CN112526132A - 预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及一种预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法。所述方法包括以下步骤：(1)对2型糖尿病患者的嗅觉功能、Aβ1‑42和Aβ1‑40水平、Total‑GSK‑3β和p‑GSK‑3β‑Ser9水平以及ApoE基因分型进行检测；(2)基于年龄、嗅觉功能、Aβ1‑42和Aβ1‑40的比值、Total‑GSK‑3β和p‑GSK‑3β‑Ser9的比值以及ApoE的基因分型，预测2型糖尿病患者发生老年性痴呆的风险。该方法可以预测2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险，灵敏度高、特异性好和诊断准确率高，并且具有易于检测、成本低、可用于临床大批量样本筛选的特点。

Description

预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法。
背景技术
2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)和轻度认知损伤(mild cognitiveimpairment，MCI)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的两个独立危险因素，后者在临床早期阶段是不可预测的。T2DM和AD是常见的年龄相关性淀粉样蛋白疾病，有证据表明T2DM和AD有共同的遗传背景、环境危险因素和潜在的病变。最近的纵向研究也表明，T2DM会导致记忆力衰退，进而出现认知能力下降和脑萎缩的情况，然后进一步发展为AD；同时随访报告也显示糖尿病患者中AD的患病率高于非糖尿病患者。
因此，对2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险进行预测，可帮助识别患者中出现轻度认知损伤(mild cognitive impairment，MCI)高危人群，进而对预防2型糖尿病患者发展为AD尤为关键。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的无法识别和预测MCI高危人群的问题，提供一种预测2型糖尿病患者发生老年性痴呆的风险的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对2型糖尿病患者的嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40水平、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平以及ApoE基因分型进行检测；
(2)基于年龄、嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40的比值、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值以及ApoE的基因分型，预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险。
优选地，在步骤(1)中，所述嗅觉功能检测采用嗅觉评分测定进行。
优选地，所述嗅觉评分测定的方法中，嗅剂为正丁醇，浓度范围为2.3×10-5体积％至4体积％。
优选地，所述Aβ1-42和Aβ1-40水平测试的具体操作包括：
a：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取血浆；
b：通过酶联免疫吸附实验检测血浆中Aβ1-42和Aβ1-40水平。
优选地，所述Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平检测的具体步骤包括：
c：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取血小板；
d：纯化血小板，接着提取并测定血小板中的蛋白浓度；
e：采用斑点印记杂交实验测定血小板蛋白中Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平。
优选地，在步骤c中，所述血液为外周血。
优选地，所述ApoE的基因分型检测的具体步骤包括：
f：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取白细胞；
g：从白细胞中提取DNA；
h：检测DNA中ApoE基因分型。
优选地，在步骤h中，采用扩增抗拒突变系统检测ApoE基因分型。
优选地，当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值升高、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值升高，以及ApoE的基因分型为ApoE epsilon-4时，2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
优选地，当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值≥0.54、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值＞1.2043，以及ApoE的基因分型为ApoEepsilon-4时，2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
本发明所述的方法，可以预测2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险，灵敏度高、特异性好和预测准确，并且具有易于检测、成本低、可用于临床大批量样本筛选的特点。
附图说明
图1是实施例1和实施例2的ROC曲线图；
图2是实施例1和实施例2的校准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的发明人在对糖尿病合并认知损伤人群的研究过程中发现，糖尿病合并认知损伤人群的血浆Aβ1-40水平显著低于糖尿病非认知损伤人群，而血浆Aβ1-42则显著高于糖尿病非认知损伤人群，同时还具有Aβ1-42水平与Aβ1-40水平的比值显著高于糖尿病非认知损伤人群的特点；并且血小板中单独使用Total-GSK-3β以及p-GSK-3β-Ser9的水平无法明显区别糖尿病合并认知损伤人群和糖尿病非认知损伤人群，而使用Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值作为界定值能够明显的区分糖尿病合并认知损伤人群和糖尿病非认知损伤人群。基于此，完成了本发明。
