CN117025745B - 分子标志物在诊断干燥综合征中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及分子标志物在诊断干燥综合征中的应用。具体地，本发明提供了检测分子标志物的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用，所述分子标志物选自PTK6、SIL1、ST3GAL1或其组合。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及分子标志物在诊断干燥综合征中的应用。
背景技术
干燥综合征是一种长期的自身免疫性疾病，会影响身体产生水分的腺体(泪腺和唾液腺)，并且经常严重影响其他器官系统，例如肺、肾和神经系统。主要症状是干燥(口干和眼睛干涩)、疼痛和疲劳。其他症状可能包括皮肤干燥、阴道干燥、慢性咳嗽、手臂和腿部麻木、感觉疲倦、肌肉和关节疼痛以及甲状腺问题。虽然发病原因尚不清楚，但根据目前的研究干燥综合征的发明涉及遗传因素和环境因素的结合，例如接触病毒或细菌。它可以独立于其他健康问题(原发性干燥综合征)或由于另一种结缔组织疾病(继发性干燥综合征)而发生。
虽然干燥综合征是最常见的自身免疫性疾病之一，但它没有特异性和非侵入性的诊断测试，往往容易误诊。
对于诊断干燥综合征，需要有明显的临床症状。干燥综合征往往表现为反复口干眼干，牙齿片状脱落被称为猖獗牙齿。患者口干症状往往表现为吞咽干粮难以咽下，需要用水顺服。眼干主要表现为眼睛干涩明显，泪液减少，严重会出现反复角膜炎。部分患者会出现反复无痛性腮腺以及颌下腺肿大。少部分会出现间质性肺炎，肾小管酸中毒，血小板减少等。除了临床症状，血清学检查对于诊断干燥综合征尤其重要，比如自身抗体显示抗核抗体，抗SSA，SSB，RO52抗体阳性，血沉增快，免疫球蛋白升高。对于确诊干燥综合征，最重要的检查是小唇腺活检，病理显示灶性淋巴细胞浸润，病理活检是前段干燥综合征的金标准。此外，一些其他的辅助检查，比如腮腺核素显像，泪液分泌实验，唾液腺流速都是诊断干燥综合征非常重要的检查。
目前，干燥综合征目前尚无根治的方法，治疗主要包括对症治疗和系统治疗，对症治疗则为局部对症治疗为主。虽然尚没有完全根治的办法，但是大部分干燥综合征进展比较缓慢，预后比较良好，少部分干燥综合征会出现严重的并发症，因此早期诊断以及系统治疗对于改善预后非常重要，大部分病情会得到很好的控制。
发明内容
目前，干燥综合征的诊断没有特异性强、准确性高的诊断方法，为解决该技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了检测分子标志物的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用，所述分子标志物选自PTK6、SIL1、ST3GAL1或以下任意一种分子标志物组合：
(1)PTK6、SCGB1D1，
(2)PTK6、HIST1H4J，
(3)PTK6、ST3GAL1，
(4)PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4，
(5)PTK6、SCGB1D1、SIL1、ST3GAL1，
(6)PTK6、SCGB1D1、ST3GAL1、PEBP4。
优选地，本发明所提供的分子标志物或分子标志物组合在应用时可以排除普通干眼症的干扰，准确筛选出干燥综合征的患者；因此，所述的诊断干燥综合征的产品也可以称为区分普通干眼症和干燥综合征的产品、区分干燥综合征患者和非患者的产品。
在一种实施方式中，所述检测分子标志物的试剂包括但不限于基于“扩增”进行的表达量检测方法所使用的试剂、或通过免疫检测、原位杂交检测方法检测表达量的试剂、或基因芯片、高通量测序平台。
在一种实施方式中，所述试剂中包括以下至少一种：
1)引物、
2)与标志物蛋白特异性结合的抗体、
3)与标志物的核酸序列特异性杂交的探针。
在一种实施方式中，所述试剂还可以包括聚合酶链式反应体系，所述聚合酶链式反应体系包含：PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料等。
在一种实施方式中，所述试剂还可以包括使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、cDNA扩增试剂、制备标准曲线所用的标准品、阳性对照品、阴性对照品等。
在一种实施方式中，所述试剂还可以包括蛋白实验(也可以称为免疫实验，是基于特异性结合的检测方法)中可能使用的以下成分：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品等。
