CN103374597A

CN103374597A - 一种nadh-q还原酶酶活性检测方法和试剂

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Publication number: CN103374597A
Application number: CN2012101256552A
Authority: CN
Inventors: 安祺
Original assignee: BEIJING HEXIN FEIFAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING HEXIN FEIFAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2013-10-30

Abstract

本发明提供一种NADH-Q还原酶（EC1.6.5.3）（线粒体呼吸链复合物I）酶活力检测的方法，同时本发明还提供了测定NADH-Q还原酶酶活性的试剂，上述方法和试剂可用于分析测定待测样本中的NADH-Q还原酶酶活力，从而可以用于临床疾病的分析、检验和诊断。本发明的原理是：利用NADH-Q还原酶可以将氧化型的荧光染料还原后产生还原型的荧光染料分子，还原型的荧光染料分子可以在特定的激发光下发射荧光，其反应的速率与产生荧光染料分子的荧光强度成正比，通过检测荧光值的变化就可以计算待测样本中的NADH-Q还原酶酶活力。

Description

一种NADH-Q还原酶酶活性检测方法和试剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定NADH-Q还原酶（NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）酶活力的方法，同时本发明还提供了作为NADH-Q还原酶（NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）的酶活性分析和检测的试剂。

背景技术

线粒体是真核细胞中的一种细胞器，由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴, 两层膜之间有腔, 称为膜间隙，线粒体中央是基质。线粒体内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞"动力工厂" (power plant)之称。另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系, 但线粒体基因组的基因数量有限, 因此,线粒体是一种半自主性的细胞器。

线粒体病(Mitochondrial disorders)是因遗传基因异常引起线粒体代谢酶的缺陷而出现的一组多系统疾病，也称为线粒体细胞病。

线粒体病可由核基因（nDNA）缺陷或线粒体基因（mtDNA）缺陷造成，因此这类疾病可有多种遗传模式，如母系遗传、孟德尔遗传，或者两者均有。

几乎人体内所有细胞的直接能量来源都是线粒体，因此,线粒体病可以说是一种导致多系统紊乱的疾病，它能损伤不止一种体细胞、组织或器官。由于线粒体病患者体内正常和病变线粒体的组成都不径相同，所以其导致的症状也因人而异。

首先，线粒体病表型多样且可相互重叠。同样的mtDNA突变可以产生不同的表现型，不同的mtDNA突变可以产生相似的表现型。

第二，除少数线粒体病仅影响单一器官外，绝大多数可影响多器官系统。线粒体呼吸链是有氧代谢必需的和最终的通路，因而往往那些依赖于有氧代谢的组织和器官如心、脑和肌肉最先受累，而且症状突出。

第三，任何年龄都可发生线粒体病。一般来说，由nDNA异常所致者发病于幼年时期，由mtDNA异常所致者则发病于童年和成年以后。

因为肌细胞和神经细胞对能量的需求特别大，因此神经肌肉方面的问题——比如肌肉无力、运动障碍、听力丧失、平衡协调能力减退、惊厥和学习不能——都是线粒体病的主要特征。该病其他普遍的并发症包括白内障、心肌无力，糖尿病以及发育不良等。一般情况下，线粒体病患者会有以上的二个至多个病症，其中的一些往往同时发生，以至于我们把它们归类为某综合征。能造成明显肌肉问题的线粒体病称为线粒体肌病（mitochondrial myopathy），而同时造成明显的肌肉和神经症状的则称为线粒体脑肌病（mitochondrial encephalomyopathy）。

因线粒体是细胞内进行有氧呼吸的主要场所，所以把线粒体内进行有氧呼吸的酶系称为线粒体呼吸链。线粒体呼吸链由一组复合物组成，包括I、II、III、IV、V。复合物I、II、III、IV的作用是在装配线上来回运输电子，因此我们称之为电子传递链，V号复合体的作用是“合成”ATP，因此又称为ATP合成酶。