本发明提供一种预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对2型糖尿病患者的嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40水平、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平以及ApoE基因分型进行检测；
(2)基于年龄、嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40的比值、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值以及ApoE的基因分型，预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险。
在本发明中，Total-GSK-3β水平是指血小板中GSK-3β的总含量。
在本发明所述的方法中，在步骤(1)中，所述嗅觉功能可以检测采用嗅觉评分测定进行。
在优选的实施方式中，所述嗅觉评分测定的方法采用改良CCCRC法进行，嗅剂为正丁醇，浓度范围为2.3×10-5体积％至4体积％，按浓度从低到高划分为0-11共12级，得分越高代表嗅觉功能越差，以双蒸水作为空白对照。
在本发明所述的方法中，所述Aβ1-42和Aβ1-40水平测试具体操作包括：
a：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取血浆；
b：通过酶联免疫吸附实验(Elisa)检测血浆中Aβ1-42和Aβ1-40水平。
在本发明所述的方法中，所述Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平检测的具体步骤包括：
c：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取血小板；
d：纯化血小板，接着提取并测定血小板中的蛋白浓度；
e：采用斑点印记杂交实验测定血小板蛋白中Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平。
在优选的情况下，在步骤c中，所述血液为外周血。
在优选的情况下，所述ApoE的基因分型检测的具体步骤包括：
f：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取白细胞；
g：从白细胞中提取DNA；
h：检测DNA中ApoE基因分型。
进一步优选的，在步骤h中，采用扩增抗拒突变系统检测ApoE基因分型。
在本发明所述的方法中，当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值升高、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值升高，以及ApoE的基因分型为ApoEepsilon-4时，2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
在本发明中，所述Aβ1-42和Aβ1-40的比值升高和Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值升高是指，与没有MCI的2型糖尿病患者相比较，有出现记忆力衰退的风险的2型糖尿病患者的Aβ1-42与Aβ1-40的比值和Total-GSK-3β与p-GSK-3β-Ser9的比值升高。
在优选的实施方式中，当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值≥0.54、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值＞1.2043，以及ApoE的基因分型为ApoE epsilon-4时，2型糖尿病患者具有很高的风险出现记忆力衰退。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1-2
实施例1的受试者为随机挑选的363名2型糖尿病患者，实施例2的受试者为随机挑选的489名2型糖尿病患者。
具体过程包括如下内容：
一、对2型糖尿病患者的嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40水平、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平以及ApoE基因分型进行检测。
1、嗅觉功能
对受试者的嗅觉功能进行评分测定，测定方法采用改良CCCRC(Connecticutchemosensory clinical research center)测试。CCCRC方法以正丁醇为嗅剂，按浓度(2.3×10-5体积％至4体积％)从低到高划分为0-11共12级，得分越高代表嗅觉功能越差，双蒸水作为空白对照。评分表如表1所示，当评分级别大于8时，即为嗅觉障碍。
表1
Figure BDA0002792414140000061
2、Aβ1-42和Aβ1-40水平检测
a：取5ml EDTA K2抗凝管中新抽的2型糖尿病患者的血液，低速离心机60g离心15分钟，可见血液分为三层，自上而下依次为血浆、白细胞和红细胞，提取上层血浆；
b：通过酶联免疫吸附实验检测血浆中Aβ1-42和Aβ1-40水平，Elisa试剂盒购买于武汉Elabscience公司，检测范围为15.63-1000pg/mL。
3、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平检测
c：取5ml EDTA K2抗凝管中新抽的2型糖尿病患者的外周血，然后低速离心机60g离心15分钟，可见血液分为三层，自上而下依次为血浆(含血小板)、白细胞和红细胞。吸取上层含血小板血浆，2000g离心15分钟，底部白色沉淀即为血小板；