本发明所述术语“扩增”包括变温扩增、恒温扩增，所述变温扩增主要包括经典的聚合酶链式反应(即PCR方法，其衍生方法包括但不限于PCR、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR)和连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction，简称LCR)；所述恒温扩增包括链置换扩增(Stranddisplacement amplification，简称SDA)、滚环扩增(Rolling Circle amplification，简称RCA)、环介导扩增(Loop Mediated Amplification，简称LAMP)、依赖解旋酶恒温扩增(Helicase-dependent Isothermal DNA Amplification，简称HDA)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence based amplification，简称NASBA)、转录依赖的扩增系统(Transcription-based Amplification System，简称TAS)。
本发明所述术语“探针”可以为单标记的核酸探针，例如放射性核素(如32P、3H、35S等)标记探针、生物素标记探针、辣根过氧化物酶标记探针、地高辛标记探针或荧光基团(如FITC、FAM、TET、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5等)标记探针；所述核酸探针也可以为双标记的核酸探针，例如Taqman探针、分子信标、置换探针、QUAL探针、FRET探针等。
本发明所述术语“引物”可能为用于双链或单链的形式，引物的数量可以是2条(例如PCR反应中)，引物的数量也可以是6条(例如LAMP反应中)，长度可以是10-200bp不等。优选地，所述扩增使用的是PCR方法中，所述引物是两条单链DNA序列，与目标靶序列特异性结合。
优选地，所述产品包括诊断干燥综合征的试剂盒、诊断干燥综合征的诊断系统等。
优选地，所述诊断干燥综合征的诊断系统中依次包括以下装置：
1)获取分子标志物或分子标志物组合的表达量的信息收集装置，
2)根据1)所收集到的信息计算受试者是否患有干燥综合征的计算装置，
3)结果输出装置。
本发明中，所述术语“表达”也即基因表达(gene expression)，是指将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程。基因表达产物通常包括mRNA和蛋白质，所有已知的生命，都利用基因表达来合成生命的大分子。具体地，所述表达包括mRNA从基因或基因部分的产生过程，并且包括由RNA或基因部分所编码的蛋白质的产生过程，还包括与表达相关的检测物质的出现的过程。例如，cDNA结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内；在免疫印迹如western印迹上斑点密度的增加也属于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
另一方面，本发明提供了诊断干燥综合征的方法，所述方法包括收集受试者样本，检测分子标志物的表达量，并判断受试者是否患有干燥综合征。
所述分子标志物选自PTK6、SIL1、ST3GAL1或以下任意一种分子标志物组合：
(1)PTK6、SCGB1D1，
(2)PTK6、HIST1H4J，
(3)PTK6、ST3GAL1，
(4)PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4，
(5)PTK6、SCGB1D1、SIL1、ST3GAL1，
(6)PTK6、SCGB1D1、ST3GAL1、PEBP4。
具体地，所述检测分子标志物的表达量的方法包括提取DNA、RNA或蛋白质后使用以下任意一种方法进行表达量的检测：基于“扩增”进行的表达量检测、免疫检测、原位杂交检测、或通过基因芯片、高通量测序平台进行检测。
优选地，所述样本包括：血液、鼻上皮细胞、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
优选地，如本发明验证分子标志物功能时所使用的数据集GSE84844中使用的样本是血液。
优选地，所述PTK6在患者中高表达。