线粒体呼吸链复合物中任一种或几种酶功能低下或缺陷均会导致上述线粒体病的发生。

线粒体NADH-Q还原酶（又称为NADH脱氢酶），简称为复合物I（Complex I）是线粒体呼吸链复合物中结构最大、最复杂的复合物，由45个不同的蛋白亚基组成。复合物I的功能是将电子从NADH传递给辅酶Q，在传递电子的同时向线粒体膜间隙释放2个质子，在内膜两侧形成质子梯度，将能量以电化学势能的形式储存在线粒体内膜上。复合物I的编码基因包括核基因和线粒体基因两种，其中线粒体基因编码复合物I的7个蛋白亚基，分别为ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6。这7个蛋白亚基共同参与组成复合物I的一部分结构，其中任意一个亚基功能异常均会导致线粒体病的发生，如LHON（Leber hereditary optic neuropathy）、MELAS（mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes syndrome）、AD-MT（Alzheimer disease mitochondrial）、LDYT（Leber hereditary optic neuropathy with dystonia）、LS（Leigh syndrome）、MT-C1D（mitochondrial complex I deficiency）等。

国外研究证实线粒体呼吸链复合物I功能缺陷是导致线粒体病的主要原因，约占氧化磷酸化障碍性疾病的1/3。然而目前对于线粒体病的研究手段基本以临床为基础，但因该病是多系统疾病，涉及遗传、神经、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系统，症状表现复杂，并且与多种常见疾病有相似的临床表现，因此医生很难从症状表现上积累诊断经验，因此漏诊、误诊及延误诊断的发生是普遍存在的问题。实验室检测手段也多是间接方式，如检测乳酸/丙酮酸比例、血清CK水平等。有个别实验室可做基因检测和肌肉病理检测，但因单核苷酸序列多态性的存在，可能某些突变就是正常的，不会引发疾病，因此给分析带来不确定性，而且线粒体基因突变还表现为达到某一定值后才会发病，因此基因检测同样不能作为诊断的可靠依据。而肌肉病理检测可造成一定的创伤。

但是导致线粒体病产生的直接因素就是患者体内相关酶活性降低或完全缺失，而且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关，因此判断患者线粒体相关酶的活性是否正常，同时结合患者的临床症状表现，就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。因此线粒体相关酶尤其是线粒体呼吸链复合物酶活性检测作为线粒体病的诊断依据具有其他方法不能比拟的优势，临床上通过对疑似线粒体病的患者进行相关酶活性检测，可以实现早诊断、早治疗，对线粒体病预后，减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测线粒体相关酶活性是辅助确诊该病的最佳手段。但目前采用线粒体呼吸链复合物酶活性的检测方法都是比色法，即通过分光光度计检测线粒体呼吸链复合物的酶活性，这种方法的缺点是灵敏度低，准确度差，对样品的需求量大。与分光比色法相比，荧光法检测酶活具有蛋白用量少，检测灵敏度高，特异性高，准确度高的优点。

本发明就是基于这些技术背景和临床诊断的现实需求，根据NADH-Q还原酶（线粒体呼吸链复合物I）的酶催化活性的特点，利用含荧光基团的氧化型染料作为酶催化反应的底物，可以快速灵敏的测定待测样本中的NADH-Q还原酶酶活力。待测样本中的NADH-Q还原酶可以将含荧光基团的氧化型染料还原后生成还原型荧光分子，还原型荧光分子在特定的激发光下可发生荧光，且NADH-Q还原酶催化NADH与氧化型荧光染料反应的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，这样就可以计算待测样本中的NADH-Q还原酶酶活力。采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷和灵敏度高的特点，便于推广应用。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提供一种快速、准确可靠的NADH-Q还原酶（NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）酶活力的荧光检测法，同时本发明还提供用于荧光法测定NADH-Q还原酶活性的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。

为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下：

本发明的NADH-Q还原酶酶活性测定方法原理如下：

NADH-Q还原酶在特定条件下能够将NADH中的电子转移给氧化型辅酶Q（CoQ）生成还原型辅酶Q，还原型CoQ进一步将电子转移给电子受体R生成还原型的R；还原型的R在特定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光，因此在特定的条件下可检测到还原型R的荧光值，由于NADH-Q还原酶催化底物反应的速率与还原型R的生产量成正比，因此检测在特定波长下的还原型R的荧光值的变化，就可以计算出NADH-Q还原酶的酶活力。

