CN103424384A - 一种线粒体呼吸链复合物i酶活性检测方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶，EC1.6.5.3）酶活力分析和检测的方法，同时本发明还提供了测定线粒体呼吸链复合物I酶活性的试剂，上述方法和试剂可用于分析和测定待测样本中的线粒体呼吸链复合物I的酶活力，从而可以用于临床疾病的分析、检验和诊断。基于该方法，本发明提供的测定线粒体呼吸链复合物I酶活性的试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。

Description

一种线粒体呼吸链复合物I酶活性检测方法和试剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶，NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）酶活力的方法，同时本发明还提供了作为线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶，NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）的酶活性分析和检测的试剂。 

背景技术

线粒体是真核细胞中的一种细胞器，由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴, 两层膜之间有腔, 称为膜间隙，线粒体内部是基质。线粒体内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。作为细胞的"动力工厂" (power plant)，线粒体是氧化磷酸化功能的唯一执行者，提供了机体所需95%的能量三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP），在新陈代谢和生物能量转换中处于中心地位，对生命机能的维持作用重大。1962年，人类开始认识线粒体疾病，Luft等报道了因线粒体电子传递和ATP合成之间偶联障碍引起的代谢异常病例。1977年Willems等在线粒体病患者发现了肌肉组织细胞色素c氧化酶（Cytochrome C oxidase, COX）活性缺陷，将线粒体疾病与呼吸链酶复合物功能缺陷联系起来。此后，进一步研究发现呼吸链酶复合物功能缺陷与多种脑病和肌肉病相关。1988年，Wallace等首次明确Leber遗传性视神经病（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）为线粒体基因（Mitochondrial DNA, mtDNA）突变引起，对线粒体疾病的认识深入到分子水平。迄今研究证实很多脑病、肌病、眼病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病、心肌病、肿瘤等疾病及衰老的发生发展与线粒体功能缺陷相关。 

近50余年来，国内外学者对线粒体疾病进行了逐步深入的研究，认识到线粒体病遗传方式的复杂性，致病基因涉及多个核基因和线粒体基因组，临床表现复杂多样，起病急缓不同，可以累及多个脏器、各个年龄人群。由于疾病临床表型和基因型的复杂性，使得临床诊断、病因诊断面临着巨大挑战。对于可疑线粒体病的患者来说，理想的遗传学诊断方法是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。但是，基因突变可能在mtDNA上，更多的可能是在发生在核基因（Nuclear DNA, nDNA）上，线粒体病的遗传方式可能为常染色体隐性遗传、X连锁遗传、母系遗传，个别为散在新突变。由于线粒体病涉及基因众多，不可能做到逐一分析。选择常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。 

线粒体呼吸链酶复合物缺陷是线粒体疾病的主要病因，由于能量代谢障碍引起细胞能量不足，导致多系统受累。线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍所导致的线粒体病临床表现复杂多样，可同时累及多个组织器官，通常以耗能高的器官表现明显，如肌肉、肝脏、神经系统等。造成明显肌肉问题的线粒体病称为线粒体肌病（mitochondrial myopathy），而同时造成明显的肌肉和神经症状的则称为线粒体脑肌病（mitochondrial encephalomyopathy）。发病年龄范围广泛，从新生儿到成人均可发病，临床表现随着年龄的不同而有所不同。神经系统损害主要表现有：智力运动发育落后或倒退、无力、惊厥、肌张力异常、震颤等。Skladal等对75例线粒体呼吸链缺陷患者进行研究，发现肌肉和中枢神经系统最易受累，分别占88%和73%，抽搐31%，眼部损害53%，肝脏损害19%，肾脏损害11%。Debray等研究发现妊娠期异常在线粒体病中表现较为明显，其中低出生体重占20%。本研究中线粒体呼吸链缺陷病患者智力运动倒退、肌张力异常和抽搐是主要的神经系统损害表现，分别为30%、57.5%和32.5%，未发现以上各种临床表现在不同类型的呼吸链酶复合物缺陷中有显著差异（P>0.05），与报道的基本一致；但眼部、肾脏和肝脏损害发生率相对国外报道较低。线粒体呼吸链复合物缺陷患者常表现为特殊的临床综合征，典型线粒体病相关综合征有Leigh综合征、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(Mitochondrial encephalopathy,lacticacidosis, and stroke-like episodes, MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红肌纤维病（Myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers, MERRF）、Leber 遗传性视神经病（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）等。 

