CN112980790A - 一种氧化磷酸化通路缺陷的dba细胞模型及其构建方法 - Google Patents

一种氧化磷酸化通路缺陷的dba细胞模型及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法，属于细胞模型构造技术领域。该构建方法包括在红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路的步骤。具体包括以下步骤：对HPCs进行扩增培养；对步骤(1)所得细胞向红系方向进行定向诱导分化，在分化体系中加入氧化磷酸化通路抑制剂，连续培养，即获得所述氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型。本发明所建立的DBA细胞模型可用于进一步挖掘DBA的其他遗传学异常。该模型不需要实验动物参与，成本低、操作简便、建模周期短、可重复性高，可以简单快速开展相关实验研究，以及分析药物的治疗贫血功效，有利于贫血药物的研发。

Description

一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法
技术领域
本发明属于细胞模型构造技术领域，具体涉及一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法。
背景技术
先天性纯红细胞再生障碍性贫血(Diamond-Blackfan anemia，DBA)是一种罕见的以红系造血衰竭为特点的先天性骨髓衰竭综合征。红细胞发育不良是患者主要的血液学特征，主要表现为大红细胞贫血、红系祖细胞减少、网织红细胞减少、部分患者红细胞内腺苷脱氨酸酶明显上升、血清促红细胞生成素升高等特征。此外，还有约50％的患者伴有不同程度的身材矮小、颅面畸形等身体缺陷，并伴有恶性肿瘤易感性增高的风险。临床上，糖皮质激素治疗是该疾病的首选治疗方案，其他可行的治疗方案还有输血。造血干细胞移植是当前唯一可以治愈DBA的治疗手段，但寻找合适的配型仍有相当大的难度。现在最主要的临床问题是，不同的DBA患者对糖皮质激素(比如泼尼松)的敏感程度差异很大，部分患者需要持续用药，而部分患者对药物完全没有反应，且部分患者长时间用药后易于出现感染并发症和铁过载的问题，这可能是由于不同致病因素的DBA患者间的异质性决定的。
DBA的发病主要与核糖体蛋白(Ribosomal Proteins，RPs)基因的杂合突变或大片段缺失有关，DBA也被成为核糖体疾病。在DBA中核糖体蛋白基因的杂合突变导致其基因单一拷贝丧失功能，突变的核糖体蛋白不能聚集在核糖体的任何特定区域。单倍体剂量不足或RPs表达水平的降低，导致了核糖体亚基合成及核糖体RNA前体加工的异常。p53通路的激活是主要的DBA病理机制之一。由于RPs基因的突变，DBA细胞中核糖体生物合成异常并导致了Rpl5和Rpl11的释放并结合到MDM2上，由于MDM2是p53的负调控物，从而激活p53活性。由于红系祖细胞对p53激活高度敏感，导致了细胞周期停滞与凋亡，并最终导致红系造血失败。除p53通路外，Heme合成通路也与DBA有关。DBA病理条件下，Heme生物合成速度快于珠蛋白翻译起始速度，过量的Heme和活性氧导致了珠蛋白合成及红系祖细胞减少。通过添加Heme生物合成的抑制剂琥珀酰丙酮减缓其合成速度，红系造血缺陷表型明显改善。mTOR通路被指参与调控了DBA中mRNA翻译过程。利用全基因组或外显子组测序鉴定新的DBA致病基因是该领域的一个重要研究方向，但仍有约35％的DBA患者尚未检测到相关的遗传学异常。因此，寻找其他作用途径进一步挖掘DBA的遗传学异常以及精准用药是当前缓解临床问题的研究重点。
目前，已有不少研究利用不同的细胞与动物模型对因RPS缺陷导致的致病机理进行研究。比如，通过构建RPS19敲除的脐血CD34+的细胞模型，Elena Bibikova等发现RPS19缺失导致GATA1的显著降低，通过抑制TNFα后GATA1的水平部分恢复，红系造血缺陷表型得以改善，发现了RPS19通过GATA1调控红系造血的分子机制；利用小鼠成红细胞模型，Rastislav Horos等也鉴定了对Rps19突变敏感的翻译起始转录本Bag1和Csde1，并验证了其特异性调控红细胞分化的功能；动物模型方面，也是针对RPS缺陷的小鼠模型或斑马鱼模型，如最早构建的Rps19纯合突变小鼠、以及利用转基因技术构建可诱导RPS19缺失的小鼠等，来模拟人类的DBA疾病表型。
以上模型无论是细胞模型还是动物模型，均是针对RPS基因进行研究，提供的信息有限。尚未有模型是针对线粒体氧化磷酸化通路进行构建的，现阶段有关模型仍然单一匮乏，有鉴于此，本发明建立因氧化磷酸化通路异常而导致DBA发生的细胞或动物模型，以模拟DBA的病理特征。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法，以氧化磷酸化通路为切入点来构建线粒体氧化磷酸化缺陷的DBA模型，该模型可用在治疗贫血药物功效评价，用于进一步挖掘DBA的遗传学异常以及寻找新的治疗药物。
为实现上述发明目的，本申请技术方案如下：
名词解释：
DBA：先天性纯红细胞再生障碍性贫血
HPCs：人原代造血干/祖细胞
OXPHOS：氧化磷酸化
ROT：鱼藤酮
首先，本发明提供一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型的构建方法，包括在红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路的步骤，所述模型为具有氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型。