d：使用国产索莱宝公司购入的改良台式液(pH＝7.4)和1xPBS进行纯化，2000g离心15min留取沉淀即为纯化血小板。在纯化血小板中加入60μl RIPA弱裂解液、20μl4xbuffer上样缓冲液、cocktail和PMSF，100℃沸水煮10min，超声15-20次，12000rpm离心15分钟留取上清，采用BCA法测定蛋白浓度；
e：采用斑点印记杂交实验测定血小板蛋白中Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平；具体过程如下：
(1)取血小板蛋白样品稀释至7.5μg/μl；
(2)取NC膜两张，于保护膜上画交叉直线以轻印上样点，取2μl血小板蛋白样品滴加至上样点，室温风干2.-3h；
(3)将NC膜放入封闭液中进行抗原封闭，封闭液为5％脱脂奶粉，室温摇床慢摇1h；
(4)双蒸水漂洗后，两张NC膜分别加入Total GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9抗体(稀释比1：500)，4℃冷库慢摇过夜；
(5)回收一抗，用TBS-T(pH＝7.4)清洗NC膜3次，每次10min；
(6)NC膜清洗后，放入
Figure BDA0002792414140000071
800CW荧光素二抗(稀释比1：10000)中，室温避光慢摇1h；
(7)回收二抗，TBS-T再次清洗NC膜3次，每次10min；
(8)NC膜放入Odyssey扫描仪，按照参数扫描，使用Odyssey软件分析系统进行半定量分析。
4、ApoE基因分型检测
f：取5ml EDTA K2抗凝管中新抽的2型糖尿病患者的血液，低速离心机60g离心15分钟，可见血液分为三层，自上而下依次为血浆(含血小板)、白细胞和红细胞，然后提取白细胞；
g：采用美国Omega Bio-Tek公司提供的血液DNA提取试剂盒，从上述分离的白细胞中提取DNA；
h：采用扩增抗拒突变系统检测DNA中ApoE基因分型；具体过程包括：
(1)引物设计
由擎科公司合成，引物序列见表2。
表2
Figure BDA0002792414140000081
(2)PCR扩增
本PCR体系总体积25μL，见表3。
表3
Figure BDA0002792414140000082
Figure BDA0002792414140000091
上述试剂充分振荡混匀后，放入PCR仪进行扩增，扩增条件见表4。
表4
Protocol Temperature(℃) Time
预变性 94 5min
变性 94 45s
退火 60 30s
延伸 72 60s
循环(变形-延伸) —— 35cycles
终延伸 72 10min
(3)PCR产物检测
S1：取1.2g琼脂糖凝胶加入装有80ml TBE的锥形瓶中，然后放入微波炉加热；
S2：用加样枪取8μl GoldView加入上步溶液，保持锥形瓶底部平稳，摇匀后倒入凝胶槽，插入梳齿，室温静置40-60min；
S3：拔出梳齿，将凝胶轻轻放入电泳槽，倒入TBE溶液至液面高于凝胶，加入DNADL1000 Marker和10μl PCR扩增产物；
S4：设置电泳槽恒压100V，电泳时间约25min；
S5：取凝胶于紫光登下拍照，检测结果参照表5。
表5
Figure BDA0002792414140000092
二、基于年龄、嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40的比值、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值以及ApoE的基因分型的检测结果，预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险。当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值≥0.54、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值＞1.2043，以及ApoE的基因分型为ApoE epsilon-4时，该2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
实施例1中，根据检测结果发现，有68人具有出现记忆力衰退的风险。
实施例2中，根据检测结果发现，有222人具有出现记忆力衰退的风险。
对比例1
对实施例1中所述的受试者进行检测，检测过程按照实施例1所示的方法进行实施，与之不同的是，不对Aβ1-42和Aβ1-40的比值进行检测，仅仅基于年龄、嗅觉功能、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值以及ApoE的基因分型进行检测，并预测2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
对比例2
对实施例2中所述的受试者进行检测，检测过程按照实施例2所示的方法进行实施，与之不同的是，不对Aβ1-42和Aβ1-40的比值进行检测，仅仅基于年龄、嗅觉功能、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值以及ApoE的基因分型进行检测，并预测2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
测试例
1、通过分析实施例和对比例的检测结果，得到受试者工作特性曲线(ROC)以及得出曲线下面积(AUC)，从而对本发明所述的方法的诊断区分度进行评估。同时使用1000次bootstrap重采样计算AUC(95％CI)。其中，实施例和对比例的数据处理如表6所示，实施例1和实施例2的ROC曲线如图1所示。由此可知，实施例1的AUC为0.869(95％CI，0.822-0.916)，实施例2的AUC为0.867(95％CI，0.835-0.899)，并且对比例1的AUC为0.846(95％CI，0.794-0.897)，对比例2的AUC为0.848(95％CI，0.815-0.882)。因此可以得知，实施例中所使用的预测方法的预测能力优于对比例。
表6
Figure BDA0002792414140000111
2、在Petersen诊断标准下，实施例1中的受试者中有89人具有MCI，实施例2中的受试者中有264人具有MCI。本发明所述的方法，可准确识别出实施例1中的受试者中68人具有出现记忆力衰退的风险，实施例2中的受试者中有222人具有出现记忆力衰退的风险。说明本发明所述的方法预测准确率高。进一步的，应用校准曲线来分析本发明所述的方法预测的发生率与真实情况的实际的发生率是否一致。结果如图2所示，2A为实施例1的校准曲线，2B为实施例2的校准曲线。由图可知，实施例1和实施例2的校准曲线的95％CI均未跨越对角线平分线，说明本发明所述方法的预测结果与T2DM人群中MCI患病的实际情况具有很强的一致性，表明本发明所述的方法的校准度(或称为拟合优度)在两个实施例中都很好。
