 1,000개의 형질전환체를 PstI 또는 EcoRI 라이브러리로서 얻었다. PstI 라이브러리에 대해서는 Pco1을, EcoRI 라이브러리에 대해서는 Pco2 및 Pco3을 사용하여 콜로니 하이브리드화를 수행하였다. 각 라이브러리로부터 몇 개의 양성 콜로니를 얻었다. 플라스미드 DNA를 콜로니로부터 추출하고 PstI 또는 EcoRI 단편으로 분해하였다. 8.0kb PstI 단편은 프로브 Pco1에서 강한 신호를 나타내었고 9.3kb EcoRI 단편은 프로브 Pco2 및 Pco3 양자 모두에서 강한 신호를 나타내었다. 8.0kb PstI 단편을 함유하는 플라스미드를 pUCO01로, 9.3kb EcoRI 단편을 함유하는 플라스미드를 pUCO23으로 명명하였다.

(5) 8.0kb PstI 및 9.3kb EcoRI 단편의 물리적 지도

8.0kb PstI 및 9.3kb EcoRI 단편의 물리적 지도는 프로브 Pco1, Pco2 및 Pco3을 사용하여 여러 가지 제한 엔도뉴클레아제로 분해된 단편을 서던 하이브리드화 분석함으로써 구성하였다. 9.3kb EcoRI 단편상에서 암호화되는 CO II 및 CO III 유전자의 방향 및 거리는 부분 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 프라이머를 사용한 PCR법으로 결정하였다(도 7).

(6) 완전한 CO I 유전자의 뉴클레오티드 서열화

pUCO01상의 CO I 유전자의 뉴클레오티드 서열은 디데옥시사슬종결법으로 결정하였다. 도 7에 도시된 바와 같이 HindIII 부위로부터 상류에 있는 2.9kb 단편이 서열화되고 하나의 오픈 리딩 프레임(서열번호: 1에 나타낸 서열에 존재하는 1,674bp의 CDS)이 단편에서 발견되었다. 이 ORF는 정제된 CO I로부터 유도된 펩티드 단편의 아미노산 서열(서열번호; 11) 및 CO I에 대한 약 180bp PCR 생성물의 DNA 서열(서열번호: 12)로부터 유도된 아미노산 서열(서열번호: 13)과 길게 일치하는 558 아미노산의 단백질(서열번호: 2)을 암호화한다[3-(1) 참조]. 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 CO I 아미노산 서열은 로도박터 스페로이데스, 파라콕커스 데니트리피칸스 및 소 미토콘드리아의 것과 각각 78.7, 76.0 및 53.3%의 상동성을 나타내었다(도 8).

(7) CO I, CO II 및 CO III 유전자 모두를 암호화하는 발현 플라스미드의 구성

CO I 유전자를 완전한 HindIII 및 부분 EcoRI 분해에 의해 pUCO01상에서 8.5kb PstI 단편으로부터 3.5kb 단편으로 분리하였다(도 7). pUCO23상의 9.3kb EcoRI 단편의 물리적 지도에 따라 CO II 및 CO III 유전자를 완전한 KpnI 및 부분 PstI 분해에 의해 분리하여 6.0kb 단편을 탠덤형으로 제조하였다(도 7). 각 단편을 pBluescriptII SK+벡터로 1회 서브클로닝하여, CO I 유전자를 함유하는 3.5kb 단편을 갖는 플라스미드 pBCO01 및 CO II 및 CO III 유전자를 함유하는 6.0KB 단편을 갖는 pBCO23을 얻었다.

도 9에 나타낸 바와 같이 CO I 유전자를 함유하는 3.5kb 단편 및 CO II 및 CO III 유전자를 함유하는 6.0kb 단편을 시토크롬 c 옥시다아제 복합체(CO I, CO II 및 CO III) 유전자의 기능적 발현을 위해 하나의 발현벡터에 공동삽입하였다. 먼저, pBCO23으로부터의 CO II 및 CO III 유전자를 함유하는 6.0kb Xbal-KpnI 단편을 블런트 엔드 라이게이션에 의해 플라스미드 벡터 pVK101의 EcoRI 부위에 삽입하였다. 그 다음 pBCO01로부터의 CO I 유전자를 함유하는 3.5kb Xbal-HindIII 단편을 6.0kb Xbal-KpnI 단편과 함께 pVK101의 BgIII 부위에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드 벡터를 pVKcoxes로 명명하였다.

