CN103512870A - 一种线粒体呼吸链复合物iv酶活性检测方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶，EC1.9.3.1）酶活力分析和检测的方法，同时本发明还提供了测定线粒体呼吸链复合物IV酶活性的试剂，上述方法和试剂可用于分析和测定待测样本中的线粒体呼吸链复合物IV的酶活力，从而可以用于临床疾病的分析、检验和诊断。本发明的原理是：细胞色素C氧化酶可以将氧化型的荧光染料分子还原后产生还原型的荧光染料分子，还原型的染料分子可以在特定的激发光下发射荧光，其反应的速率与产生荧光染料分子的荧光强度成正比，通过检测荧光值的变化就可以计算待测样本中的线粒体呼吸链复合物IV酶活力。

Description

一种线粒体呼吸链复合物IV酶活性检测方法和试剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，同时又属于遗传代谢病的临床诊断和检测领域。具体而言本发明提供了一种测定线粒体复合物IV（细胞色素C氧化酶，cytochrome c oxidase，EC1.9.3.1）酶活力的方法，同时本发明还提供了作为线粒体复合物IV（细胞色素C氧化酶，cytochrome c oxidase，EC1.9.3.1）的酶活性分析和检测的试剂。

背景技术

线粒体是真核细胞中的一种细胞器，由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴, 两层膜之间有腔, 称为膜间隙，线粒体内部是基质。线粒体内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。作为细胞的"动力工厂" (power plant)，线粒体是氧化磷酸化功能的唯一执行者，提供了机体所需95%的能量三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP），在新陈代谢和生物能量转换中处于中心地位，对生命机能的维持作用重大。1962年，人类开始认识线粒体疾病，Luft等报道了因线粒体电子传递和ATP合成之间偶联障碍引起的代谢异常病例。1977年Willems等在线粒体病患者发现了肌肉组织细胞色素c氧化酶（Cytochrome C oxidase, COX）活性缺陷，将线粒体疾病与呼吸链酶复合物功能缺陷联系起来。此后，进一步研究发现呼吸链酶复合物功能缺陷与多种脑病和肌肉病相关。1988年，Wallace等首次明确Leber遗传性视神经病（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）为线粒体基因（Mitochondrial DNA, mtDNA）突变引起，对线粒体疾病的认识深入到分子水平。迄今研究证实很多脑病、肌病、眼病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病、心肌病、肿瘤等疾病及衰老的发生发展与线粒体功能缺陷相关。

近50余年来，国内外学者对线粒体疾病进行了逐步深入的研究，认识到线粒体病遗传方式的复杂性，致病基因涉及多个核基因和线粒体基因组，临床表现复杂多样，起病急缓不同，可以累及多个脏器、各个年龄人群。由于疾病临床表型和基因型的复杂性，使得临床诊断、病因诊断面临着巨大挑战。对于可疑线粒体病的患者来说，理想的遗传学诊断方法是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。但是，基因突变可能在mtDNA上，更多的可能是发生在核基因（Nuclear DNA, nDNA）上，线粒体病的遗传方式可能为常染色体隐性遗传、X连锁遗传、母系遗传，个别为散在新突变。由于线粒体病涉及基因众多，不可能做到逐一分析。选择常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。

线粒体呼吸链酶复合物缺陷是线粒体疾病的主要病因，由于能量代谢障碍引起细胞能量不足，导致多系统受累。线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍所导致的线粒体病临床表现复杂多样，可同时累及多个组织器官，通常以耗能高的器官表现明显，如肌肉、肝脏、神经系统等。造成明显肌肉问题的线粒体病称为线粒体肌病（mitochondrial myopathy），而同时造成明显的肌肉和神经症状的则称为线粒体脑肌病（mitochondrial encephalomyopathy）。发病年龄范围广泛，从新生儿到成人均可发病，临床表现随着年龄的不同而有所不同。神经系统损害主要表现有：智力运动发育落后或倒退、无力、惊厥、肌张力异常、震颤等。Skladal等对75例线粒体呼吸链缺陷患者进行研究，发现肌肉和中枢神经系统最易受累，分别占88%和73%，抽搐31%，眼部损害53%，肝脏损害19%，肾脏损害11%。Debray等研究发现妊娠期异常在线粒体病中表现较为明显，其中低出生体重占20%。本研究中线粒体呼吸链缺陷病患者智力运动倒退、肌张力异常和抽搐是主要的神经系统损害表现，分别为30%、57.5%和32.5%，未发现以上各种临床表现在不同类型的呼吸链酶复合物缺陷中有显著差异（P>0.05），与报道的基本一致；但眼部、肾脏和肝脏损害发生率相对国外报道较低。线粒体呼吸链复合物缺陷患者常表现为特殊的临床综合征，典型线粒体病相关综合征有Leigh综合征、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(Mitochondrial encephalopathy,lacticacidosis, and stroke-like episodes, MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红肌纤维病（Myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers, MERRF）、Leber 遗传性视神经病（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）等。

