CN111607567B - 巴弗洛霉素a1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中的应用 - Google Patents

巴弗洛霉素a1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了巴弗洛霉素A1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中的应用，并且该巴弗洛霉素A1有望应用于制备治疗急性B淋巴白血病的药物中。使没有完全分化的白血病细胞正向分化为成熟血细胞的诱导分化策略已成功地应用于儿童早幼粒白血病治疗。本发明首次采用天然化合物巴弗洛霉素A1诱导白血病细胞逆编程为造血干祖细胞，这是一项不同于以往思路、反其道而行之的原创性探索。这对于制备治疗急性B淋巴白血病的药物，探索白血病治疗新路径，具有重要意义。未来有可能通过此途径，拓展并优化白血病的临床疗法，优化后的免疫治疗方案则有望在未来降低治疗风险，提高治愈率。

Description

巴弗洛霉素A1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细 胞中的应用
技术领域
本发明属于医学领域，涉及一种巴弗洛霉素A1的新应用，具体涉及巴弗洛霉素A1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中的应用。
背景技术
急性B淋巴细胞白血病(B-cellAcute Lymphoblastic Leukemia， B-ALL)是指前体或者成熟B淋巴细胞发生克隆性异常增殖所致的恶性疾病。B-ALL对化疗药物敏感，但化疗药物同时也杀死正常功能血细胞，极易发生粒细胞缺乏而导致重症感染，同时降低患者的免疫能力，使感染进一步加重，继而危及生命。造血干细胞移植是目前治疗白血病的最有效手段，但缺乏合适供体、预处理方案的毒副反应等因素限制了造血干细胞移植在大多数患者治疗中的应用，而且移植物抗宿主病(GVHD)、移植后复发、感染等因素也极大的影响了移植后患者的长期生存。
近年来，临床试验结果证明通过靶向CD19，CD20或CD30的 CAR-T细胞对B-ALL是有疗效的，CAR-T细胞治疗B-ALL也取得重大突破。尽管CAR-T细胞治疗为部分晚期肿瘤患者带来治愈的希望，但CAR-T在治疗过程中也存在明显的副作用：①既攻击异常的B细胞，也攻击正常的B细胞，可能导致B细胞不能正常产生抗体而发生感染致死，也可能引起细胞因子异常释放和严重过敏反应而死亡；②而基于抑制免疫检控点的免疫疗法因可诱发过度免疫反应或自身免疫反应也具有严重的治疗风险。当然，不断优化的免疫治疗方案有望在未来降低治疗风险。
2006年，Yamanaka等研究者使用与调控胚胎干细胞多能性密切相关的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子，成功将小鼠胚胎成纤维细胞和成体成纤维细胞诱导为多潜能干细胞，并称其为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。诱导性多能干细胞避免了伦理问题和免疫排斥问题，这一发现为肿瘤逆编程疗法的尝试提供了启示。2007年，Jaenisch实验室将iPSC技术应用于镰刀型贫血的小鼠模型的治疗上，提出用iPSC治疗单基因遗传疾病。2009年，高绍荣课题组将这一策略应用于地中海贫血症患者来源的细胞，获得病人特异的功能恢复的造血细胞。在白血病逆分化方面，Carette等(2010)、Kumano等(2012)、程涛课题组(2014)在白血病细胞中尝试通过导入Yamanaka四个转录因子获得iPSC，但这些iPSC会诱发白血病。这些研究对于白血病治疗是一项重要的探索，但也提示，用Yamanaka四个转录因子可能无法使白血病细胞逆编程为正常的造血干细胞。
iPSC技术一直受困于逆编程方法的安全隐患和低效率两大难题，不能真正用于临床治疗。目前使用最为广泛的通过病毒载体将因子(Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc)随机整合入体细胞基因组获得iPSC 的方法仍存在缺陷。逆转录病毒与转录因子本身都存在风险，尤其是c-Myc，在约70％的人类肿瘤细胞中都可检测到其表达，故在应用中存在肿瘤发生的可能。Nakagawa等研究表明，使用包括c-Myc 在内的四种因子诱导MEF细胞时，得到的嵌合体小鼠有15％会出现肿瘤。