실시예 4:

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 유도체내 시토크롬 c 옥시다아제 유전자의 과발현

pVK101내에 시토크롬 c 옥시다아제 유전자를 포함하는 플라스미드 pVKcoxes를 3 양친 접합매칭법으로 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 리팜피신 내성 유도체 GOS2RPM[GOS2R로부터의 단일 콜로니 분리물; 티. 호시노 등의 유럽특허공보 832974 A2]에 도입하였다. GOS2RPM의 세포는 100㎍/ml의 리팜피신과 함께 3% 트립티카아제 간장배양액(미국 미들랜드주 콕키스빌 소재의 박톤 딕킨슨(Bacton Dickinson)) 및 0.3% 효모추출액(미국 미시간주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리스(Difco Laboratories))으로 구성된 T 배지 10ml중에서 30℃에서 배양하였다(TR 배지). 공여균주인, pVKcoxes(Tcr, Kmr) 또는 pVK102(Tcr, Kmr)를 포함한 대장균 HB 및 헬퍼균주인, pRK2013(Kmr)을 포함한 대장균 HB101을 적당한 항생물질을 함유하는 루리나 버타니(Lurina Bertani) 배지에서 37℃에서 하룻밤 성장시켰다. 이러한 하룻밤 배양물(10ml의 GOS2RPM 배양물 및 2ml의 대장균 배양물)을 독립적으로 원심분리하고 세포펠렛을 독립적으로 2ml의 T 배지에 현탁하였다. 100μl의 세포현탁액을 혼합하고 50μl의 혼합 세포현탁액을, 5.0% D-만니톨 0.25% MgSO₄.7H₂O, 1.75% 옥수수 담근 액, 5% 베이커의 효모(일본 도쿄 소재의 오리엔탈 이스트사(Oriental Yeast Co.)), 0.5% CaCO₃, 0.5% 요소(별도로 멸균됨) 및 2.0% 한천(pH 7.0, 멸균전)으로 구성된 NS2 한천배지의 표면상에 놓인 니트로셀룰로오스필터상에 스포팅하였다. 플레이트를 27℃에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 세포를, 100㎍/ml의 리팜피신 및 3㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 T 한천배지상에 펼쳤다. 이와 같이 얻어진 형질접합체는 TRT 한천플레이트상에 스트리킹함으로써 정제하여 대장균의 세포 및 무플라스미드 GOS2RPM을 제거하였다.

얻어진 형질전환체 GOS2RPM(pVKcoxes) 및 COS2R(pVK102)를 배양하고 두 형질접합체의 세포를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조하였다. GOS2RPM(pVKcoxes)의 시토크롬 c 옥시다아제 레벨은 GOS2RPM(pVK102)의 것과 비교하여 하기 실험으로 결정하였다. 양 균주로부터, 가용화된 막분획을 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하 였다. 첫째, a형 헴의 함량은 환원형과 산화형의 차 스펙트럼법에 의해 GOS2RPM(pVKcoxes) 및 GOS2R(pVK102)에 대해 세포단백질 1mg당 0.03 및 0.022nmol인 것으로 결정되었다(실시예 1). 둘째, 시토크롬 c(시그마에서 구입, 말심장 VI형)의 특이적 산화속도를 측정하였다. 환원된 시토크롬 c는 환원제로서 나트륨 니티오나이트를 사용하여 제조하였고 과잉의 환원제는 PD-10 컬럼(파마시아)으로 2회 처리하여 제거하였다. 반응혼합물은 33mM 환원 시토크롬 c, 25mM Na-HEPES(pH 7.2), 2% 수크로스 모노라우레이트 및 0.5mM EDTA로 구성되었다. 환원된 시토크롬 c 의 산화속도는 550nm에서의 흡광도 감소로 측정하였고 몰계수는 22.1/mM/cm로서 취하였다. 환원된 시토크롬 c에 대한 특이적 산화속도는 GOS2RPM(pVK102) 및 GOS2R(pVKcoxes)에 대해 각각 분당 세포단백질 1mg당 1.58 및 2.00nmol인 것으로 결정되었다. 셋째, CO I 및 CO II 성분의 함량을 웨스턴블롯 분석에 의해 성분 CO I 또는 CO II에 대한 항체와 비교하였다. GOS2RPM(pVKcoxes)에 대해 보다 강한 밴드(CCD 카메라를 사용할 때 CO I에 대해서는 60% 증가, CO II에 대해서는 41% 증가)가 관찰되었다.