线粒体呼吸链缺陷病可以累及多个器官，临床表现复杂多样，缺乏特异性，并有许多交叉重叠现象，给临床诊断带来极大的困难，仅依靠临床诊断和普通生化检查很难达到准确诊断的目的。理想的确诊方法是明确酶缺陷类型、检测到引起呼吸链酶复合物结构和功能缺陷的致病基因，但相关致病基因多至1000余个，基因诊断非常困难。Liang等曾对2000名怀疑为线粒体疾病患者的常见基因突变位点进行筛查，阳性率只有6%。Lebon等先通过呼吸链酶学测定确定呼吸链复合物Ⅰ活性缺陷患者，然后进行了编码复合物Ⅰ的线粒体基因序列分析，基因诊断阳性结果提高到20%。研究结果提示在线粒体呼吸链疾病的诊断中，基础检测应该建立在准确的呼吸链酶学诊断学分析的基础上。既往由于我国缺乏临床可行的线粒体呼吸链酶学诊断技术，仅极少数患者通过基因筛查、组织病理分析获得诊断，回顾分析我国线粒体病常见基因突变位点筛查阳性结果仅8.15%。因此，单纯采用基因筛查来获得明确诊断的方法在临床应用上存在相当的局限性，需要依靠线粒体呼吸链酶活性测定进行诊断。由于导致线粒体病产生的直接因素就是患者体内相关酶活性降低或完全缺失，而且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关，因此判断患者线粒体相关酶的活性是否正常，同时结合患者的临床症状表现，就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。可见线粒体相关酶尤其是线粒体呼吸链复合物酶活性检测作为线粒体病的诊断依据具有其他方法不能比拟的优势，临床上通过对疑似线粒体病的患者进行相关酶活性检测，可以实现早诊断、早治疗，对线粒体病预后，减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测线粒体相关酶活性是辅助确诊该病的最佳手段。

呼吸链酶复合物是线粒体生物氧化功能的体现，酶复合物活性下降是诊断线粒体病的重要生化特征，也是研究和诊断疾病的另一个重要切入点。理想的呼吸链酶复合物活性检测标本是选用疾病受累明显的组织，例如脑、肾、心肌、肝和内分泌腺体，以获得足量的线粒体蛋白，但是这些组织很难取材，目前多选用骨骼肌或以外周血白细胞、皮肤成纤维细胞。曾有研究证实呼吸链酶复合物缺陷患者的皮肤成纤维细胞在体外培养时可能发生细胞呼吸链酶复合物活性不稳定，甚至活性转为正常，导致假阴性结果。肌肉组织标本不正确的冷冻储存也会导致线粒体呼吸链酶复合物活性迅速下降。而皮肤或骨骼肌活检均为创伤性检查，患儿及家长较难接受，正常值收集困难，临床推行皮肤或骨骼组织的呼吸链复合物酶活性测定难度很大。Chretien等研究报道在外周血白细胞被检出酶复合物活性缺陷的线粒体病患者中，有91%的患者同时被检测出骨骼肌酶复合物活性缺陷，说明外周白血细胞能较好地反映骨骼肌酶复合物活性。但是，由于外周血淋巴细胞中线粒体含量较少，提取线粒体及分离线粒体蛋白难度很大。

国外研究证实线粒体呼吸链复合物IV功能缺陷是导致线粒体病的重要原因，约占线粒体呼吸链疾病的1/3。线粒体呼吸链复合物IV（Complex IV），确切的名称为线粒体细胞色素C氧化酶（又称为细胞色素氧化酶），复合物IV的功能是接受还原型细胞色素C的4个电子，并传递给1个分子态的氧，将1分子氧转化为两个水分子，在传递电子的同时向线粒体膜间隙释放4个质子，在内膜两侧形成质子梯度，将能量以电化学势能的形式储存在线粒体内膜上。

