CN114410767B - Cmv与prdm9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用 - Google Patents
Cmv与prdm9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了CMV与PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用。其利用CMV独立或联合PRDM9转座子融合定量检测作为先天性巨结肠的标记物，相对于传统诊断方法(钡灌肠等)，本发明中的检测方法具有确诊时间更早、操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠早期诊断的替代或辅助检测手段。而且，本方法稳定性好，在两个独立队列中都得到较好的诊断效果，填补了先天性巨结肠在早期诊断领域中的空白。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检验领域，具体涉及CMV与PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用。
背景技术
先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HSCR)是一种儿童肠神经发育异常的出生缺陷疾病，病理机制为肠神经嵴细胞迁移和分化成肠神经元发生障碍，导致肠神经缺乏而发生持续性痉挛，是小儿常见的先天性肠道疾病之一。先天性巨结肠的早期表现为呕吐、腹胀、腹泻等，临床上会造成新生儿死亡或手术后反复肠炎、难治性便秘等并发症，严重影响患儿的生长发育和生活质量。
先天性巨结肠的及时诊治可以减少先天性巨结肠肠炎发生的危险，获得良好的预后。该疾病确诊需要术后病变组织的病理切片。术前诊断方法主要为钡剂灌肠，直肠活检、直肠测压，以判断是否要实施“巨结肠根治术”。目前，钡灌肠为最重要的诊断方法，原理为先天性巨结肠患儿的肠道存在无神经节段的狭窄、近端的扩张，钡灌肠后可见扩张和狭窄段而诊断为巨结肠。但该方法只能诊断出有典型肠道形态改变的患儿，灵敏度需要提高，诊断的准确度80％左右。直肠活检是直接取直肠组织，检测是否有神经节细胞的缺失，准确率高，但取样部位对结果有影响。该方法为介入有创型，且价格非常高，一般情况下该方法应用于钡灌肠不明显，或不适用的患儿，比如当患儿有坏死性小肠结肠炎(NEC)这种可能的时候，钡灌肠会导致肠穿孔，这种时候不适合用钡灌肠去诊断，才考虑用直肠活检。直肠测压是通过检测肛门内括约肌的松弛缺乏判定肠神经的支配异常，仅为辅助诊断方法，假阳性和假阴性都较多，不能用于单独检测。
此外，先天性巨结肠患儿大部分早在刚出生的新生儿期(一个月内)就会表现出新生儿腹胀、呕吐、肠梗阻等症状，但大部分从钡灌肠中不会看到明显的扩张和狭窄段。大多数患儿都是在3个月后经过反复的腹胀后，在钡灌肠下可见明显的扩张、狭窄段才诊断为巨结肠，确定行巨结肠根治术。由于引起早期新生儿腹胀可能的疾病还可能有肠紊乱、蛋白过敏、肠闭锁、肠狭窄、新生儿坏死性小肠结肠炎等，只有很少一部分是先天性巨结肠，钡灌肠又没有那么灵敏，这就给先天性巨结肠患儿的诊断或早期诊断带来了很大挑战。
因此，急需一种灵敏度高的诊断方法，特别是早期诊断方法，将这些先天性巨结肠患儿筛查出来，以便早干预，减少疾病的死亡率和改善预后。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出人巨细胞病毒(CMV)与PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用，基于CMV本身以及与PRDM9转座子融合的组合，均能够准确的诊断出儿童先天性巨结肠的患病情况，特别是联合诊断的AUC大于等于0.8899，检测特异性为82％以上，灵敏性为83％以上，具有极好的早期诊断效果。
本发明的第一个方面，提供人巨细胞病毒检测试剂在制备先天性巨结肠诊断产品中的应用。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
在本发明的一些优选实施方式中，所述检测剂为定量检测剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述诊断为早期诊断。
在本发明的一些实施方式中，所述早期诊断的诊断对象为年龄小于3个月的新生儿。
在本发明的一些优选实施方式中，所述早期诊断的诊断对象为年龄小于1个月的新生儿。
早期诊断新生儿是否患有先天性巨结肠，可以早干预，减少疾病的死亡率和改善预后。先天性巨结肠患儿大部分早期诊断为新生儿腹胀，但是新生儿腹胀中只有很少一部分是先天性巨结肠。目前先天性巨结肠诊断的年龄绝大部分为3个月及以后，更早的检测因为钡灌肠中缺乏明显的扩张和狭窄段，使诊断不准确；而且，钡灌肠检测、直肠活检方法具有有创性，对希望获得疾病确诊的新生儿患者及其父母均带来一定的身心痛苦；再次，直肠测压方法虽然无创，但其假阳性、假阴性率均较高，并不能有效和准确地对先天性巨结肠疾病进行确诊。