이들 결과로, pVKcoxes의 도입은 2KG를 생성하는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025 유도체에서 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 레벨을 기능적으로 증폭시킴을 알 수 있다.

<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> Cytochrome c oxidase and its genes <130> 9 <150> EP 99122842.0 <151> 1999-11-17 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1674 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> CDS <222> (1)..(1671) <400> 1 atg gca gac gcc gcc att cac ggc cat gac cac cat gag aag caa ggc 48 Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly 1 5 10 15 ttc ttc acg cgc tgg ttc atg tcg acc aac cac aaa gac atc ggt ctg 96 Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu 20 25 30 cta tac ctt gta gcg gct ggt gtt gtt ggt ttc att tcc gtc ctg ttc 144 Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe 35 40 45 acc gtc tac atg cgc ctt gag ctg atg gat ccg ggt gtt cag tac atg 192 Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met 50 55 60 tgc ctt gaa ggc gca cgt ctg atc gcg gat gcc tcg cag aca tgt acg 240 Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr 65 70 75 80 gcg aac gga cac ctg tgg aac gtc atg gtt acc tac cat ggt 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130 135 140 Val Ala Ser Leu Phe Ala Pro Gly Gly Asp Gly Gln Leu Gly Ser Gly 145 150 155 160 Val Gly Trp Val Leu Tyr Pro Pro Leu Ser Thr Arg Glu Ala Gly Tyr 165 170 175 Ser Met Asp Leu Ala Ile Phe Ala Val His Leu Ser Gly Ala Ser Ser 180 185 190 Ile Met Gly Ala Ile Asn Met Ile Thr Thr Phe Leu Asn Met Arg Ala 195 200 205 Pro Gly Met Thr Leu His Lys Val Pro Leu Phe Ser Trp Ser Ile Phe 210 215 220 Ile Thr Ala Trp Leu Ile Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Gly Ala 225 230 235 240 Ile Thr Met Leu Leu Thr Asp Arg Asn Phe Gly Thr Thr Phe Phe Asn 245 250 255 Pro Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ile Leu Tyr Gln His Ile Leu Trp Phe 260 265 270 Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe Gly Ile 275 280 285 Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe Gly Tyr 290 295 300 Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Val Ala Ile Gly Val Leu Gly Phe Val 305 310 315 320 Val Trp Ala His His Met Tyr Thr Val Gly Met Ser Leu Thr Gln Gln 325 330 335 Ser Tyr Phe Met Leu Ala Thr Met Val Ile Ala Val Pro Thr Gly Ile 340 345 350 Lys Ile Phe Ser Trp Ile Ala Thr Met Trp Gly Gly Ser Val Glu Phe 355 360 365 Lys Ser Pro Met Leu Trp Ala Phe Gly Phe Met Phe Leu Phe Thr Val 370 375 380 Gly Gly Val Thr Gly Ile Val Leu Ala Gln Ala Gly Leu Asp Arg Ala 385 390 395 400 Tyr His Asp Thr Tyr Tyr Val Val Ala His Phe His Tyr Val Met Ser 405 410 415 Leu Gly Ala Ile Phe Ala Ile Phe Ala Gly Ile Tyr Phe Tyr Met Pro 420 425 430 Lys Phe Ser Gly Arg Ala Phe Pro Glu Trp Ala Ala Lys Leu His Phe 435 440 445 Trp Thr Phe Phe Ile Gly Ala Asn Val Thr Phe Phe Pro Gln His Phe 450 455 460 Leu Gly Arg Gln Gly Met Pro Arg Arg Tyr Ile Asp Tyr Pro Glu Ala 465 470 475 480 Phe Ala Leu Trp Asn Lys Val Ser Ser Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Phe 485 490 495 Ala Ser Phe Leu Phe Phe Ile Val Ile Phe Val Tyr Thr Leu Val Ala 500 505 510 Gly Arg Arg Glu Thr Arg Pro Asn Pro Trp Gly Glu Phe Ala Asp Thr 515 520 525 Leu Glu Trp Thr Leu Pro Ser Pro Pro Pro Ala His Thr Phe Glu Thr 530 535 540 Leu Pro Lys Arg Ser Asp Trp Asp Lys His Pro Ser His 545 550 555 <210> 3 <211> 132 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> CDS <222> (1)..