复合物IV由13个亚基构成，其编码基因包括核基因和线粒体基因两种，其中线粒体基因编码复合物IV的3个蛋白亚基。这3个亚基位于酶的催化中心，起电子传递功能。其余的10个蛋白亚基由核基因编码，这些亚基中任意一个功能异常均会导致线粒体病的发生，如LHON（Leber hereditary optic neuropathy）、MT-C4D (mitochondrial complex IV deficiency)、 DFNM (deafness sensorineural mitochondrial)、CRC (colorectal cancer)、RM-MT (recurrent myoglobinuria mitochondrial)、LSFC（French-Canadian type of Leigh syndrome）等。 

但是目前采用的线粒体呼吸链复合物IV酶活性的检测方法都是比色法，即通过分光光度计检测线粒体呼吸链复合物的酶活性，这种方法的缺点是灵敏度低，准确度差，对样品的需求量大。与分光比色法相比，荧光法检测酶活具有蛋白用量少，检测灵敏度高，特异性高，准确度高的优点。

基于这些技术背景和临床诊断的现实需求，我们一直在努力研究建立新的荧光法，以期更加灵敏的准确的检测样本中的线粒体呼吸链酶复合物IV的活性，并取得了重要突破：我们发现线粒体呼吸链酶复合物IV（细胞色素C氧化酶）在特定条件下能够将还原型细胞色素C中的电子转移给氧化型的荧光底物刃天青（Resazurin），生成还原型的染料分子试卤灵（Resorufin），而试卤灵（Resorufin）在530-580nm激发波长下可以产生560-620nm特异的荧光，这种荧光可以被荧光检测设备轻松捕捉信号，而且信号很稳定。这样就极大的提高了测试的灵敏度，不仅降低了对测试样本的量的需求，还大大地提高了测试的准确度，这一技术突破将大大改进我们之前建立的外周血白细胞线粒体呼吸链酶复合物活性测定技术平台和临床检测方法，为临床线粒体病临床及病因诊断进一步奠定坚实的技术基础，必将产生更好的社会效益。

本发明的线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶）的酶活性的荧光法检测原理为：待测样本中的线粒体呼吸链复合物IV可以将底物还原型细胞色素C的电子传递给氧化型荧光染料分子后生成还原型荧光染料分子，还原型荧光染料分子在特定的激发光下可发射特定波长的荧光，且线粒体呼吸链复合物IV催化还原型细胞色素C与氧化型荧光染料分子反应的速率与还原型荧光分子发射的荧光强度成正比，这样就可以通过检测荧光强度的变化来计算待测样本中的线粒体呼吸链复合物IV酶活力。显然采用本荧光法检测方法制备的测定试剂具有方便、快捷、信号稳定，干扰少，灵敏度高和准确度高的特点，便于推广应用。

发明内容

[0012] 本发明解决的技术问题是：提供一种快速、特异、准确可靠的线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶，cytochrome c oxidase，EC1.9.3.1）的酶活力的荧光检测法，同时本发明还提供用于荧光法测定线粒体呼吸链复合物IV酶活性的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。

本发明提供的是一种创新的线粒体呼吸链复合物IV的检测方法和检测试剂，线粒体呼吸链复合物IV就是细胞色素C氧化酶（又称为细胞色素氧化酶），英文名称为 cytochrome c oxidase，其酶学国际标准名称为 EC1.9.3.1；也经常简称为复合物IV。本发明的摘要，权利要求书和说明书中用到上述名称的任何一个都是相同意思的表达。

为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供的是一种荧光法检测线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶）的酶活性。这种线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶）酶活性测定方法的原理如下：细胞色素C氧化酶在特定条件下能够将还原型细胞色素C中的电子转移给氧化型电子受体R生成还原型的R；还原型的R在特定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光，因此在特定的条件下可检测到还原型R的荧光值变化，由于细胞色素C氧化酶催化底物反应的速率与还原型R的生产量成正比，因此检测在特定波长下的还原型R的荧光值的变化，就可以计算出细胞色素C氧化酶的酶活力。特殊情况下，这种还原型R同时还在特定的波长下具有特异的光吸收，因此也可检测在特定波长下的还原型R的吸光值的变化来计算出细胞色素C氧化酶的酶活力，显然这种可见光的检测方法不如前述的荧光法那么灵敏，稳定，特异和准确。

