CN104714029A - 糖尿病患者认知障碍的血清学标志物-GSK3β的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了糖尿病患者认知障碍的新型血清学标志物-GSK3β的检测方法，包括酶活性测定方法和相对定量的斑点印迹方法。酶活性检测是应用GENMED的GSK-3β激酶活性检测试剂盒，利用在GSK-3α抑制下GSK-3β磷酸化，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，伴随着还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应，采用光度法测定其氧化后峰值的变化来反映样品中GSK3β活性。Dot-blot方法是依据抗原、抗体结合反应原理，将血小板蛋白质转移到NC膜上，然后利用抗体进行检测的方法。研究对患者血液中GSK-3β蛋白及酶活性表达的检测方法，可望成为AD早期诊断的血清学标志物。

Description

糖尿病患者认知障碍的血清学标志物-GSK3β的检测方法

技术领域

发明属于生物医药技术领域，具体涉及糖尿病患者认知障碍的新型血清学标志物-GSK3β的检测方法。

背景技术

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)都是与衰老相关的疾病，最近研究显示，T2DM可以明显增加AD发生的风险，有学者还将AD称为“3型糖尿病”。T2DM的特征性表现为胰岛素抵抗、胰岛素分泌障碍和葡萄糖产生增加，而大脑中胰岛素及血糖水平异常是导致AD形成的重要原因。AD典型的病理学特征是大量神经元内形成以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结及由β-淀粉样多肽沉积与神经元外形成的大量老年斑，最典型的临床表现是患者记忆力的进行性下降。

AD是一个连续的病理生理过程，包括轻度认知障碍前期(pre-MCI)、轻度认知障碍期(mild cognitive impairment，MCI)和痴呆期。AD在痴呆期时病程不可逆转，目前临床药物治疗效果甚微。因此，筛选并发现新的敏感和特异的pre-MCI和MCI生物标志物尤其是早期标志物成为AD早期诊治的关键。

目前应用较多的是脑脊液中的生物学标志物，其敏感性及特异性较高；血液中的标志物虽然应用较少,但其无创性、快速及价格经济等易被人们广泛接受，给AD的诊断提供了新的思路。已有文献报道AD患者血液中存在载脂蛋白E、血小板APP异构体比值、高半胱氨酸、miRNA、白细胞介素、血红素氧合酶、基质金属蛋白酶等变化，但其特异性和敏感性并不令人满意，仅能作为辅助诊断指标使用。GSK-3β作为一种蛋白激酶，参与多种细胞内信号传导通路，是很多细胞功能的重要调节因子。GSK-3β不仅是胰岛素受体偶联信号系统的重要组成成份，而且与很多疾病尤其是AD等神经退行性疾病的发病密切相关。糖尿病发病过程中GSK-3活性明显升高，GSK-3也参与tau蛋白过度磷酸化和β淀粉样蛋白产生，GSK-3β是T2DM与AD之间共同的激酶，可能在DM并发AD样病变中起更重要的作用。目前动物实验也证实，GSK-3β的过度活化与tau蛋白过度磷酸化以及动物的空间记忆损伤呈显著正相关。因此，研究对患者血液中GSK-3β蛋白及酶活性表达的检测方法，可望成为AD早期诊断的血清学标志物。

发明内容

本发明的任务是提供一种糖尿病患者认知障碍的血清学标志物-GSK3β的检测方法，所述的方法为斑点印迹(Dot-blot)和酶活性测定。Dot-blot方法是依据抗原、抗体结合反应原理，将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测，可以作为蛋白质简单快速的定量分析。酶活性检测方法是应用GENMED的GSK-3β激酶活性检测试剂盒，是一种旨在通过多肽底物，在GSK-3α抑制剂的存在下，受到GSK-3β磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中GSK3β活性的权威而经典的技术方法。

实现本发明的具体技术方案是：

本发明提供的检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性相对定量的方法，包括以下步骤：

步骤一、血小板分离与纯化：人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。取上层血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板；

步骤二、血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；

步骤三、血小板蛋白提取与浓度测定：(1)血小板加入预冷的裂解液120μl2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒；(2)BCA法测定蛋白浓度；

步骤四、血小板蛋白Dot-blot测定：(1)血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上；(2)将NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min；(3)取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入1:1000GSK-3β和Ser9-GSK-3β的一抗，抗体用1％BSA的TBS稀释，4℃过夜，1×TBST缓冲液，所述的1×TBST由100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4组成，洗NC膜3次，每次5min；(4)用双蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司标记IRDyeT 800通道1:10000的荧光二抗染料，二抗由1％BSA的TBS稀释。室温下封膜孵育1h，1×TBST，所述的1×TBST为100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4。缓冲液洗膜3次，每次10min；(5)双蒸水冲洗泡沫，5min后荧光扫描、显色，利用自带灰度值分析软件，进行半定量统计。