线粒体呼吸链缺陷病可以累及多个器官，临床表现复杂多样，缺乏特异性，并有许多交叉重叠现象，给临床诊断带来极大的困难，仅依靠临床诊断和普通生化检查很难达到准确诊断的目的。理想的确诊方法是明确酶缺陷类型、检测到引起呼吸链酶复合物结构和功能缺陷的致病基因，但相关致病基因多至1000余个，基因诊断非常困难。Liang等曾对2000名怀疑为线粒体疾病患者的常见基因突变位点进行筛查，阳性率只有6%。Lebon等先通过呼吸链酶学测定确定呼吸链复合物Ⅰ活性缺陷患者，然后进行了编码复合物Ⅰ的线粒体基因序列分析，基因诊断阳性结果提高到20%。研究结果提示在线粒体呼吸链疾病的诊断中，基础检测应该建立在准确的呼吸链酶学诊断学分析的基础上。既往由于我国缺乏临床可行的线粒体呼吸链酶学诊断技术，仅极少数患者通过基因筛查、组织病理分析获得诊断，回顾分析我国线粒体病常见基因突变位点筛查阳性结果仅8.15%。因此，单纯采用基因筛查来获得明确诊断的方法在临床应用上存在相当的局限性，需要依靠线粒体呼吸链酶活性测定进行诊断。由于导致线粒体病产生的直接因素就是患者体内相关酶活性降低或完全缺失，而且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关，因此判断患者线粒体相关酶的活性是否正常，同时结合患者的临床症状表现，就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。可见线粒体相关酶尤其是线粒体呼吸链复合物酶活性检测作为线粒体病的诊断依据具有其他方法不能比拟的优势，临床上通过对疑似线粒体病的患者进行相关酶活性检测，可以实现早诊断、早治疗，对线粒体病预后，减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测线粒体相关酶活性是辅助确诊该病的最佳手段。 

呼吸链酶复合物是线粒体生物氧化功能的体现，酶复合物活性下降是诊断线粒体病的重要生化特征，也是研究和诊断疾病的另一个重要切入点。理想的呼吸链酶复合物活性检测标本是选用疾病受累明显的组织，例如脑、肾、心肌、肝和内分泌腺体，以获得足量的线粒体蛋白，但是这些组织很难取材，目前多选用骨骼肌或以外周血白细胞、皮肤成纤维细胞。曾有研究证实呼吸链酶复合物缺陷患者的皮肤成纤维细胞在体外培养时可能发生细胞呼吸链酶复合物活性不稳定，甚至活性转为正常，导致假阴性结果。肌肉组织标本不正确的冷冻储存也会导致线粒体呼吸链酶复合物活性迅速下降。而皮肤或骨骼肌活检均为创伤性检查，患儿及家长较难接受，正常值收集困难，临床推行皮肤或骨骼组织的呼吸链复合物酶活性测定难度很大。Chretien等研究报道在外周血白细胞被检出酶复合物活性缺陷的线粒体病患者中，有91%的患者同时被检测出骨骼肌酶复合物活性缺陷，说明外周白血细胞能较好地反映骨骼肌酶复合物活性。但是，由于外周血淋巴细胞中线粒体含量较少，提取线粒体及分离线粒体蛋白难度很大。 