上述反应原理也可以用以下反应方程式来简单表示：

还原型细胞色素C + R（氧化型）                                                

氧化型细胞色素C + R（还原型）

本发明提供的如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于：它是一种在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的分子或试剂，氧化型R被细胞色素C氧化酶还原后产生还原型R。这类分子或试剂可以是目前已经存在且被普遍接受的，也可以是未来新合成或新发现的分子或试剂；由于这类试剂在本发明提供的方法和试剂中实际起到了一个被用于检测反应体系的变化强度的染料分子的作用，所以在本发明的摘要，权利要求书和说明书中又常会出现荧光染料分子，染料分子等名词来形容或表示符合权利要求书1-2所述的电子受体R。

本发明提供的如权利要求书1所述电子受体R，其特征在于：它是刃天青（Resazurin），它的结构式为：

在细胞色素C氧化酶的催化作用下，底物还原型细胞色素C的电子被传递给了刃天青，刃天青得到电子后被还原为试卤灵（Resorufin），试卤灵的结构式为：

试卤灵是一种还原型荧光染料分子，用光学上通用的荧光检测设备可在530-580nm激发波长，560-620nm的发射波长（最适发射波长为590nm）下检测到特异的荧光。因此检测在560-620nm的还原型R的荧光值的变化，就可以根据权利要求书1所述的方法确定出细胞色素C氧化酶的酶活力

此外，试卤灵在可见光下也具有特异的光吸收，最适检测波长为570nm，用一般的检测光吸收的设备可在570nm下检测到特异的吸光值。因此检测在570nm试卤灵的吸收光强的变化，也可以确定出细胞色素C氧化酶的酶活力。

本发明权利要求书4提供的是一种细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据本发明的权利要求书1所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。

本发明提供的如权利要求书4所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2或3所述的电子受体R，这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。

本发明提供的如权利要求书4-5所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分还可以包括电子供体还原型细胞色素C，这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。还原型细胞色素C是细胞色素C氧化酶的天然底物，在反应中主要是起一种电子供体的作用。

本发明提供的如权利要求书4-5所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制细胞色素C氧化酶酶活性的试剂或分子。细胞色素C氧化酶的特异酶活性可以通过计算细胞色素C氧化酶的总活性（不加抑制剂得到的酶活力）与细胞色素C氧化酶的非特异活性（加入一定浓度的抑制剂后得到的酶活力）的差值得到。这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。这种抑制剂包括但不限于以下实例：氰化物、硫化氢、叠氮化合物和一氧化碳。

本发明提供的如权利要求书4-5所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括稳定剂。所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂（detergent），它的存在可以稳定细胞色素C氧化酶的物化性质，利于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：Triton x-100、Tween20、NP40、Brij-35、n-Dodecyl-beta-D-maltoside、Sodium deoxycholate、Sodium cholate。

本发明提供的如权利要求书4-5所述的细胞色素C氧化酶酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括缓冲试剂。所述缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂，它的存在可以有效的稳定细胞色素C氧化酶的催化反应的pH值，并可以稳定细胞色素C氧化酶的物化性质，从而利于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：

乙酸钠/乙酸：pH 2.6-5.8

柠檬酸/柠檬酸钠：pH 3.0-6.6

磷酸氢盐/柠檬酸（盐）：pH 2.2-8.0

磷酸盐：pH 4.9-8.2

柠檬酸/氢氧化钠/盐酸：pH 2.2-6.5

MES：pH5.5-6.7

MOPS：pH6.5-7.9

HEPES：pH6.8-8.2

Tris-盐酸：pH 7.1-8.9

硼酸-硼砂缓冲液：pH7.4-9.0

如权利要求书9所述，本发明还提供了一种检测细胞色素C氧化酶活性的试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-8所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

   缓冲液                                       10—1000mmol/L

   pH范围                                      5.0—9.0

   稳定剂                                       0.01%—10%

   还原型细胞色素C                             0.01—10mmol/L

   抑制剂                                       0—20mmol/L

   氧化型底物R                                 0.002—10mmol/L

这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性分析和检测。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双剂还是三剂，如下成分关系的本发明细胞色素C氧化酶检测试剂较为理想：