(132) <400> 3 ccg ctg gaa atc gtc tgg acg att gtt ccg gtt gtg att ctg gtc ttc 48 Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr Ile Val Pro Val Val Ile Leu Val Phe 1 5 10 15 atc ggt gcg ttc tcg ctg ccg gtg ctg ttc aaa cag caa gag ttc ccc 96 Ile Gly Ala Phe Ser Leu Pro Val Leu Phe Lys Gln Gln Glu Phe Pro 20 25 30 gag ggt gac atc gtc atc aac gtc gag ggt cgt agc 132 Glu Gly Asp Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Arg Ser 35 40 <210> 4 <211> 44 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 4 Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr Ile Val Pro Val Val Ile Leu Val Phe 1 5 10 15 Ile Gly Ala Phe Ser Leu Pro Val Leu Phe Lys Gln Gln Glu Phe Pro 20 25 30 Glu Gly Asp Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Arg Ser 35 40 <210> 5 <211> 114 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> CDS <222> (1)..(114) <400> 5 atc gtc cac ggc gac cgc aag aaa acc gcg att ggc cta gcg att gcc 48 Ile Val His Gly Asp Arg Lys Lys Thr Ala Ile Gly Leu Ala Ile Ala 1 5 10 15 atc ggc ctt ggc tgg atc ttt acc ctg tgc caa gcc tat gaa tat tat 96 Ile Gly Leu Gly Trp Ile Phe Thr Leu Cys Gln Ala Tyr Glu Tyr Tyr 20 25 30 gaa atc gtc cat acc gaa 114 Glu Ile Val His Thr Glu 35 <210> 6 <211> 38 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 6 Ile Val His Gly Asp Arg Lys Lys Thr Ala Ile Gly Leu Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Gly Leu Gly Trp Ile Phe Thr Leu Cys Gln Ala Tyr Glu Tyr Tyr 20 25 30 Glu Ile Val His Thr Glu 35 <210> 7 <211> 87 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> CDS <222> (1)..(87) <400> 7 gat tcg atc ttc ctg ctg gtc tgc ctg atc cgc atc ctg cgc ggt gcg 48 Asp Ser Ile Phe Leu Leu Val Cys Leu Ile Arg Ile Leu Arg Gly Ala 1 5 10 15 atg tcg gca aaa cag cac gtc ggt ttc gag atg gcc gca 87 Met Ser Ala Lys Gln His Val Gly Phe Glu Met Ala Ala 20 25 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 8 Asp Ser Ile Phe Leu Leu Val Cys Leu Ile Arg Ile Leu Arg Gly Ala 1 5 10 15 Met Ser Ala Lys Gln His Val Gly Phe Glu Met Ala Ala 20 25 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 9 Trp Phe Phe Gly His Pro 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 10 Val Trp Ala His His Met 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <400> 11 Lys Asp Ile Gly Leu Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe 1 5 10 15 <210> 12 <211> 168 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> CDS <222> (1)..(168) <400> 12 tgg ttt ttt gga cac ccg gaa gtg tac atc atc att ctg ccc ggc ttt 48 Trp Phe Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe 1 5 10 15 ggc atc atc agc cat gtc gtg tcg acc ttc tcg aaa aag ccg gtc ttc 96 Gly Ile Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe 20 25 30 ggt tac ctg ccg atg gtc tat gca atg ttg gca atc ggt gtt ctg ggc 144 Gly Tyr Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Leu Gly 35 40 45 ttt gtc gtg tgg gcg cac cat atg 168 Phe Val Val Trp Ala His His Met 50 55 <210> 13 <211> 56 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 13 Trp Phe Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe 1 5 10 15 Gly Ile Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe 20 25 30 Gly Tyr Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Leu Gly 35 40 45 Phe Val Val Trp Ala His His Met 50 55 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <400> 14 Lys Ala Ser Gln Phe Thr His Asn Thr Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr 1 5 10 15 Ile Val Pro Val 20 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 15 Gln Phe Thr His Asn Thr 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 16 Trp Tyr Trp Gly Tyr Glu Tyr 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 17 Thr Trp Ala His His Ala 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 18 Trp Tyr Trp His Phe Val Asp 1 5