上述反应原理也可以用以下反应方程式来简单表示：

NADH + CoQNAD⁺ + CoQ（还原型）

CoQ（还原型）+ R（氧化型）CoQ+ R（还原型）。

本发明提供的电子受体R，其特征在于：它是一种在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的荧光染料分子，氧化型R被NADH-Q还原酶还原后产生还原型的荧光分子R，还原型荧光分子R可以在特定激发光下发射荧光。它常见的代表分子是刃天青（Resazurin），它的结构式为：

刃天青经还原后生成试卤灵（Resorufin），试卤灵为还原型荧光染料分子，用一般的荧光检测设备可在530-580nm激发波长，560-620nm的发射波长（最适发射波长为590nm）下检测到特异的荧光。试卤灵的结构式为：

需要注意的是，上述刃天青（Resazurin）应用于本发明提供的NADH-Q还原酶（NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）酶活力的检测方法和试剂只是本发明的一部分，也是一个在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的荧光染料分子中的一个典型代表，这虽然也是本发明的权利要求书的一部分，但它不代表本发明所有的涵盖内容，此举例不是意图限制本发明的涵盖内容。

本发明提供的一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书1所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

本发明提供的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书1-3所述的电子受体R，这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

本发明提供的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分还可以包括电子供体NADH；而且还可以包括如权利要求书1所述的辅酶Q（CoQ），即ubiquinone，它可以是辅酶Q的母体分子，也可以是CoQ母体分子的各种衍生物或修饰物。辅酶Q母体分子的结构式为：

碳氢链连接在母体分子的6位C上，因连接的基团不同形成CoQ母体分子的各种衍生物或修饰物，如CoQ1、CoQ2、CoQ10、Decylubiquinone（DB）等醌类化合物，其结构式如所示：

本发明提供的用荧光法检测NADH-Q还原酶活性的试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-8所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

缓冲液 10—1000mmol/L

pH范围 5.0—9.0

稳定剂 0.01%—10%

CoQ 0.005—2mmol/L

NADH 0.01—10mmol/L

抑制剂 0—20mmol/L

氧化型底物R 0.002—10mmol/L

这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性分析和检测。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双剂还是三剂，如下成分关系的本发明NADH-Q还原酶检测试剂较为理想：

缓冲液 25 —100mmol/L

pH范围 6.5—8.0

稳定剂 0.1—0.5%

CoQ 0.05—0.5mmol/L

NADH 0.05—0.2mmol/L

抑制剂 0.001—0.01mmol/L

底物R 0.005—0.02mmol/L

本发明的NADH-Q还原酶酶活力检测试剂可以配成如下双剂试剂：试剂1

缓冲液，稳定剂，CoQ，NADH，R

试剂2

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用，或是配成液体试剂，可以直接使用。

也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液，稳定剂，CoQ，NADH

试剂2

缓冲液，稳定剂，R

试剂3

抑制剂

本发明提供的一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NADH-Q还原酶酶活性的试剂或分子。NADH-Q还原酶的特异酶活性可以通过计算NADH-Q还原酶的总活性（不加抑制剂）与NADH-Q还原酶的非特异活性（加入一定浓度的抑制剂）的差值得到。这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。它包括但不限于以下实例：鱼藤酮、安密妥。

本发明提供的NADH-Q还原酶活性检测试剂，所述的稳定剂主要包括被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂（detergent），它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：Triton x-100、Tween20、NP40、Brij-35

本发明提供的NADH-Q还原酶酶活性检测试剂中所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂，它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：

乙酸钠/乙酸：pH 2.6-5.8

柠檬酸/柠檬酸钠：pH 3.0-6.6

磷酸氢盐/柠檬酸（盐）：pH 2.2-8.0

磷酸盐：pH 4.9-8.2

柠檬酸/氢氧化钠/盐酸：pH 2.2-6.5

Tris-盐酸：pH 7.1-8.9

硼酸-硼砂缓冲液：pH7.4-9.0

本发明提供的NADH-Q还原酶酶活性检测方法和试剂，可以用于分析和检测各种待测样本中的NADH-Q还原酶的酶活力，特别是检测人体各种体液、组织或细胞样本中NADH-Q还原酶的酶活力。这些被检测的样本包括但不限于脑组织、肝组织、肌组织、白细胞、成纤维细胞，提取的线粒体、提取的各种纯度的NADH-Q还原酶样品等。