缓冲液                                     25 —100mmol/L

pH范围                                    6.5—8.0

稳定剂                                     0.1—0.5%

还原型细胞色素C                           0.05—0.2mmol/L

抑制剂                                    0.001—0.01mmol/L

底物R                                     0.005—0.02mmol/L

本发明的细胞色素C氧化酶酶活力检测试剂可以配成如下双剂试剂：                     

试剂1

缓冲液，稳定剂，还原型细胞色素C，R

试剂2

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。

也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液，稳定剂，还原型细胞色素C

试剂2

缓冲液，稳定剂，R

试剂3

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。

本发明提供的如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶酶活性检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析和检测各种待测样本中的细胞色素C氧化酶的酶活力，特别是检测人体各种体液、组织或细胞样本中细胞色素C氧化酶的酶活力。这些被检测的样本包括但不限于脑组织、肝组织、肌组织、白细胞、成纤维细胞，提取的线粒体、提取的各种纯度的细胞色素C氧化酶样品等。

本发明提供的如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶酶活性检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的细胞色素C氧化酶的酶活力。

本发明提供的如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶酶活性检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析、检测和诊断待测样本中的细胞色素C氧化酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由细胞色素C氧化酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。从而可以广泛应用到临床检测或诊断与细胞色素C氧化酶的酶活力相关的疾病。

 

具体实施方式

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由本发明的权利要求书具体限定。

实施例一    人血液白细胞中的线粒体提取

取人全血2ml，加入8ml裂解液（0.1mM EDTA），处理15min以破碎红细胞，3000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀即是白细胞，用生理盐水洗涤白细胞两次，3500rpm离心5min，弃上清，收集白细胞沉淀。向沉淀加入5ml细胞悬浮液（0.25M Sucrose, 5mM HEPES, 0.5mM EGTA, pH7.4）悬浮细胞，用玻璃匀浆器匀浆20次，匀浆液经1000g离心10分钟，弃沉淀，收集上清；上清于10000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀即为线粒体，线粒体可在-80℃条件下保存。

 

实施例二    猪心肌线粒体的提取

称取已剪除脂肪组织的猪心肌750g，加入2.25L的0.25M（内含0.01M，pH8磷酸缓冲液）的蔗糖溶液，分三次捣碎75秒，捣碎前加入适量6N KOH保持pH7.2-7.4，KD-70离心机以2600-2800rpm离心10分钟，用四层纱布过滤后，弃沉淀。上清在Beckman J2-21以1200rpm离心25分钟，所得沉淀即为线粒体，悬浮于0.25M（内含0.01M，pH8磷酸缓冲液）的蔗糖溶液中，线粒体可在-80℃条件下保存。

 

实施例三   人血白细胞线粒体呼吸链复合物IV活性测定（荧光终点法）

本实施例的线粒体呼吸链复合物IV检测试剂为双剂试剂，包括

试剂1

磷酸缓冲液（pH7.0）                          50mmol/L

Sodium deoxycholate                            0.1%

还原型细胞色素C                              0.06mmol/L

刃天青钠                                      0.01mmol/L

试剂2

 NaN3                                        0.02mmol/L

被测线粒体呼吸链复合物IV的样品为10例健康成年人白细胞中线粒体，经破碎处理后，反应体系中总蛋白用量为25ug，反应体系为250ul。本检测方法采用终点法检测线粒体呼吸链复合物IV酶活性。

总活性测定：将试剂1与线粒体蛋白混合后置于30℃环境中温浴30分钟，然后终止反应，取终止后的混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm条件下检测产物的荧光值，记为F_总。

非特异活性测定：将试剂1与试剂2、线粒体蛋白混合均匀后置于30℃环境中温浴30分钟，然后终止反应，取终止后的混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm条件下检测产物的荧光值，记为F_非。

经检测试剂1空白荧光读值平均为354，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测30分钟测定复合物IV总活性，总活性荧光读值（扣除试剂空白）为380，试剂1与试剂2混合后的空白荧光读值平均为303，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测30分钟测定复合物IV的非特异活性，非特异活性的荧光读值（扣除试剂空白）为9（见表1所示）。