本发明提供的酶活试剂盒检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性的方法，包括以下步骤：

步骤1、待测样品准备：

1.1将纯化过的血小板样品，小心加入3毫升GENMED清理液(Reagent A)，混匀，移入到预冷的10毫升试管，放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g，小心抽去上清液；

1.2加入500微升GENMED裂解液(Reagent B)，充分混匀。转移到预冷的1.5毫升离心管。强力涡旋震荡15秒。置于冰槽里孵育30分钟。放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g。

1.3小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管。移取10微升进行蛋白定量检测；即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作；

步骤2、测定准备：

2.1将血小板样品置于冰槽里；

2.2设定好分光光度仪，设置条件为：波长为340nm，每间隔1分钟扫描一次，共读数6次，共5分钟，扫描完成后置零；

2.3 GENMED缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度；

步骤3、背景对照测定：

3.1移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿，加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)，加入10微升GENMED反应液(Reagent E)，加入10微升GENMED底物液(Reagent F)，放进30℃培养箱里静置3分钟；

3.2加入5微升GENMED阴性液(Reagent G)，上下倾倒数次，在3秒之内混匀，即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟；

步骤4、样品测定：

4.1移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿，加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)，加入10微升GENMED反应液(Reagent E)，加入10微升GENMED底物液(Reagent F)，放进30℃培养箱里静置3分钟；

4.2加入5微升待测样品，上下倾倒数次，在3秒之内混匀，即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

步骤5、计算样品活性：

按以下公式计算出血小板GSK-3β活性：

[(样品读数－背景读数)1×0.1×样品稀释倍数]÷(0.005×6.22×5)＝单位浓度/毫克；

上述公式中：

样品读数是指加入待测样品0分钟和5分钟后分光光度仪的检测差值，样品读数＝340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

背景读数是指加入阴性液0分钟和5分钟后分光光度仪的检测差值，背景读数＝340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

样品稀释倍数是指样品反应前稀释的倍数；

0.1、0.005、6.22、5分别是指体系容量、样品容量、毫摩尔吸光系数、反应时间常量；

单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位。

本发明的特点是：建立的血小板GSK-3β蛋白及酶活性的检测方法，操作简单，准确快捷，并可同时检测多个样品。所构建的Dot-blot方法检测了血小板GSK-3β蛋白及活性位点的表达，发现T2DM并MCI患者血小板GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，但二者GSK-3β总蛋白表达无明显差异。所应用的酶活性检测方法，提示T2DM并MCI患者GSK-3β酶活性要高于单纯DM组，单纯DM组GSK-3β酶活性要高于非糖尿病NC组，相互之间比较有统计学意义。说明GSK-3β活性在糖尿病认知功能障碍中发挥重要作用，建立的血小板GSK-3β蛋白及酶活性检测是简便、快捷、实用的评估方法。

附图说明

图1是Dot-blot检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性图，图中显示糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-3β(ser9)/GSK-3β比值较单纯T2DM患者下降，活性增高，说明斑点印迹可以检测GSK-3β蛋白的相对活性。

图2是免疫印迹检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性图，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3β(ser9)/GSK-3β比值较单纯T2DM患者下降，活性增高，说明Dot Blot与免疫印迹结果基本一致。

图3是酶活试剂盒检测正常人(NC组)、T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性图，T2DM患者血小板GSK-3β活性高于NC组患者，T2DM-MCI组患者血小板GSK-3β活性高于T2DM组，结果与Dot Blot、免疫印迹结果基本一致。说明GSK-3β蛋白活性在T2DM认知障碍中发挥重要作用。

具体实施方式

实施例1：Dot-blot方法检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性

1.血小板分离与纯化。

1.1人全血5ml，60g，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。血浆，60g，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板。

1.2血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱。

2.血小板蛋白提取与浓度测定。

2.1血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒。

2.2 BCA法测定蛋白浓度。

3.血小板蛋白Dot-blot测定。

3.1血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上。

3.2 NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30--60min。

3.3取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的一抗，4℃过夜。

3.41×TBST缓冲液洗NC膜3×5min，接着用双蒸水清洗掉泡沫。

3.5用Licor公司标记IRDyeT 800通道的1:10000荧光二抗染料室温下封膜孵育1h。1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，同样用双蒸水冲洗泡沫。