优选的，包括以下步骤：
(1)对HPCs(人原代造血干/祖细胞)进行扩增培养；
(2)对步骤(1)所得细胞向红系方向进行定向诱导分化，在分化体系中加入氧化磷酸化通路抑制剂，连续培养，即获得所述DBA氧化磷酸化模型。
优选的，所述HPCs的来源选自人脐血、骨髓、外周血中的至少一种。
优选的，步骤(1)中所述扩增培养在增殖培养基中进行，所述的增殖培养基为含有SCF、Flt3 Ligand、TPO和双抗的SFEM II培养基，细胞密度为5×104-1×105个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，3-4天更换次培养基；增殖3-7天，进一步优选为7天。
优选的，步骤(2)中，所述定向诱导分化在分化培养基中进行，所述的分化培养基为含有SCF、IL3、EPO和双抗的SFEM II培养基，细胞密度为5×104-1×105个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，其中3-4天更换次培养基，分化3-7天，进一步优选为7天。
优选的，步骤(2)中，所述氧化磷酸化通路抑制剂选自鱼藤酮、安密妥、抗霉素A、氰化物、CO、叠氮化物(N3-)、寡霉素等中的至少一种，进一步优选为鱼藤酮。
优选的，步骤(2)中，所述氧化磷酸化通路抑制剂是作为线粒体氧化磷酸化通路的抑制剂，用量为0.5-2μmol/L，进一步优选为1μmol/L；给药时间3-7天，进一步优选为7天。
其次，本发明提供根据上述方法制备得到的氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型。
再者，本发明提供一种红系再生障碍模型的构建方法，包括在红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路的步骤。
再者，本发明提供所述氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型在DBA机制研究和/或治疗药物的功效评价中的应用。
再者，本发明提供鱼藤酮在构建红系再生障碍模型、氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型中的应用，所述应用是通过将鱼藤酮加入红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路实现。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所建立的氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型可用于进一步挖掘DBA的其他遗传学异常，以及寻找并筛选新的治疗药物。该模型不需要实验动物参与，成本低、操作简便、建模周期短、可重复性高。可以简单快速开展相关实验研究，以及分析药物的治疗贫血功效，对于开展治疗贫血药物的研究与开发意义重大。
附图说明
图1为DBA病人转录组数据图；
图2为不同剂量(0、0.5μM)的ROT(鱼藤酮)对氧化磷酸化通路的抑制作用图；
图3为不同剂量(1、2μM)的ROT(鱼藤酮)对氧化磷酸化通路的抑制作用图；
图4为不同时长(0、24h)的ROT(鱼藤酮)对氧化磷酸化通路的抑制作用图；
图5为不同时长(48、72h)的ROT(鱼藤酮)对氧化磷酸化通路的抑制作用图；
图6为氧化磷酸化通路缺陷对红系发育的影响图；
图7为氧化磷酸化通路缺陷特异性抑制红系分化图；
图8为氧化磷酸化通路缺陷对已知DBA患者核糖体致病基因表达的影响图；
图9为对照组和Rot组氧化磷酸化通路抑制作用图；
图10为阳性药物CoQ10对细胞模型在一定程度上缓解氧化磷酸化通路抑制作用图；
图11为阳性药物CoQ10对细胞模型可在一定程度上缓解红系分化障碍图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、实验细胞：人脐血HPCs，取自北京妇产医院。
2、实验试剂：
培养基StemSpan SFEM II，购自美国StemCell公司；
细胞因子SCF、TPO、Flt-3 Ligand、IL-3、EPO购自美国PeproTech公司；
链霉素和青霉素购自烟台赛尔斯生物科技有限公司；
Rotenone(鱼藤酮)购自上海麦克林生化科技有限公司；
CoQ10购自上海阿卡丁生化科技有限公司；
流式抗体APC conjugated anti-CD235a、PE conjugated anti-CD71购自德国Miltenyi Biotec公司；
MethoCultTM人造血干细胞甲基纤维素培养基购自美国StemCell公司；
罗丹明123购自美国Sigma公司。
3、造模细胞的培养：
(1)HPCs(CD34+)先增殖培养7天：在增殖培养基中进行，所述的增殖培养基为含有50ng/ml SCF、50ng/ml Flt3 Ligand、50ng/ml TPO和2％双抗的SFEM II培养基，细胞密度为5×104个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，3-4天更换培养基，增殖7天。