国外研究证实线粒体呼吸链复合物I功能缺陷是导致线粒体病的主要原因，约占氧化磷酸化障碍性疾病的1/3。线粒体呼吸链复合物I（Complex I），确切的名称为线粒体NADH-Q还原酶（又称为NADH脱氢酶），它是线粒体呼吸链复合物中结构最大、最复杂的复合物，由45个不同的蛋白亚基组成。复合物I的功能是将电子从NADH传递给辅酶Q，在传递电子的同时向线粒体膜间隙释放2个质子，在内膜两侧形成质子梯度，将能量以电化学势能的形式储存在线粒体内膜上。复合物I的编码基因包括核基因和线粒体基因两种，其中线粒体基因编码复合物I的7个蛋白亚基，分别为ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6。这7个蛋白亚基共同参与组成复合物I的一部分结构，其中任意一个亚基功能异常均会导致线粒体病的发生，如LHON（Leber hereditary optic neuropathy）、MELAS（mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes syndrome）、AD-MT（Alzheimer disease mitochondrial）、LDYT（Leber hereditary optic neuropathy with dystonia）、LS（Leigh syndrome）、MT-C1D（mitochondrial complex I deficiency）等。 

但是但目前采用的线粒体呼吸链复合物I酶活性的检测方法都是比色法，即通过分光光度计检测线粒体呼吸链复合物的酶活性，这种方法的缺点是灵敏度低，准确度差，对样品的需求量大。与分光比色法相比，荧光法检测酶活具有蛋白用量少，检测灵敏度高，特异性高，准确度高的优点。 

基于这些技术背景和临床诊断的现实需求，我们一直在努力研究建立新的荧光法，以期更加灵敏的准确的检测样本中的线粒体呼吸链酶复合物I的活性，并取得了重要突破：我们发现：线粒体呼吸链酶复合物I（NADH-Q还原酶）在特定条件下能够将NADH中的电子转移给氧化型辅酶Q（CoQ）生成还原型辅酶Q，还原型CoQ进一步将电子转移给氧化型的荧光底物刃天青（Resazurin），生成还原型的染料分子试卤灵（Resorufin），而试卤灵（Resorufin）在530-580nm激发波长下可以产生560-620nm特异的荧光，这种荧光可以被荧光检测设备轻松捕捉信号，而且信号很稳定。这样就极大的提高了测试的灵敏度，不仅降低了对测试样本的量的需求，还大大地提高了测试的准确度，这一技术突破将大大改进我们之前建立的外周血白细胞线粒体呼吸链酶复合物活性测定技术平台和临床检测方法，为临床线粒体病临床及病因诊断进一步奠定坚实的技术基础，必将产生更好的社会效益。（相关成果已经申请了国家发明专利，申请号为201210125655.2）。 

在此基础上，最近我们进一步发现了呼吸链酶复合物I的一种新的催化反应的机制。众所周知，传统的观点认为呼吸链酶复合物I将其底物NADH的电子剥夺后向下传递时必须经过一个中间分子，即辅酶Q（CoQ），即电子先交给氧化型CoQ后生成还原型的CoQ；然后电子再从还原型的CoQ传递给下一个电子受体。而我们最近的实验发现，除了上述的经典机制模式，呼吸链酶复合物I也可以将NADH的电子不经过CoQ直接传递给一些特定的电子受体分子。这就是本发明的主要创新发现和技术基础。 

根据这一创新的新发现，本发明的线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）的酶活性的荧光法检测原理为：待测样本中的线粒体呼吸链复合物I可以将底物NADH的电子传递给氧化型荧光染料分子后生成还原型荧光染料分子，还原型荧光染料分子在特定的激发光下可发射特定波长的荧光，且线粒体呼吸链复合物I催化NADH与氧化型荧光染料分子反应的速率与还原型荧光分子发射的荧光强度成正比，这样就可以通过检测荧光强度的变化来计算待测样本中的线粒体呼吸链复合物I酶活力。显然采用本荧光法方法制备的测定试剂除了具有方便、快捷、信号稳定，干扰少，灵敏度高和准确度高的特点外，还可以省去将CoQ加入到检测的反应体系中的麻烦，便于推广应用。 