3.6荧光扫描、显色。

实施例2：酶活试剂盒检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性

1.待测样品准备

1.1准备好纯化过的血小板样品，小心加入3毫升GENMED清理液(ReagentA)，混匀。移入到预冷的10毫升试管。放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g。小心抽去上清液。

1.2加入500微升GENMED裂解液(Reagent B)，充分混匀。转移到预冷的1.5毫升离心管。强力涡旋震荡15秒。置于冰槽里孵育30分钟。放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g。

1.3小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管。移取10微升进行蛋白定量检测。即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作。

2.测定准备

2.1将血小板样品置于冰槽里。

2.2设定好分光光度仪条件：波长为340nm，每间隔1分钟扫描1次，共读数6次，共5分钟，扫描完成后置零。

2.3 GENMED缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度。

3.背景对照测定

3.1移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿。加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)。加入10微升GENMED反应液(Reagent E)。加入10微升GENMED底物液(Reagent F)。放进30℃培养箱里静置3分钟。

3.2加入5微升GENMED阴性液(Reagent G)。上下倾倒数次，在3秒之内混匀。即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟。

4.样品测定

4.1移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿。加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)。加入10微升GENMED反应液(Reagent E)。加入10微升GENMED底物液(Reagent F)。放进30℃培养箱里静置3分钟。

4.2加入5微升待测样品。上下倾倒数次，在3秒之内混匀。即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟-340波长读数5分钟。

5.计算样品活性：

按以下公式计算出血小板GSK-3β活性：

[(样品读数－背景读数)1×0.1×样品稀释倍数]÷(0.005×6.22×5)＝单位浓度/毫克；

上述公式中：

样品读数是指加入待测样品0分钟和5分钟后分光光度仪的检测差值，样品读数＝340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

背景读数是指加入阴性液0分钟和5分钟后分光光度仪的检测差值，背景读数＝340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

样品稀释倍数是指样品反应前稀释的倍数；

0.1、0.005、6.22、5分别是指体系容量、样品容量、毫摩尔吸光系数、反应时间常量；

单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位。

实施例3：

2型糖尿病(T2DM)患者血小板GSK-3β活性在认知功能障碍中的作用实验研究

实验方法：(1)入选标准：年龄>50岁糖尿病患者；无明显影响认知测试的视力、听力障碍；无严重低血糖、糖尿病酮症昏迷、高渗性昏迷病史；无酒精依赖及精神活性物质滥用病史；无脑外伤，无心脑血管事件发生，包括脑梗塞、脑出血、TIA、心肌梗塞等；无影响认知测试的其他严重躯体疾病，如癫痫、甲状腺机能减退症、低氧血症等；无精神病史；自愿参加本研究，能配合检查，依从性好。

(2)研究分组：2型糖尿病无认知功能障碍T2DM组(T2DM)，2型糖尿病并轻度认知功能障碍MCI组(T2DM-MCI)。两组年龄、性别、糖尿病病程、合并高血压比例、合并高脂血症比例、合并冠心病比例、并发症比例(糖尿病周围神经病变、糖尿病血管病变、视网膜病变等)、应用胰岛素治疗比例均匹配。

(3)研究指标：简易智力状态检查量表(MMSE)，Western Blot、Dot Blot和酶活试剂盒测定血小板GSK-3β的活性。

实验步骤：(1)Dot-blot方法检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性。

①血小板分离与纯化。人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。取上层成分血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板。血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；

②血小板蛋白提取与浓度测定。血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer,所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；

③血小板蛋白Dot-blot测定。血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上。NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min。取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的1:1000一抗GSK-3β和Ser9-GSK-3β，4℃过夜。1×TBST缓冲液洗NC膜3次，每次5min，接着用双蒸水清洗掉泡沫。用Licor公司标记IRDyeT 800通道的1:10000荧光二抗染料室温下封膜孵育1h。1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，同样用双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描、显色。

(2)酶活试剂盒检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性。

①待测样品准备。将纯化过的血小板样品，小心加入3毫升GENMED清理液(Reagent A)，混匀。移入到预冷的10毫升试管。放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g。小心抽去上清液。加入500微升GENMED裂解液(ReagentB)，充分混匀。转移到预冷的1.5毫升离心管。强力涡旋震荡15秒。置于冰槽里孵育30分钟。放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g。小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管。移取10微升进行蛋白定量检测。即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作。

②测定准备。将血小板样品置于冰槽里。设定好分光光度仪条件：波长为340nm，每间隔1分钟扫描1次，共读数6次，共5分钟，扫描完成后置零。GENMED缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度。