而本发明首次发现CMV独立或联合PRDM9转座子融合定量检测可作为先天性巨结肠的早期诊断，相对于传统诊断方法(钡灌肠等)，本发明所提供的检测方法不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有确诊时间更早、操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠早期诊断的替代或辅助检测手段。本发明通过对先天性巨结肠病毒因素的筛选，找到与先天性巨结肠密切相关的病毒CMV，并证实定量检测CMV对儿童先天性巨结肠的诊断，尤其是早期诊断，具有良好的诊断效果，在两个独立的检测队列中AUC分别达到了0.7173和0.8571的水平。同时CMV联合PRDM9转座子融合水平检测(参照发明人的在先授权专利CN 112852957B，CN 112708673B)，进一步提高了诊断或早期诊断先天性巨结肠的效果，在两个独立的检测队列中，联合检测的诊断效果分别为：AUC 0.9267(95％CI,0.8403to 1.000)，最佳界限对应特异性为91.48％，灵敏性为84.62％；AUC 0.8899(95％CI，0.7842to 0.9956)，最佳界限对应特异性为82.25％，灵敏性为83.33％。填补了先天性巨结肠在诊断尤其是早期诊断领域中的空白。
本发明的第二个方面，提供CMV联合PRDM9转座子融合的检测试剂在制备先天性巨结肠诊断产品中的应用。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
在本发明的一些优选实施方式中，所述检测剂为定量检测剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述诊断为早期诊断。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRDM9转座子融合的融合位点选自：
位于chr5:23299411的PRDM9-type I；和/或
位于chr5:23262356的PRDM9-type II-1；和/或
位于chr5:23245181的PRDM9-type II-2。
在本发明的一些实施方式中，所述早期诊断的诊断对象为年龄小于3个月的新生儿。
在本发明的一些优选实施方式中，所述早期诊断的诊断对象为年龄小于1个月的新生儿。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述CMV的检测试剂用于执行以下任一种方法：放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、生物质谱法、免疫印记法和酶联免疫吸附法，聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交以及HRM法。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRDM9转座子融合的检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
在本发明的一些实施方式中，所述聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、Taqman探针法、qPCR、竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。
在本发明的一些优选实施方式中，所述生物质谱法选自飞行质谱仪检测。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRDM9转座子融合检测试剂包括引物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述引物包括a～c中的至少一种：
a.用于检测PRDM9-type I的引物序列为SEQ ID NO：7～8；
b.用于检测PRDM9-type II-1的引物序列为SEQ ID NO：10～11；以及
c.用于检测PRDM9-type II-2的引物序列为SEQ ID NO：13～14。
在本发明的一些优选实施方式中，所述引物带有可检测的标记。
术语“标记”指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述标记是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发集团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述引物还包括用于检测PRDM9-typeI、PRDM9-typeII-1和PRDM9-typeII-2中至少一个所对应的野生型序列的内参引物。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述内参引物用于定量检测SEQIDNO：2、4和6所示的至少一个片段。
在本发明的一些优选实施方式中，所述内参引物包括d～f中的至少一种：
d.用于检测PRDM9-typeI所对应的野生型序列的引物序列为SEQ ID NO：7和9；
e.用于检测PRDM9-typeII-1所对应的野生型序列的引物序列为SEQ ID NO：12和11；以及
f.用于检测PRDM9-typeII-2所对应的野生型序列的引物序列为SEQ ID NO：13和15。