发明内容

本发明解决的技术问题是：提供一种快速、特异、准确可靠的线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶，NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）的酶活力的荧光检测法，同时本发明还提供用于荧光法测定线粒体呼吸链复合物I酶活性的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。 

本发明提供的是一种创新的线粒体呼吸链复合物I的检测方法和检测试剂，线粒体呼吸链复合物I就是NADH-Q还原酶，英文名称为NADH:ubiquinone reductase，其酶学的国际标准名称为EC1.6.5.3；也经常简称为复合物I。本发明的摘要，权利要求书和说明书中用到上述名称的任何一个都是相同意思的表达。 

为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下： 

本发明提供的是一种荧光法检测线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）的酶活性。这种线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）酶活性测定方法的原理如下：NADH-Q还原酶在特定条件下能够将NADH中的电子转移给氧化型电子受体R生成还原型的R；还原型的R在特定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光，因此在特定的条件下可检测到还原型R的荧光值变化，由于NADH-Q还原酶催化底物反应的速率与还原型R的生产量成正比，因此检测在特定波长下的还原型R的荧光值的变化，就可以计算出NADH-Q还原酶的酶活力。特殊情况下，这种还原型R同时还在特定的波长下具有特异的光吸收，因此也可检测在特定波长下的还原型R的吸光值的变化来计算出NADH-Q还原酶的酶活力，显然这种可见光的检测方法不如前述的荧光法那么灵敏，稳定，特异和准确。

上述反应原理也可以用以下反应方程式来简单表示： 

NADH + R（氧化型）NAD⁺ + R（还原型）

本发明提供的如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于：它是一种在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的分子或试剂，氧化型R被NADH-Q还原酶还原后产生还原型R。这类分子或试剂可以是目前已经存在且被普遍接受的，也可以是未来新合成或新发现的分子或试剂；由于这类试剂在本发明提供的方法和试剂中实际起到了一个被用于检测反应体系的变化强度的染料分子的作用，所以在本发明的摘要，权利要求书和说明书中又常会出现荧光染料分子，染料分子等名词来形容或表示符合权利要求书1-2所述的电子受体R。

本发明提供的如权利要求书1所述电子受体R，其特征在于：它是刃天青（Resazurin）或者是刃天青的盐类形式（如刃天青钠）。 

       

    

刃天青的结构式          试卤灵的结构式

在NADH-Q还原酶的催化作用下，底物NADH的电子被传递给了刃天青，刃天青得到电子后被还原为试卤灵（Resorufin），试卤灵是一种还原型荧光染料分子，用光学上通用的荧光检测设备可在530-580nm激发波长，560-620nm的发射波长（最适发射波长为590nm）下检测到特异的荧光。因此检测在560-620nm的还原型R的荧光值的变化，就可以根据权利要求书1所述的方法确定出NADH-Q还原酶的酶活力

此外，试卤灵在可见光下也具有特异的光吸收，最适检测波长为570nm，用一般的检测光吸收的设备可在570nm下检测到特异的吸光值。因此检测在570nm试卤灵的吸收光强的变化，也可以确定出NADH-Q还原酶的酶活力。

事实上，刃天青更常见的分子存在形式是其盐类物质或修饰物，如刃天青钠，刃天青钾等，这些刃天青的盐类或修饰物同样符合本发明的权利要求书所述的特征，因此，它们同样也是本发明权利要求书的涵盖内容。 

本发明权利要求书4提供的是一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据本发明的权利要求书1所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。 

本发明提供的如权利要求书4所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2或3所述的电子受体R，这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。 

本发明提供的如权利要求书4-5所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分还可以包括电子供体NADH，这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。NADH是NADH-Q还原酶的天然底物，在反应中主要是起一种电子供体的作用。 