近年来，iPSC技术发展迅速，科学家进行了大量尝试，影响基因组稳定性的逆转录病毒可以用腺病毒、瞬时表达质粒甚至mRNA 或重组蛋白来代替，一些逆编程因子也不断被发现可以被化学小分子所取代。2013年邓宏魁研究团队使用小分子化合物成功地诱导小鼠体细胞逆分化为多潜能干细胞。这种由化合物诱导得到的iPSC，被称为化合物诱导性多能干细胞(chemical induced pluripotent stem cell)，简称CiPSC。这种新方法没有引入任何外源基因，解决了转录因子诱导iPSC的安全问题，不仅能提高逆分化的效率或替代某些转录因子，还能帮助我们探究逆编程的机制。但是，CiPSC诱导逆编程成功尚局限于小鼠正常体细胞，而不是癌细胞。
综上，研发高效、低毒无毒药物，克服原发性和继发性耐药，探索新的防治方案，提高包括B-ALL在内的各种白血病治愈率仍是血液肿瘤研究者面临的重要课题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种巴弗洛霉素A1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中的应用。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
本发明公开了巴弗洛霉素A1的一种新应用，即巴弗洛霉素A1 可以用于在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞，且用于非疾病治疗目的。
进一步的，巴弗洛霉素A1可以用于制备治疗急性B淋巴白血病的药物。
本发明所述的巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1，简称Baf-A1) 源自灰色链霉菌，是大环内酯类抗生素家族中的一员，其化学式为 C35H58O9，其分子结构式如下：
Figure GDA0003560298410000041
Baf-A1对细菌、酵母菌、真菌、线虫、昆虫和肿瘤细胞系等具有广泛的生物活性，还具有一定的免疫抑制作用。中高浓度(10-100 nM)的Baf-A1常被用作自噬后期抑制剂，抑制自噬溶酶体的形成。
本发明的发明人利用Baf-A1处理B-ALL细胞株和患者原代细胞后，发现残留的细胞均表达造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)特有的表面标志(CD34+CD38-Flt3+CD117+)，并表达造血干细胞特异性转录因子，细胞周期检测发现G0期细胞明显增多(干细胞的特性之一是保持静息态)。
本发明的发明人运用经典的凋亡诱导剂喜树碱(Camptothecin, CPT)，与Baf-A1分别处理B-ALL细胞，发现尽管两者都能诱导 B-ALL细胞凋亡，但只有Baf-A1能够特异性诱导B-ALL细胞HSC 标志表达增加，而CPT则不能；类似地，又发现Baf-A1能够特异性诱导B-ALL细胞G0期细胞比例增加，而CPT则不能。
这一结果证明Baf-A1诱导B-ALL细胞HSC标志表达增加、 G0期细胞比例增加，不是源于不表达干细胞标志的细胞凋亡。更重要的是，诱导人B-ALL细胞逆编程的造血干祖细胞移植到 NOD-SCID小鼠后，小鼠未出现白血病相关表型。
以上结果提示：Baf-A1诱导B-ALL白血病细胞逆编程为造血干祖细胞。从而足以证明，Baf-A1可以在诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中得以应用，同时Baf-A1有望在制备治疗急性B 淋巴白血病的药物中得以应用。
本发明的有益效果为：
使没有完全分化的白血病细胞正向分化为成熟血细胞的诱导分化策略已成功地应用于儿童早幼粒白血病治疗。本发明首次采用天然化合物Baf-A1诱导白血病细胞逆编程为造血干祖细胞，是一项不同于以往思路、反其道而行之的原创性探索。这对于制备治疗急性 B淋巴白血病的药物，探索白血病治疗新路径，具有重要意义。未来有可能通过此途径，拓展并优化白血病的临床疗法，优化后的免疫治疗方案则有望在未来降低治疗风险，提高治愈率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明研究Baf-A1诱导B-ALL细胞表达造血干细胞表面标志的实验结果图，其中，
图1A表示Baf-A1诱导B-ALL细胞系表达造血干细胞表面标志的结果图；
图1B表示Baf-A1诱导B-ALL患者白血病细胞表达造血干细胞表面标志的结果图；
图1C表示Baf-A1不诱导正常B细胞表达造血干细胞表面标志的结果图；
图1D表示Baf-A1与凋亡诱导剂CPT均能有效诱导B-ALL 697 细胞发生凋亡的结果图；
图1E表示CPT不诱导B-ALL细胞表达造血干细胞特有的表面标志的结果图。
图2为本发明研究造Baf-A1诱导B-ALL细胞周期阻滞于G0 期的实验结果图，其中，
图2A表示Baf-A1诱导B-ALL细胞周期阻滞于G0/G1期的结果图；
图2B表示Baf-A1通过调节细胞周期关键调节蛋白减缓B-ALL 细胞周期进程的结果图；
图2C表示Baf-A1诱导B-ALL细胞周期阻滞于G0期的结果图；
图2D表示CPT不影响B-ALL细胞G0期变化的结果图。