(2)定向红系诱导分化培养：在分化培养基中进行，所述的分化培养基为含有10ng/ml SCF、10ng/ml IL3、3U/ml EPO和2％双抗的SFEM II培养基，细胞密度为5×104个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，其中3-4天更换培养基，分化7天。模型组额外在分化培养基体系中加入0.5-2μM的ROT，放入培养箱中静置培养3-7天。
培养箱：37℃、5％(V/V)CO2。
图1为DBA病人转录组数据，由图1可以看出线粒体氧化磷酸化信号通路明显失调。
实施例1
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：实验设空白对照组和模型组。
模型组：(1)HPCs(CD34+)先增殖培养7天：在增殖培养基中进行，所述的增殖培养基为含有50ng/ml SCF、50ng/ml Flt3 Ligand、50ng/ml TPO和2％双抗的SFEM II培养基，细胞密度为5×104个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，3-4天更换次培养基，增殖7天。
(2)定向红系诱导分化培养：在分化培养基中进行，所述的分化培养基为含有10ng/ml SCF、10ng/ml IL3、3U/ml EPO和2％双抗的SFEM II培养基，取增殖后HPCs(CD34+)细胞，将细胞浓度调整为5×104个/mL于分化培养基中，接种于10cm培养皿中，加入0.5μM/LROT(鱼藤酮)，置于细胞培养箱中，3-4天更换次培养基，分化7天，得到OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型。
空白对照组：不加ROT(鱼藤酮)，其余条件和模型组一样。
取该DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制程度，如图2所示，可知模型组通路抑制程度明显高于空白组。
实施例2
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：
与实施例1模型组不同的是，实施例2在步骤(2)中加入1μM/L ROT(鱼藤酮)，其余皆相同。
取该DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制程度，由图3可知，模型组通路抑制程度进一步提高。
实施例3
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：
与实施例1模型组不同的是，实施例3在步骤(2)中加入2μM/L ROT(鱼藤酮)，其余皆相同。
取该DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制程度。由图3可知模型组通路抑制程度很高。显示Rot对OXPHOS抑制的剂量依赖性。
实施例4
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：实验设空白对照组和模型组。
模型组：与实施例2模型组不同的是，实施例4在步骤(2)中分化24h，其余皆相同。
空白对照组：不加ROT(鱼藤酮)，其余条件和模型组一样。
取该DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制程度。由图4可知，模型组通路抑制程度明显高于空白组。
实施例5
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：
与实施例2模型组不同的是，实施例5在步骤(2)中分化48h，其余皆相同。
取DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制程度。由图5可知，模型组通路抑制程度进一步提高。
实施例6
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：
与实施例2模型组不同的是，实施例5在步骤(2)中分化72h，其余皆相同。
取DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制程度。由图5可知，模型组通路抑制程度很高，显示Rot对OXPHOS抑制的时间依赖性。
实施例7
一种OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型的构建：实验设空白对照组和模型组。
模型组：同实施例2。
空白对照组：不加ROT(鱼藤酮)，其余条件和模型组一样。
取该DBA模型中的部分细胞，用流式抗体APC conjugated anti-CD235a和PEconjugated anti-CD71检测红系发育抑制程度，结果如图6所示，模型组红系发育抑制程度明显高于空白组；
取该DBA模型中的部分细胞，用0.5ml thoCultTM人造血干细胞甲基纤维素培养基与50μL细胞悬液混合，看细胞集落情况并统计，结果如图7所示，模型组特异性抑制红系分化。
取该DBA模型中的部分细胞，用RT-qPCR检测已知DBA患者核糖体致病基因表达情况结果如图8所示，可知模型组DBA核糖体致病基因表达整体低于空白组。
实施例8
实验设为空白对照组，模型组，阳性药物组。
模型组：(1)HPCs(CD34+)先增殖培养7天：在增殖培养基中进行，所述的增殖培养基为含有50ng/ml SCF、50ng/ml Flt3 Ligand、50ng/ml TPO和2％双抗的SFEM II培养基，细胞密度为5×104个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，3-4天更换次培养基，增殖7天。