本发明提供的如权利要求书4-5所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NADH-Q还原酶酶活性的试剂或分子。NADH-Q还原酶的特异酶活性可以通过计算NADH-Q还原酶的总活性（不加抑制剂得到的酶活力）与NADH-Q还原酶的非特异活性（加入一定浓度的抑制剂后得到的酶活力）的差值得到。这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。这种抑制剂包括但不限于以下实例：鱼藤酮、安密妥、安密妥钠盐。 

本发明提供的如权利要求书4-5所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括稳定剂。所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂（detergent），它的存在可以稳定NADH-Q还原酶的物化性质，利于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：Triton x-100、Tween20、NP40、Brij-35 

本发明提供的如权利要求书4-5所述的NADH-Q还原酶酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括缓冲试剂。所述缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂，它的存在可以有效的稳定NADH-Q还原酶的催化反应的pH值，并可以稳定NADH-Q还原酶的物化性质，从而利于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：

乙酸钠/乙酸：pH 2.6-5.8

柠檬酸/柠檬酸钠：pH 3.0-6.6

磷酸氢盐/柠檬酸（盐）：pH 2.2-8.0

磷酸盐：pH 4.9-8.2

柠檬酸/氢氧化钠/盐酸：pH 2.2-6.5

MES：pH5.5-6.7

MOPS：pH6.5-7.9

HEPES：pH6.8-8.2

Tris-盐酸：pH 7.1-8.9

硼酸-硼砂缓冲液：pH7.4-9.0

如权利要求书9所述，本发明还提供了一种检测NADH-Q还原酶活性的试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-8所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

   缓冲液                                       10—1000mmol/L

   pH范围                                      5.0—9.0

   稳定剂                                       0.01%—10%

   NADH                                       0.01—10mmol/L

   抑制剂                                       0—20mmol/L

   氧化型底物R                                 0.002—10mmol/L

这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性分析和检测。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双剂还是三剂，如下成分关系的本发明NADH-Q还原酶检测试剂较为理想： 

缓冲液                                     25 —100mmol/L

pH范围                                    6.5—8.0

稳定剂                                     0.1—0.5%

NADH                                     0.05—0.2mmol/L

抑制剂                                    0.001—0.01mmol/L

底物R                                     0.005—0.02mmol/L

本发明的NADH-Q还原酶酶活力检测试剂可以配成如下双剂试剂：                     试剂1

缓冲液，稳定剂，NADH，R

试剂2

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。

也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂： 

试剂1

缓冲液，稳定剂，NADH

试剂2

缓冲液，稳定剂，R

试剂3

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。

本发明提供的如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶酶活性检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析和检测各种待测样本中的NADH-Q还原酶的酶活力，特别是检测人体各种体液、组织或细胞样本中NADH-Q还原酶的酶活力。这些被检测的样本包括但不限于脑组织、肝组织、肌组织、白细胞、成纤维细胞，提取的线粒体、提取的各种纯度的NADH-Q还原酶样品等。 

本发明提供的如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶酶活性检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的NADH-Q还原酶的酶活力。 

本发明提供的如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶酶活性检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析、检测和诊断待测样本中的NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。从而可以广泛应用到临床检测或诊断与NADH-Q还原酶的酶活力相关的疾病。 

  

附图说明：

图1：猪心肌线粒体呼吸链复合物I纯品的酶动力学活性测定结果。1.猪心肌线粒体呼吸链复合物I的总酶活力的酶动力学曲线：反应体系中不添加鱼藤酮，曲线线性方程为：y=12.10x + 140.61 （R²=0.99）。2.猪心肌线粒体呼吸链复合物I非特异性活性的酶动力学曲线：反应体系中加入了浓度为0.02mmol/L的鱼藤酮。曲线线性方程为：y=2.04x +0.0805 （R²=0.9974）。

  