本发明提供的NADH-Q还原酶酶活性检测方法和试剂，可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的NADH-Q还原酶的酶活力。

本发明提供的NADH-Q还原酶活性检测方法和试剂，可以用于分析、检测和诊断待测样本中的NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。从而可以广泛应用到临床检测或诊断与NADH-Q还原酶的酶活力相关的疾病。

附图说明：

图1：线粒体呼吸链复合物I总活性与非特异性活性检测结果。1. 表示线粒体呼吸链复合物I总活性检测：检测体系中不添加鱼藤酮，曲线线性方程为：y=561.06x + 180.93 （R²=0.9991）（n=3）。2. 表示线粒体呼吸链复合物I非特异性活性检测：检测体系中加入鱼藤酮，浓度为0.02mmol/L。曲线线性方程为：y=171.82x + 121.62 （R²=0.9979）（n=3）。

具体实施方式

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由本发明的权利要求书具体限定。

实施例一

本实施例的NADH-Q还原酶检测试剂为双剂试剂，包括

试剂1

磷酸缓冲液（pH7.2） 50mmol/L

Tween 20 0.1%

CoQ 0.2mmol/L

NADH 0.1mmol/L

刃天青钠 0.01mmol/L

试剂2

鱼藤酮 0.02mmol/L

被测NADH-Q还原酶的样品为分离的人体白细胞中线粒体，经破碎处理后，总蛋白用量为0.02ug/ul。本检测方法采用酶动力学测定方法检测线粒体呼吸链复合物I酶活性。

总活性测定：将试剂1提前置于30℃环境中温浴3分钟，然后将试剂1加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm，30度条件下进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描590nm下荧光值的变化，扫描时间为10分钟，记录曲线变化，计算反应的斜率。

非特异活性测定：将试剂1与试剂2提前混合均匀后置于30℃环境中温浴3分钟，然后将试剂混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm，30度条件下进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描590nm下荧光值的变化，扫描时间为10分钟，记录曲线变化，计算反应的斜率。

NADH-Q还原酶特异性活性=总活性-非特异性活性

根据试卤灵的标准曲线计算出NADH-Q还原酶特异性活性。

试剂1空白荧光读值平均为650，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测10分钟测定复合物I总活性，总活性斜率为561（见图1所示），试剂1与试剂2混合后的空白荧光读值平均为990，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测10分钟测定复合物I的非特异活性，非特异活性的斜率为171（见图1所示）。

复合物I的特异活性斜率=总活性斜率-非特异活性斜率=390。通过荧光标准曲线，计算出NADH-Q还原酶的酶活力。

实验结果表明，本发明的检测NADH-Q还原酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的NADH-Q还原酶酶活力，可应用于临床检测与NADH-Q还原酶酶活力异常相关的疾病。

实施例二

本实施例的NADH-Q还原酶检测试剂为双剂试剂，包括

试剂1

磷酸缓冲液（pH7.2） 50mmol/L

Tween 20 0.1%

CoQ 0.2mmol/L

NADH 0.1mmol/L

刃天青钠 0.01mmol/L

试剂2

鱼藤酮 0.02mmol/L

被测NADH-Q还原酶的样品为分离的人体白细胞中线粒体，经破碎处理后，总蛋白用量为0.02ug/ul。本检测方法采用终点法检测线粒体呼吸链复合物I酶活性。

总活性测定：将试剂1与线粒体蛋白混合后置于30℃环境中温浴10分钟，然后将反应终止，取终止后的混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm条件下检测产物的荧光值，记为F_总。

非特异活性测定：将试剂1与试剂2、线粒体蛋白混合均匀后置于30℃环境中温浴10分钟，然后将反应终止，取终止后的混合液加入到酶标仪中，在激发波长为530nm，发射波长为590nm条件下检测产物的荧光值，记为F_非。