综合ROC曲线和校准曲线，本发明所述的方法具有很好的区分度和校准度，能够很好的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中科技大学
<120> 预测2型糖尿病患者出现记忆力减退的风险的方法
<130> HBI1129HUST
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Cys 112 primer A2
<400> 1
cgcggacatg gaggacgttt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Arg112 primer B2
<400> 2
cgcggacatg gaggacgttc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Arg 158 primer A1
<400> 3
atgccgatga cctgcagaat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Cys 158 primer B1
<400> 4
atgccgatga cctgcagaat c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> common primer C
<400> 5
gttcagtgat tgtcgctggg ca 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 内参上游引物D1
<400> 6
gtggcaccga gaccaaactc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 内参下游引物D2
<400> 7
agtgcaagga gaccacggga 20

Claims (10)

1.一种预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对2型糖尿病患者的嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40水平、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平以及ApoE基因分型进行检测和综合分析；
(2)基于年龄、嗅觉功能、Aβ1-42和Aβ1-40的比值、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值以及ApoE的基因分型，预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险。
2.根据权利要求1所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述嗅觉功能检测采用嗅觉评分测定进行。
3.根据权利要求2所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，所述嗅觉评分测定的方法中，嗅剂为正丁醇，浓度范围为2.3×10-5体积％至4体积％。
4.根据权利要求1所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，所述Aβ1-42和Aβ1-40水平测试的具体操作包括：
a：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取血浆；
b：通过酶联免疫吸附实验检测血浆中Aβ1-42和Aβ1-40水平。
5.根据权利要求1所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，所述Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平检测的具体步骤包括：
c：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取血小板；
d：纯化血小板，接着提取并测定血小板中的蛋白浓度；
e：采用斑点印记杂交实验测定血小板蛋白中Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9水平。
6.根据权利要求5所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，在步骤c中，所述血液为外周血。
7.根据权利要求1所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，所述ApoE的基因分型检测的具体步骤包括：
f：采集2型糖尿病患者的血液，然后进行血液组织分离，提取白细胞；
g：从白细胞中提取DNA；
h：检测DNA中ApoE基因分型。
8.根据权利要求7所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，在步骤h中，采用扩增抗拒突变系统检测ApoE基因分型。
9.根据权利要求1所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值升高、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值升高，以及ApoE的基因分型为ApoE epsilon-4时，2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
10.根据权利要求9所述的预测2型糖尿病患者出现记忆力衰退的风险的方法，其特征在于，当2型糖尿病患者的年龄>66岁，嗅觉障碍，Aβ1-42和Aβ1-40的比值≥0.54、Total-GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9的比值＞1.2043，以及ApoE的基因分型为ApoE epsilon-4时，2型糖尿病患者具有出现记忆力衰退的风险。
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