Claims

서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 코어 소단위체 I(CO I) 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 코어 소단위체 II(CO II)를 포함하는 시토크롬 c 옥시다아제 복합체.
제 1 항에 있어서,

(i) SDS-PAGE 분석에 의한 CO I의 겉보기 분자량이 43±10kDa이고, SDS-PAGE 분석에 의한 CO II의 겉보기 분자량이 36 ±10kDa이고;

(ii) aa3형 시토크롬 c 옥시다아제를 나타내는 흡수 스펙트럼이 환원형과 산화형의 차 스펙트럼에서 605 ±1nm 피크인 시토크롬 c 옥시다아제 복합체.
청구항 3은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 1 항에 있어서,

글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적으로 또는 분류학적으로 균질한 배양물로부터 유래되는 실질적으로 균질한 단리물인 시토크롬 c 옥시다아제 복합체.
청구항 4은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 1 항에 있어서,

재조합 효소인 시토크롬 c 옥시다아제 복합체.
청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 1 항에 있어서,

CO I이 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖고 CO II가 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 시토크롬 c 옥시다아제 복합체.
청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 1 항에 있어서,

서열번호: 6 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 코어 소단위체 III(CO III)을 추가로 포함하는 시토크롬 c 옥시다아제 복합체.
서열번호: 2, 4, 6 및 8로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고 제1항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 c 옥시다아제 복합체를 제공할 수 있는 재조합 폴리펩티드.
제 7 항에 있어서,

하기 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 갖는 재조합 DNA 단편에 의해 암호화되는 재조합 폴리펩티드:

(a) 서열번호: 1의 DNA 서열;

(b) 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열;

(c) 서열번호: 3의 DNA 서열;

(d) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열;

(e) 서열번호: 5의 DNA 서열;

(f) 서열번호: 7의 DNA 서열;

(g) 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열; 및

(h) 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.
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제 7 항에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA 단편.
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청구항 16은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 13 항에 따른 재조합 DNA 단편을 갖고 유기체내 발현에 적합한 발현벡터.
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제 13 항에 따른 재조합 DNA 단편을 갖는 발현벡터가 도입되거나, 또는 제 13 항에 따른 DNA 단편이 게놈에 통합된 재조합 미생물.
삭제
청구항 21은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 19 항에 있어서,

숙주 유기체가 대장균, 슈도모나스 푸티다, 아세토박터 크실리넘, 아세토박터 파스퇴리아누스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 한세니 및 글루코노박터 옥시단스와 같은 박테리아로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물인 재조합 미생물.
청구항 22은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.

제 21 항에 있어서,

숙주 유기체가 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025, 또는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025의 동정 특성을 갖는 미생물의 생물학적으로 또는 분류학적으로 균질한 배양물인 재조합 미생물.
제 19 항, 제 21 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 적당한 배양 배지에서 배양하고 배양물로부터 시토크롬 c 옥시다아제를 회수하는 것을 포함하는, 시토크롬 c 옥시다아제 복합체의 제조방법.
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제 19 항, 제 21 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 적당한 배양 배지에서 배양하고 배양물로부터 2-케토-L-굴론산을 회수하는 것을 포함하는, L-소르보스 또는 D-소르비톨로부터 2-케토-L-굴론산을 제조하는 방법.
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제 26 항에 있어서,

2-케토-L-굴론산을 L-아스코르브산으로 추가로 전환시키는 방법.