具体实施方式

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由本发明的权利要求书具体限定。 

实施例一    人血液白细胞中的线粒体提取 

取人全血2ml，向其中加入8ml裂解液（0.1mM EDTA），处理15min以破碎红细胞，3000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀即是白细胞，用生理盐水洗涤白细胞两次，3500rpm离心5min，弃上清，收集白细胞沉淀。向沉淀加入5ml细胞悬浮液（0.25M Sucrose, 5mM HEPES, 0.5mM EGTA, pH7.4）悬浮细胞，用玻璃匀浆器匀浆20次，匀浆液经1000g离心10分钟，弃沉淀，收集上清；上清于10000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀即为线粒体，线粒体可在-80℃条件下保存。

  

实施例二    猪心肌线粒体的提取

称取已剪除脂肪组织的猪心肌750g，加入2.25L的0.25M（内含0.01M，pH8磷酸缓冲液）的蔗糖溶液，分三次捣碎75秒，捣碎前加入适量6N KOH保持pH7.2-7.4，KD-70离心机以2600-2800rpm离心10分钟，用四层纱布过滤后，弃沉淀。上清在Beckman J2-21以1200rpm离心25分钟，所得沉淀即为线粒体，悬浮于0.25M（内含0.01M，pH8磷酸缓冲液）的蔗糖溶液中，线粒体可在-80℃条件下保存。

  

实施例三    猪心肌线粒体呼吸链复合物I的提取和纯化

将实施例二制得的猪心线粒体用0.25M蔗糖稀释到30mg/ml蛋白浓度后，在Beckman J2-21以2000rpm离心25分钟，弃上清。沉淀悬浮于TSH 缓冲液（50mM Tris pH8, 0.67M sucrose, 1mM Histidine）中，用TSH 缓冲液调整蛋白浓度至25mg/ml后，加入10% pH9脱氧胆酸钾至0.3mg/mg蛋白，以72g/L的量加入KCl固体，待KCl完全溶解，在Beckman L8-80超速离心机上以30000rpm离心30分钟，沉淀为绿色（含细胞色素氧化酶，可留作进一步提取此酶）。红色上清用0.25倍体积的预冷去离子水稀释，再在Beckman L8-80超速离心机上以30000rpm离心30分钟，弃褐绿色沉淀。上清用透析袋透析，透析缓冲液为8倍体积的10mM Tris pH8， 透析时间为3小时（此步目的是除去KCl和脱氧胆酸钾，使复合物I-III等不溶性蛋白沉淀下来，大多数细胞色素C和其他可溶性蛋白被留在溶液中）。透析结束后在Beckman L8-80超速离心机上以30000rpm离心75分钟，弃上清，红色沉淀悬浮于尽量少体积的TSH中（简称S1），-20℃保存过夜。

第二天，将S1解冻匀浆后用TSH稀释至蛋白浓度为10mg/ml，然后按0.5mg脱氧胆酸钾/mg蛋白的比例加入脱氧胆酸钾，再在每100ml蛋白溶液中加入16.5ml 50%的饱和乙酸铵。冰浴中搅拌15分钟后，用30000rpm离心30分钟，弃去紧密的灰褐色沉淀；然后按每100ml上清中加入6.4ml乙酸铵溶液，冰浴中搅拌15分钟后，用30000rpm离心30分钟，这次离心得到的沉淀上层是疏松的浅褐色，下层为紧密的褐色 ，（借助沉淀的颜色的可以判断乙酸铵加入量是否适当）。弃去沉淀，向每1ml上清中加入3.2ml乙酸铵溶液，冰浴中搅拌15分钟后，用30000rpm离心30分钟，红褐色沉淀即为NADH-细胞色素C氧化还原酶（NCR）。 

NCR用TSH稀释至20mg/ml，加入20%胆酸钠至0.4mg/mg蛋白，加入饱和硫酸铵至0.65ml/ml蛋白（即39.35%饱和度），冰浴中搅拌10分钟后，用30000rpm离心15分钟。紧密的沉淀溶解于TSH，调至10mg/ml，加入饱和硫酸铵至0.56ml/ml蛋白（即35.9%饱和度），冰浴中搅拌10分钟后，用30000rpm离心15分钟，弃上清，用TSH冲洗下沉淀，将沉淀悬浮于TSH中，此即为线粒体复合物I的纯品，-80度保存备用。 