优选地，所述SCGB1D1在患者中高表达。
优选地，所述SIL1在患者中低表达。
优选地，所述PEBP4在患者中低表达。
优选地，所述ST3GAL1在患者中低表达。
优选地，所述受试者包括哺乳动物。例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。
优选地，所述受试者为人，更具体地，是疑似患有干燥综合征的人。
优选地，所述“高表达”是指基因表达水平大于对照群体中表达水平，相对于对照，高至少1.1倍，例如至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍或更多。
优选地，所述“低表达”是指所述基因的表达水平小于对照群体该基因的表达水平，例如，是对照群体该基因的表达水平的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。
如本发明所使用的所述“对照群体”可以是未患有眼科疾病的群体或者是患有普通干眼症的患者。
如本发明所述“干眼症”是各种因素导致的泪液的质或量的异常，从而导致眼睛不适症状的一类疾病，主要就引起眼睛的不适症状，表现为干涩，少泪，异物感等。
如本发明所述“干燥综合征”(又称sicca syndrome，SS；综合征)是一个主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病，又名自身免疫性外分泌腺体上皮细胞炎或自身免疫性外分泌病。干燥综合征是一种以侵犯外分泌腺，尤其是唾液腺及泪腺为主的慢性全身性疾病，不仅可表现为干眼症，口干燥症也可伴有内脏损害，比如肺，肝脏，胰腺，血液系统，神经系统受累等而出现复杂的临床表现，重要脏器受累还可危及生命。综上，干眼症和干燥综合征是两种不同的疾病，二者具有很大区别。
附图说明
图1是本发明参与者的体征和眼表疾病指数量表的检查信息。
图2是PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4、ST3GAL1在干燥综合征vs健康者之间的差异表达结果图。
图3是PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4、ST3GAL1单独诊断干燥综合征时的ROC曲线。
图4是两个基因共同诊断干燥综合征时的ROC曲线。
图5是PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4共同诊断干燥综合征时的ROC曲线。
图6是PTK6、SCGB1D1、SIL1、ST3GAL1共同诊断干燥综合征时的ROC曲线。
图7是PTK6、SCGB1D1、ST3GAL1、PEBP4共同诊断干燥综合征时的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、差异基因筛选及功能验证
根据对体征(角膜荧光染色评分、BUT数值、schirmer数值、结膜充血评分)和眼表疾病指数量表(OSDI)的检查，确认本发明纳入的健康者均未患有眼科相关疾病。
干燥综合征、普通干眼的确诊由临床医生根据常用诊断标准进行判断，各组样本收集自临床。
在各组参与者之间随机挑选6位进行下一步实验，对三组共18位参与者的体征(角膜荧光染色评分、BUT数值、schirmer数值、结膜充血评分)和眼表疾病指数量表(OSDI)的检查信息汇总如附图1所示。
针对以上18位参与者收集样本，对样本进行蛋白测序。测序完成后，成功获得原始下机数据，进行数据处理后，筛选在不同组之间具有显著差异表达的蛋白或肽段，各组之间表达量具有显著差异的蛋白或肽段的数量统计如表1所示。
表1、组间差异蛋白或肽段数量统计
| SC vs NC | MC vs NC | SC vs MC | |
| 上调 | 265 | 172 | 199 |
| 下调 | 269 | 195 | 140 |
为在大群体中筛选干燥综合征患者时，不受普通干眼患者的影响，选择在干燥综合征(SC)vs普通干眼症患者(MC)、干燥综合征(SC)vs健康者(N)之间都差异表达的蛋白，例如PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4、ST3GAL1、HIST1H4J(上调)。为确定准确性，使用含有30位干燥综合征和30健康者测序结果的数据库(GSE84844)验证其诊断效能。ROC(receiveroperator characteristic curve)曲线，又称为受试者工作特征曲线，是反映灵敏度和特异度连续变量的综合指标，通常被用来直观地确定某一种诊断方法的最优诊断界值。ROC曲线下面的面积为AUC值(Area under Curve)，一般来说AUC的最小值为0.5，最大值为1，数值越大代表诊断越准确。