图3为本发明研究Baf-A1诱导B-ALL细胞表达造血干细胞特异性转录因子的实验结果图。
图4为本发明研究Baf-A1诱导B-ALL细胞逆编程的造血干祖细胞样细胞移植NOD-SCID小鼠后不产生白血病表型的实验结果图，其中，
图4a表示Nalm-6-GFP细胞系的鉴定结果图；
图4b表示各组小鼠的脾脏肿胀情况的结果图；
图4c表示骨髓中GFP阳性细胞比例的结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明公开了巴弗洛霉素A1的一种新应用，即巴弗洛霉素A1 可以用于在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞，且用于非疾病治疗目的。
进一步的，巴弗洛霉素A1可以用于制备治疗急性B淋巴白血病的药物。
本发明所述的巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1，简称Baf-A1) 源自灰色链霉菌，是大环内酯类抗生素家族中的一员，其化学式为 C35H58O9，其分子结构式如下：
Figure GDA0003560298410000071
Baf-A1对细菌、酵母菌、真菌、线虫、昆虫和肿瘤细胞系等具有广泛的生物活性，还具有一定的免疫抑制作用。中高浓度(10-100 nM)的Baf-A1常被用作自噬后期抑制剂，抑制自噬溶酶体的形成。
本发明的发明人利用Baf-A1处理B-ALL细胞株和患者原代细胞后，发现残留的细胞均表达造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)特有的表面标志(CD34+CD38-Flt3+CD117+)，并表达造血干细胞特异性转录因子，细胞周期检测发现G0期细胞明显增多(干细胞的特性之一是保持静息态)。
同时本发明的发明人运用经典的凋亡诱导剂喜树碱(Camptothecin,CPT)，与Baf-A1分别处理B-ALL细胞，发现尽管两者都能诱导B-ALL细胞凋亡，但只有Baf-A1能够特异性诱导 B-ALL细胞HSC标志表达增加，而CPT则不能；类似地，又发现 Baf-A1能够特异性诱导B-ALL细胞G0期细胞比例增加，而CPT 则不能。这一结果证明Baf-A1诱导B-ALL细胞HSC标志表达增加、 G0期细胞比例增加，不是源于不表达干细胞标志的细胞凋亡。更重要的是，诱导人B-ALL细胞逆编程的造血干祖细胞移植到 NOD-SCID小鼠后，小鼠未出现白血病相关表型。
因此以上结果提示：Baf-A1可以诱导B-ALL白血病细胞逆编程为造血干祖细胞。其具体实验结果如下：
1.低浓度1nM Baf-A1能诱导多种B-ALL细胞系表达造血干细胞表面标志增加
Nalm-6、697、RS4；11细胞是前B细胞分化发生阻碍从而导致恶性增殖。本发明的发明人使用B细胞分化各阶段表面抗原标记，通过流式细胞仪检测Baf-A1是否诱导其逆编程。参见图1A所示，结果显示，在残存的活细胞中，Baf-A1能够诱导造血干细胞表面标志表达增加。
为了验证Baf-A1诱导B-ALL细胞逆编程的临床意义，本发明的发明人收集了B-ALL患者骨髓样品和正常人骨髓细胞做对照， Ficoll分离单个核细胞，流式分选CD34-CD19+细胞，使用Baf-A1 处理，参见图1B所示，结果表明Baf-A1只特异性地诱导B-ALL 患者来源的白血病细胞逆编程，参见图1C所示，并不影响人正常B 细胞的分化。
前期工作中已证明Baf-A1能够诱导B-ALL细胞凋亡，那么 Baf-A1诱导B-ALL细胞表达HSC特异性表面标志增高，是否是因为Baf-A1处理后不表达这些标志的细胞发生凋亡(细胞基数减少) 而导致的，本发明的发明人进行了以下研究。
本发明的发明人使用经典的凋亡诱导剂喜树碱(Camptothecin, CPT)与Baf-A1平行处理B-ALL细胞，参见图1D所示，结果显示，两者都能显著诱导B-ALL凋亡。参见图1E所示，但CPT并不能引起表达造血干细胞标志的细胞比例的增加。这提示Baf-A1引起的B-ALL表达造血干细胞标志物比例的增加，不是因为不表达这些标志的细胞发生凋亡导致的。
因此，以上结果均提示，Baf-A1诱导B-ALL细胞发生了逆编程。
2.低浓度1nM Baf-A1诱导后的存活细胞进入G0期比例增加
造血作用相对稳定的情况下，大部分的干祖细胞处于静息态，即G0期。本发明的发明人利用Baf-A1处理B-ALL细胞，检测细胞周期变化情况和细胞周期调控蛋白表达水平变化，然后运用流式细胞仪检测细胞周期发现，参见图2A所示，Baf-A1处理后，G0/G1 期的细胞比例显著增加。蛋白免疫印迹结果表明，参见图2B所示， Baf-A1可以通过上调细胞周期负调控因子的水平，及下调细胞周期正调控因子的水平，减缓细胞周期进程。用Hoechst和Pyronin Y进一步检测发现，参见图2C所示，Baf-A1处理后，G0/G1期的比例的上升主要是由于G0期的增多。