  

实施例四   猪心肌线粒体呼吸链复合物I纯品的活性测定（酶动力学法）

本实施例的线粒体呼吸链复合物I检测试剂为双剂试剂，包括

试剂1

磷酸缓冲液（pH7.2）                          50mmol/L

Tween 20                                      0.1%

    NADH                                       0.1mmol/L

刃天青钠                                     0.01mmol/L

试剂2

    鱼藤酮                                       0.02mmol/L

被测样品是实施例（三）中所提纯的猪心肌线粒体呼吸链复合物I纯品，酶复合物I用量为3ug，反应体系总体积为200ul。本检测方法采用酶动力学法检测线粒体呼吸链复合物I酶活性。

总活性测定：将试剂1提前置于30℃环境中温浴3分钟，然后将试剂1加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm，30度条件下进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描590nm下荧光值的变化，扫描时间为180秒，记录曲线变化，计算反应的斜率（见图1所示）。 

非特异活性测定：将试剂1与试剂2提前混合均匀后置于30℃环境中温浴3分钟，然后将试剂混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm，30度条件下进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描590nm下荧光值的变化，扫描时间为180秒，记录曲线变化，计算反应的斜率（见图1所示）。线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）的酶活力可以从反应曲线的斜率的大小变化就可以看出来，我们给的酶活力单位为：每分钟每克蛋白转化底物的纳摩尔数。根据试卤灵标准曲线（y=11835x，R²=0.9997，其中x表示试卤灵的浓度，单位是uM，y表示荧光值，用FLU表示）可以将计算得到的复合物I的特异荧光值转化成产物试卤灵的浓度，根据蛋白用量和反应时间可计算NADH-Q还原酶的酶活力。 

线粒体呼吸链复合物I特异性酶活力=总的酶活力—非特异性酶活力 

从我们测定的结果发现，提取的猪心肌线粒体呼吸链复合物I纯品的酶活力很高（达到5440nmol/min/g），而且加入复合物I的特异抑制剂鱼藤酮后得到的非特异酶活力只有845nmol/min/g，这也说明了本发明提供的方法是一种专一、特异的线粒体呼吸链复合物I酶活力测定方法。

 

实施例五   人血白细胞线粒体呼吸链复合物I活性测定（荧光终点法）

本实施例的线粒体呼吸链复合物I检测试剂为双剂试剂，包括

试剂1

磷酸缓冲液（pH7.2）                          50mmol/L

Tween 20                                      0.1%

    NADH                                       0.1mmol/L

刃天青钠                                     0.01mmol/L

试剂2

    鱼藤酮                                       0.02mmol/L

被测样品为10例健康志愿者的人白细胞中线粒体，经破碎处理后，反应体系中总蛋白用量为25ug，反应体系为250ul。。本检测方法采用终点法检测线粒体呼吸链复合物I酶活性。

总活性测定：将试剂1与线粒体蛋白混合后置于30℃环境中温浴30分钟，然后将反应终止，取终止后的混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm条件下检测产物的荧光值，记为F_总。 

非特异活性测定：将试剂1与试剂2、线粒体蛋白混合均匀后置于30℃环境中温浴30分钟，然后将反应终止，取终止后的混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm条件下检测产物的荧光值，记为F_非。 

检测试剂1空白荧光读值平均为650，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测30分钟测定复合物I总活性，总活性荧光读值（扣除试剂空白）为5280，试剂1与试剂2混合后的空白荧光读值平均为990，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测30分钟测定复合物I的非特异活性，非特异活性的荧光读值（扣除试剂空白）为1671（见表1所示）。 