表2、各目标基因在组间的变化趋势及诊断AUC值
| 基因 | SC vs NC1 | SC vs MC2 | AUC | 差异表达附图 | ROC附图 |
| PTK6 | 上调 | 上调 | 0.72 | 2A | 3A |
| SCGB1D1 | 下调 | 下调 | 0.65 | 2B | 3B |
| SIL1 | 下调 | 下调 | 0.72 | 2C | 3C |
| PEBP4 | 下调 | 下调 | 0.68 | 2E | 3E |
| ST3GAL1 | 下调 | 下调 | 0.74 | 2F | 3F |
备注：
1、统计自蛋白测序结果和GSE84844中的数据。
2、统计自蛋白测序结果。
经分析，在干燥综合征vs健康者、干燥综合征vs普通干眼之间都存在一致性变化趋势的蛋白水平差异表达基因经mRNA表达量再次验证，基本可以实现在大量人群中准确筛选出干燥综合征患者的目的(表2)。
表3、目标基因同时使用时的诊断AUC值
| 基因组合 | AUC | ROC附图 |
| PTK6、SCGB1D1 | 0.76 | 4A |
| PTK6、HIST1H4J | 0.84 | 4B |
| PTK6、ST3GAL1 | 0.84 | 4C |
| PTK6、SCGB1D1、SIL1、PEBP4 | 0.88 | 5 |
| PTK6、SCGB1D1、SIL1、ST3GAL1 | 0.89 | 6 |
| PTK6、SCGB1D1、ST3GAL1、PEBP4 | 0.91 | 7 |
为进一步尝试是否有可能提高诊断的准确性，将筛选到的基因进行组合，如以上表3中的数据表明，同时使用多个基因时，AUC数值有增长的趋势，共同使用PTK6、SCGB1D1、ST3GAL1、PEBP4进行区分时，AUC值可达到0.91左右，可实现精准的诊断功能。
Claims (10)
1.检测分子标志物的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用，所述分子标志物选自PTK6、SIL1、ST3GAL1或以下任意一种分子标志物组合：
（1）PTK6和SCGB1D1，
（2）PTK6和HIST1H4J，
（3）PTK6和ST3GAL1，
（4）PTK6、SCGB1D1、SIL1和PEBP4，
（5）PTK6、SCGB1D1、SIL1和ST3GAL1，
（6）PTK6、SCGB1D1、ST3GAL1和PEBP4。
2.如权利要求1所述的应用，所述检测分子标志物的试剂包括基于扩增进行的表达量检测方法所使用的试剂，通过免疫检测、原位杂交检测方法检测表达量的试剂，基因芯片或高通量测序平台。
3.如权利要求1所述的应用，所述试剂中包括以下至少一种：
1）特异性扩增标志物的引物、
2）与标志物蛋白特异性结合的抗体、
3）与标志物的核酸序列特异性杂交的探针。
4.如权利要求3所述的应用，所述试剂还包括聚合酶链式反应体系，所述聚合酶链式反应体系包含：PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs或荧光染料。
5.如权利要求3所述的应用，所述试剂还包括使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、cDNA扩增试剂、制备标准曲线所用的标准品、阳性对照品、阴性对照品。
6.如权利要求3所述的应用，所述试剂还包括蛋白实验中使用的以下成分：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。
7.如权利要求2所述的应用，所述扩增包括变温扩增、恒温扩增。
8.如权利要求7所述的应用，所述变温扩增主要包括经典的聚合酶链式反应和连接酶链式反应，所述恒温扩增包括链置换扩增、滚环扩增、环介导扩增、依赖解旋酶恒温扩增、依赖核酸序列的扩增、转录依赖的扩增系统。
9.如权利要求1所述的应用，所述产品包括诊断干燥综合征的试剂盒、诊断干燥综合征的诊断系统。
10.如权利要求9所述的应用，所述诊断干燥综合征的诊断系统中依次包括以下装置：
1）获取分子标志物或分子标志物组合的表达量的信息收集装置，
2）根据1）所收集到的信息计算受试者是否患有干燥综合征的计算装置，
3）结果输出装置。
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