③背景对照测定。移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿。加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)。加入10微升GENMED反应液(ReagentE)。加入10微升GENMED底物液(Reagent F)。放进30℃培养箱里静置3分钟。加入5微升GENMED阴性液(Reagent G)。上下倾倒数次，在3秒之内混匀。即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟。

④样品测定。移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿。加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)。加入10微升GENMED反应液(ReagentE)。加入10微升GENMED底物液(Reagent F)。放进30℃培养箱里静置3分钟。加入5微升待测样品。上下倾倒数次，在3秒之内混匀。即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟-340波长读数5分钟。

⑤计算样品活性。[(样品读数－背景读数)1×0.1×样品稀释倍数]÷(0.005×6.22×5)＝单位浓度/毫克；

实验结果：

(1)T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性的Dot Blot检测

血小板Dot Blot结果显示，糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，但二者GSK-3β总蛋白表达无明显差异，见图1。

(2)T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性的Western Blot检测

血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，二者比较有统计学意义。但二组GSK-3β总蛋白表达无统计学差异，见图2。

(3)T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β酶活测定

血小板GSK-3β酶活测定结果显示，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3β酶活性要高于单纯DM组，单纯DM组GSK-3β酶活性要高于非糖尿病NC组，相互之间比较有统计学意义，见图3。

实验结论：斑点印迹、酶活测定方法可以评估GSK-3β蛋白的相对活性、绝对活性，GSK-3β蛋白活性在T2DM认知障碍中发挥重要作用。

Claims (2)

1.一种检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性相对定量的方法，包括以下步骤：

步骤一、血小板分离与纯化：人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞，取上层血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板；

步骤二、血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；

步骤三、血小板蛋白提取与浓度测定：(1)血小板加入预冷的裂解液120μl2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒；(2)BCA法测定蛋白浓度；

步骤四、血小板蛋白Dot-blot测定：(1)血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上；(2)将NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min；(3)取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入1:1000GSK-3β和Ser9-GSK-3β的一抗，抗体用1％BSA的TBS稀释，4℃过夜，1×TBST缓冲液，所述的1×TBST由100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4组成，洗NC膜3次，每次5min；(4)用双蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司标记IRDyeT 800通道1:10000的荧光二抗染料，二抗由1％BSA的TBS稀释，室温下封膜孵育1h，1×TBST，所述的1×TBST为100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4，缓冲液洗膜3次，每次10min；(5)双蒸水冲洗泡沫，5min后荧光扫描、显色，利用自带灰度值分析软件，进行半定量统计。

2.一种酶活试剂盒检测糖尿病患者血小板GSK-3β活性的方法，包括以下步骤：

步骤1、待测样品准备：

1.1将纯化过的血小板样品，小心加入3毫升GENMED清理液(Reagent A)，混匀，移入到预冷的10毫升试管，放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g，小心抽去上清液；

1.2加入500微升GENMED裂解液(Reagent B)，充分混匀，转移到预冷的1.5毫升离心管，强力涡旋震荡15秒，置于冰槽里孵育30分钟，放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g；

1.3小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管，移取10微升进行蛋白定量检测；即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作；

步骤2、测定准备：

2.1将血小板样品置于冰槽里；

2.2设定好分光光度仪，设置条件为：波长为340nm，每间隔1分钟扫描一次，共读数6次，共5分钟，扫描完成后置零；

2.3GENMED缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度；

步骤3、背景对照测定：

3.1移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿，加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)，加入10微升GENMED反应液(Reagent E)，加入10微升GENMED底物液(Reagent F)，放进30℃培养箱里静置3分钟；

3.2加入5微升GENMED阴性液(Reagent G)，上下倾倒数次，在3秒之内混匀，即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟；

步骤4、样品测定：

4.1移取65微升GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿，加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)，加入10微升GENMED反应液(Reagent E)，加入10微升GENMED底物液(Reagent F)，放进30℃培养箱里静置3分钟；

4.2加入5微升待测样品，上下倾倒数次，在3秒之内混匀，即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

步骤5、计算样品活性：

按以下公式计算出血小板GSK-3β活性：

[(样品读数－背景读数)1×0.1×样品稀释倍数]÷(0.005×6.22×5)＝单位浓度/毫克；

上述公式中：

样品读数是指加入待测样品0分钟和5分钟后分光光度仪的检测差值，样品读数＝340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

背景读数是指加入阴性液0分钟和5分钟后分光光度仪的检测差值，背景读数＝340波长读数0分钟-340波长读数5分钟；

样品稀释倍数是指样品反应前稀释的倍数；

0.1、0.005、6.22、5分别是指体系容量、样品容量、毫摩尔吸光系数、反应时间常量；

单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位。