复合物IV的特异活性荧光值=F_总－ F_非。

我们的酶活力单位为：每分钟每克蛋白转化底物的纳摩尔数，用nmol/h/g蛋白表示。根据试卤灵标准曲线（y=11558x，R²=0.9994，其中x表示试卤灵的浓度，单位是uM，y表示荧光值，用FLU表示）可以将计算得到的复合物IV的特异荧光值转化成产物试卤灵的浓度，根据蛋白用量和反应时间可计算细胞色素C氧化酶的酶活力。

 

表1  线粒体呼吸链复合物IV总活性与非特异性活性检测结果

      实验结果表明，本发明的检测线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶）酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的线粒体呼吸链复合物IV酶活力且测定稳定，可应用于临床检测与线粒体呼吸链复合物IV酶活力异常相关的疾病。

 

实施例四    人白细胞中线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶）的酶活性检测应用于线粒体病的诊断

以经基因分析已确诊的线粒体呼吸链复合物I、III、IV、V缺陷病例的志愿者为分析对象，以健康志愿者为对照，采用实施例一和五所描述的方法，提取这些志愿者的外周血白细胞中的线粒体后，对上述样品进行复合物IV酶活力的测定，每个样本分别进行5次独立的酶活性测定实验，结果显示：样本的酶活力测定实验结果稳定（CV值均小于5%），其中复合物IV患者酶活力只有对照组的50~60%，而复合物I、III患者和复合物V患者的复合物IV活性正常（见表2），这一结果与基因分析的结论相吻合。可见本发明提供的细胞色素C氧化酶活性检测方法和试剂稳定、特异、可靠，可应用于临床检测与细胞色素C氧化酶酶活力异常相关的疾病。

表2  线粒体呼吸链复合物IV活性检测结果

总之，实践证明，采用本发明的检测线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶）酶活力的方法和试剂完全可以通过一般的荧光检测设备检测得出所需的测定结果，并且灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于临床检测与线粒体呼吸链复合物IV酶活力异常相关的疾病。

参考文献

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Claims (15)

1.一种线粒体呼吸链复合物IV（细胞色素C氧化酶，EC 1.9.3.1）活性测定方法，其特征在于它的原理如下：

细胞色素C氧化酶在特定条件下能够将还原型细胞色素C中的电子转移给氧化型电子受体R生成还原型的R；还原型的R在特定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光，因此在特定的条件下可检测到还原型R的荧光值，由于细胞色素C氧化酶催化底物反应的速率与还原型R的生成量成正比，因此检测还原型R的荧光值的变化，就可以计算出细胞色素C氧化酶的酶活力。

2.如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于：它是一种在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的分子或试剂，氧化型R被细胞色素C氧化酶还原后产生还原型R，还原型R可以在特定激发光条件下发射出特异的荧光。

3.如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于，它是刃天青（Resazurin），它的结构式为：

刃天青被还原后的产物是试卤灵（Resorufin），试卤灵在530-580nm激发波长下，可以发射波长为560-620nm的荧光。

4.一种细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书1所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。

5.如权利要求书4所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2或3所述的电子受体R，这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。

6.如权利要求书4-5所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分还可以包括电子供体还原型细胞色素C，这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性的分析和检测。

7.如权利要求书4-6所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制细胞色素C氧化酶酶活力的试剂或分子。

8.如权利要求书4-6所述的细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂。

9.一种细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-8所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

 如权利要求书8所述的缓冲液                     10—1000mmol/L

   pH范围                                                    5.0—9.0

   如权利要求书8所述的稳定剂                      0.01%—10%

   还原型细胞色素C                                    0.01—10mmol/L

   如权利要求书7所述的抑制剂                      0—20mmol/L

   如权利要求书1-3所述的电子受体R            0.002—10mmol/L

这种检测试剂主要用于细胞色素C氧化酶的酶活性分析和检测。

10.根据权利要求9所述细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型细胞色素C、抑制剂、R组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型细胞色素C、R组成；试剂2，由抑制剂组成。

11.根据权利要求9所述细胞色素C氧化酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型细胞色素C、抑制剂、R组成三剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型细胞色素C组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、R组成；试剂3，由抑制剂组成。

12.如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的细胞色素C氧化酶的酶活力。

13.如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测人体的各种体液、组织和细胞样本中的细胞色素C氧化酶的酶活力。

14.如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的细胞色素C氧化酶的酶活力。

15.如权利要求书1-11所述的细胞色素C氧化酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与细胞色素C氧化酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由细胞色素C氧化酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。