(2)定向红系诱导分化培养：在分化培养基中进行，所述的分化培养基为含有10ng/ml SCF、10ng/ml IL3、3U/ml EPO和2％双抗的SFEM II培养基，取增殖后HPCs(CD34+)细胞，将细胞浓度调整为5×104个/mL于分化培养基中，接种于10cm培养皿中，在细胞培养箱中培养72h，然后加入1μM/L ROT(鱼藤酮)再培养24h，得到OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型。
空白对照组：不加ROT(鱼藤酮)，其余条件和模型组一样。
阳性药物组1：与模型组不同的是，加入1μM/L ROT(鱼藤酮)再培养24h后，再加入25μM/L CoQ10继续培养72小时，得到OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型，其余条件和模型组一样。
阳性药物组2：与模型组不同的是，加入1μM/L ROT(鱼藤酮)再培养24h后，再加入50μM/L CoQ10继续培养72小时，得到OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型，其余条件和模型组一样。
取该DBA模型中的部分细胞，用罗丹明123检测氧化磷酸化通路抑制的恢复程度。由图9-10可知阳性药物组1、2通路抑制程度均显著低于模型组，可明显缓解ROT的抑制作用。
实施例9
实验设为空白对照组，模型组，阳性药物组。
模型组：同实施例6。
空白对照组：不加ROT(鱼藤酮)，其余条件和模型组一样。
阳性药物组：与模型组不同的是，1μM/L ROT(鱼藤酮)培养72h后，再加入25μM/LCoQ10继续培养72小时，得到OXPHOS通路缺陷的DBA细胞模型，其余条件和模型组一样。
取该DBA模型中的部分细胞，用流式抗体APC conjugated anti-CD235a和PEconjugated anti-CD71检测红系发育抑制的恢复程度。由图11可知阳性药物组红系发育抑制程度均显著低于模型组，可明显缓解ROT的抑制作用。
上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型的构建方法，其特征在于，包括在红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路的步骤，所述模型为具有氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对HPCs进行扩增培养；
(2)对步骤(1)所得细胞向红系方向进行定向诱导分化，在分化体系中加入氧化磷酸化通路抑制剂，连续培养，即获得所述DBA氧化磷酸化模型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HPCs的来源选自人脐血、骨髓、外周血中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增培养具体为：在增殖培养基中进行，所述的增殖培养基为含有SCF、Flt3 Ligand、TPO和双抗的SFEMII培养基，细胞密度为5×104-1×105个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，3-4天更换次培养基，增殖3-7天，进一步优选为7天；
步骤(2)中，所述定向诱导分化具体为：在分化培养基中进行，所述的分化培养基为含有SCF、IL3、EPO和双抗的SFEMII培养基，细胞密度为5×104-1×105个/mL，接种于孔板中，置于细胞培养箱培养，其中3-4天更换次培养基；分化3-7天，进一步优选为7天。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氧化磷酸化通路抑制剂选自鱼藤酮、安密妥、抗霉素A、氰化物、CO、叠氮化物(N3-)、寡霉素等中的至少一种，进一步优选为鱼藤酮。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氧化磷酸化通路抑制剂用量为0.5-2μmol/L，进一步优选为1μmol/L；给药时间3-7天，进一步优选为7天。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备得到的氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型。
8.一种红系再生障碍模型的构建方法，包括在红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路的步骤。
9.权利要求7所述的氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型在DBA机制研究和/或治疗药物的功效评价中的应用。
10.鱼藤酮在构建红系再生障碍模型和/或氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型中的应用，其特征在于，所述应用是通过将鱼藤酮加入红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路实现的。
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