复合物I的特异活性荧光值=F_总- F_非。 

我们给的酶活力单位为：每分钟每克蛋白转化底物的纳摩尔数，用nmol/min/g蛋白表示。根据试卤灵标准曲线（y=11558x+420.82，R²=0.9994，其中x表示试卤灵的浓度，单位是uM，y表示荧光值，用FLU表示）可以将计算得到的复合物I的特异荧光值转化成产物试卤灵的浓度，并根据蛋白用量和反应时间可计算NADH-Q还原酶的酶活力。 

  

表1  线粒体呼吸链复合物I总活性与非特异性活性检测结果

     实验结果表明，本发明的检测线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的线粒体呼吸链复合物I酶活力且测定稳定（n=3，CV<5%），可应用于临床检测与线粒体呼吸链复合物I酶活力异常相关的疾病。

 

实施例六    人白细胞中线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）活性检测应用于线粒体病的诊断

以经基因分析已确诊的线粒体呼吸链复合物I、III、IV、V缺陷病例的志愿者为分析对象，以健康志愿者为对照，采用实施例一和五所描述的方法，提取这些志愿者的外周血白细胞中的线粒体后，对上述样品进行复合物I酶活力的测定，每个样本分别进行5次独立的酶活性测定实验，结果显示：样本的酶活力测定实验结果稳定（CV值均小于5%），其中复合物I患者酶活力只有对照组的50~60%，而复合物III、IV患者和复合物V患者的复合物I活性正常（见表2），这一结果与基因分析的结论相吻合。可见本发明提供的NADH-Q还原酶活性检测方法和试剂稳定、特异、可靠，可应用于临床检测与NADH-Q还原酶酶活力异常相关的疾病。

  

表2  线粒体呼吸链复合物I活性检测结果

总之，实践证明，采用本发明的检测线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）酶活力的方法和试剂完全可以通过一般的荧光检测设备检测得出所需的测定结果，并且灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于临床检测与线粒体呼吸链复合物I酶活力异常相关的疾病。

  

参考文献

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Claims (1)

1.一种线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶）活性测定方法，其特征在于它的原理如下：

NADH-Q还原酶在特定条件下能够将NADH中的电子转移给氧化型电子受体R生成还原型的R；还原型的R在特定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光，因此在特定的条件下可检测到还原型R的荧光值，由于NADH-Q还原酶催化底物反应的速率与还原型R的生产量成正比，因此检测还原型R的荧光值的变化，就可以计算出NADH-Q还原酶的酶活力。

2. 如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于：它是一种在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的分子或试剂，氧化型R被NADH-Q还原酶还原后产生还原型R，还原型R可以在特定激发光条件下发射出特异的荧光。

3. 如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于，它是刃天青（Resazurin），它的结构式为：

刃天青被还原后的产物是试卤灵（Resorufin），试卤灵在530-580nm激发波长下，可以发射波长为560-620nm的荧光。

4. 一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书1所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

5. 如权利要求书4所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2或3所述的电子受体R，这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

6. 如权利要求书4-5所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分还可以包括电子供体NADH，这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

7. 如权利要求书4-6所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NADH-Q还原酶酶活力的试剂或分子。

8. 如权利要求书4-6所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂。

9. 一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-8所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

   如权利要求书8所述的缓冲液                   10—1000mmol/L

   pH范围                                             5.0—9.0

   如权利要求书8所述的稳定剂                      0.01%—10%

   NADH                                        0.01—10mmol/L

   如权利要求书7所述的抑制剂                      0—20mmol/L

   如权利要求书1-3所述的电子受体R              0.002—10mmol/L

这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性分析和检测。

10. 根据权利要求9所述NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、NADH、抑制剂、R组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、NADH、R组成；试剂2，由抑制剂组成。

11. 根据权利要求9所述NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、NADH、抑制剂、R组成组成三剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、NADH组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、R组成；试剂3，由抑制剂组成。

12. 如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的NADH-Q还原酶的酶活力。

13. 如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测人体的各种体液、组织和细胞样本中的NADH-Q还原酶的酶活力。

14. 如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的NADH-Q还原酶的酶活力。

15. 如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。

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