NADH-Q还原酶特异性活性=总活性-非特异性活性

根据标准曲线计算NADH-Q还原酶的反应速率。

试剂1空白荧光读值平均为650，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测10分钟测定复合物I总活性，总活性荧光读值（扣除试剂空白）为5280，试剂1与试剂2混合后的空白荧光读值平均为990，加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应，检测10分钟测定复合物I的非特异活性，非特异活性的荧光读值（扣除试剂空白）为1671（见表1所示）。

复合物I的特异活性=总活性-非特异活性。通过荧光标准曲线，计算出NADH-Q还原酶的酶活力。

表1 线粒体呼吸链复合物I总活性与非特异性活性检测结果

实验结果表明，本发明的检测NADH-Q还原酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的NADH-Q还原酶酶活力且测定稳定（n=3，CV<3%），可应用于临床检测与NADH-Q还原酶酶活力异常相关的疾病。

总之，实践证明，采用本发明的检测NADH-Q还原酶酶活力的方法和试剂完全可以通过一般的荧光检测设备检测得出所需的测定结果，并且灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于临床检测与NADH-Q还原酶酶活力异常相关的疾病。

参考文献

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Thorburn DR, Chow CW, Kirby DM. Respirtory chain enzyme analysis in muscle and liver. Mitochondrion, 2004,4(5-6):363-375。

Claims

1.一种NADH-Q还原酶活性测定方法，其特征在于它的原理如下：

NADH-Q还原酶在特定条件下能够将NADH中的电子转移给氧化型辅酶Q（CoQ）生成还原型CoQ，还原型CoQ进一步将电子转移给电子受体R生成还原型的R；还原型的R在特定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光，因此在特定的条件下可检测到还原型R的荧光值，由于NADH-Q还原酶催化底物反应的速率与还原型R的生产量成正比，因此检测在特定波长下的还原型R的荧光值的变化，就可以计算出NADH-Q还原酶的酶活力。

2.如权利要求书1所述的电子受体R，其特征在于：它是一种在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的荧光染料分子，氧化型R被NADH-Q还原酶还原后产生还原型的荧光分子R，还原型荧光分子R可以在特定激发光下发射荧光。

3.如权利要求书1-2所述的电子受体R，其特征在于，它是刃天青（Resazurin），它的结构式为：

一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书1所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

4.如权利要求书4所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书1-3所述的电子受体R，这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。

5.如权利要求书4-5所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分还可以包括电子供体NADH；而且还可以包括如权利要求书1所述的辅酶Q（CoQ），即ubiquinone，它可以是辅酶Q的母体分子，也可以是CoQ母体分子的各种衍生物或修饰物，如CoQ1、CoQ2、CoQ10、Decylubiquinone 等醌类化合物。

6.如权利要求书4-6所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NADH-Q还原酶酶活力的试剂或分子。

7.如权利要求书4-6所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂。

8.一种NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-8所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

如权利要求书8所述的缓冲液 10—1000mmol/L

pH范围 5.0—9.0

如权利要求书8所述的稳定剂 0.01%—10%

如权利要求书6所述的CoQ 0.005—2mmol/L

NADH 0.01—10mmol/L

如权利要求书7所述的抑制剂 0—20mmol/L

如权利要求书1-3所述的电子受体R 0.002—10mmol/L

这种检测试剂主要用于NADH-Q还原酶的酶活性分析和检测。

9.根据权利要求9所述NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、CoQ、NADH、抑制剂、R组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、CoQ、NADH、R组成；试剂2，由抑制剂组成。

10.根据权利要求9所述NADH-Q还原酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、CoQ、NADH、抑制剂、R组成组成三剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、CoQ、NADH组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、R组成；试剂3，由抑制剂组成。

11.如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的NADH-Q还原酶的酶活力。

12.如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测人体各种体液、组织和细胞样本中的NADH-Q还原酶的酶活力。

13.如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的NADH-Q还原酶的酶活力。

14.如权利要求书1-14所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由NADH-Q还原酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。