那么Baf-A1诱导残存的B-ALL细胞进入G0期比例增高，是否是因为Baf-A1处理后不表达这些标志的细胞发生凋亡(细胞基数减少)而导致的，本发明的发明人进行了以下研究。
本发明的发明人使用经典的凋亡诱导剂喜树碱(Camptothecin, CPT)与Baf-A1平行处理B-ALL细胞，参见图2D所示，结果显示，Baf-A1能特异性地诱导残存的B-ALL细胞进入G0期比例升高，而CPT不能诱导B-ALL细胞进入G0期。这提示Baf-A1诱导残存的B-ALL细胞进入G0期比例增高，不是因为不表达这些标志的细胞发生凋亡增加而使细胞数量减少导致的。
因此，以上结果均这进一步支持Baf-A1诱导B-ALL细胞逆编程为造血干祖细胞。
3.低浓度1nM Baf-A1诱导B-ALL细胞表达造血干细胞特异性转录因子
造血干细胞是一种组织特异性干细胞。20世纪50年代，骨髓移植实验取得的成功充分证明，在造血细胞中存在一类原始的造血细胞即造血干细胞(hematopoietic stemcell,HSC)。它们具有自我更新能力及多向分化潜能，并能够维持两者之间的平衡。文献报道， HSC的自我更新及多向分化是由促进生长的正调控信号和导致凋亡的负调控信号之间的平衡而调控。一些重要的正调控因子，不仅参与生物的个体发育、形态发生和器官塑形，而且在造血调控中也发挥着重要的作用。它们在CD34+细胞中高表达，并随着细胞向各系增殖分化和成熟其表达逐渐降低，直至消失。
为此，本发明的发明人检测了9个重要的维持造血干细胞干性的调控因子。图3表示Q-PCR检测Baf-A1处理B-ALL细胞前后，这9个造血干细胞特异性转录因子的表达情况。参见图3所示，检测结果显示Baf-A1(1nM)处理后，诱导的造血干祖细胞样细胞高表达造血干细胞特有的转录因子，包括Etv6、Gata2、Hif、cFos、 RunX1t1、Prdm5、Hoxa9、Gif1b、Hoxb5。
因此，这一结果也支持Baf-A1诱导B-ALL细胞逆编程为造血干祖细胞。
4.Baf-A1诱导人B-ALL细胞逆编程的造血干祖细胞样细胞，移植NOD-SCID小鼠，小鼠未出现白血病相关表型
Nalm-6是从复发的B-ALL病人中分离建立的细胞系。参见图 4A所示，本发明的发明人采用慢病毒侵染的方法，经流式分选，建立了带有绿色荧光标记的Nalm-6-GFP细胞系。Baf-A1处理后，分选带有干祖细胞标记的活细胞，通过尾静脉注射移植到NOD-SCID 小鼠中，观察小鼠的发病情况。以此判断Baf-A1诱导逆编程的人造血干祖细胞是否会导致白血病复发。
实验分为三组：阴性对照组(C：注射生理盐水)、阳性对照组(M：注射Nalm-6-GFP细胞)、实验组(T：Baf-A1处理Nalm-6-GFP 细胞后，注射带有干祖细胞标记的细胞)。Baf-A1诱导人B-ALL 细胞逆编程的造血干祖细胞，移植到NOD-SCID小鼠中。参见图 4C所示，本发明的发明人在骨髓中检测到了GFP阳性细胞，说明移植成功，参见图4B所示，但实验组小鼠并未出现与B-ALL相关的肢体瘫痪或脾肿表型。
因此，这一结果提示，Baf-A1诱导逆编程的人造血干祖细胞不会导致白血病复发。当然需要后续更多实验进一步地验证。
综合以上所有试验结果，足以证明，Baf-A1能够诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞，并且有望在制备治疗急性B淋巴白血病的药物中得以应用。
使没有完全分化的白血病细胞正向分化为成熟血细胞的诱导分化策略已成功地应用于儿童早幼粒白血病治疗。本发明用天然化合物Baf-A1诱导白血病细胞逆编程为造血干祖细胞，是一项不同于以往思路、反其道而行之的原创性探索。这对于制备治疗急性B淋巴白血病的药物，探索白血病治疗新路径，具有重要意义。未来有可能通过此途径，拓展白血病的临床疗法，优化后的免疫治疗方案有望在未来降低治疗风险，提高治愈率。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.巴弗洛霉素A1在体外诱导白血病细胞逆编程成为造血干祖细胞中的应用，其特征在于：所述巴弗洛霉素A1的浓度为1nM，且用于非疾病治疗目的。
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巴弗洛霉素A1实验治疗儿童B-急性淋巴细胞白血病;袁娜;《中国博士学位论文全文数据库》;20160115;全文 *
巴弗洛霉素A1特异性杀伤急性B淋巴白血病干细胞作用初步研究;徐莉;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20190515;全文 *

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