在本发明的一些优选实施方式中，所述检测试剂中还含有DNA提取试剂、双链特异性荧光染料、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述双链特异性荧光染料定量选自溴化乙锭、SYBR Green、Pico Green、Ribo Green中的任一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水。水可以为蒸馏水(Distilled Water)、去离子水(Deionized Water)或反渗水(Reverse osmosisWater)。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
根据本发明的第一或二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂。在本发明的一些优选实施方式中，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
根据本发明的第一或第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂或试剂盒的受试样品选自血液、血浆、血清、粪便、尿液、唾液、羊水、绒毛、组织、细胞、组织或细胞裂解物样品中至少一种；在本发明的一些优选实施方式中，所述试剂或试剂盒的受试样品为血液、血浆或血清，更优选为来自外周血的血液、血浆或血清。
在本发明的一些优选实施方式中，检测样品为血液；在本发明的一些更优选实施方式中，检测样品来自外周血。
根据本发明的第一或第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述CMV检测试剂包括CMV抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述CMV抗体为CMV lgM抗体。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，该产品对于先天性巨结肠的诊断方法为：使用如上所定义的定量检测剂定量测量检测样品中所述PRDM9转座子融合的融合位点和CMV抗体。
PRDM9转座子融合的融合位点检测是与对照组(例如健康人)比较而得出结论。升高或者降低通常是显著性的，确定受试者和健康群体的初始状态(baseline)相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
在本发明的一些实施方式中，本发明试验结果均采用统计学分析，t检验用来评估两组间的差异，机器学习评估转座子融合在性别、年龄、疾病表型等临床参数方面的差异，统计方法为altmann。p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用R和Graphpad8.0软件进行。
本发明的第三个方面，提供一种先天性巨结肠诊断产品，该产品中包括CMV的检测试剂和PRDM9转座子融合的检测试剂。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PRDM9转座子融合检测试剂包括引物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述引物包括a～c中的至少一种：
a.用于检测PRDM9-type I的引物序列为SEQ ID NO：7～8；
b.用于检测PRDM9-type II-1的引物序列为SEQ ID NO：10～11；以及
c.用于检测PRDM9-type II-2的引物序列为SEQ ID NO：13～14。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述CMV检测试剂包括CMV抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述CMV抗体为CMV lgM抗体。
本发明的有益效果是：
1.本发明利用CMV作为主要标志物，进行儿童先天性巨结肠的诊断，尤其是早期诊断的研究，发现具有良好的诊断效果，在两个独立的检测队列中AUC分别达到了0.7173和0.8571的水平。
2.本发明同时联合CMV和PRDM9转座子融合水平检测，提高了先天性巨结肠的诊断或早期诊断效果，对早期巨结肠患儿的诊断达到了优秀的水平。在两个独立的检测队列中，诊断效果分别为：AUC＝0.9267(95％CI，0.8403to 1.000)，最佳界限对应特异性为91.48％，灵敏性为84.62％；AUC＝0.8899(95％CI，0.7842to 0.9956)，最佳界限对应特异性为82.25％，灵敏性为83.33％。
3.本发明具有确诊时间更早、操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠诊断或早期诊断的替代或辅助检测手段。而且，本方法稳定性好，在两个独立队列中都得到较好的诊断效果，填补了先天性巨结肠在诊断以及早期诊断领域中的空白。
附图说明
图1为本发明实施例中的筛查得到的先天性巨结肠密切有关的病毒，其中，标红的为CMV感染与巨结肠严重程度密切相关的数据；
图2为本发明实施例中的CMV抗体在不同月龄的先天性巨结肠患儿中与其它类型腹胀患儿血清中的含量对比；其中，A为lgG抗体，B为lgM抗体；
图3为本发明实施例中先天性巨结肠患儿和非先天性巨结肠患儿的CMV lgM抗体和PRDM9转座子融合联合早期诊断先天性巨结肠的诊断效果；其中，A为PRDM9-type I含量，B为PRDM9-type II-1含量，C为PRDM9-type II-2含量，D为PRDM9-TE ratio，E为CMV lgM含量，F为ROC曲线；
图4为本发明实施例中的另外一个腹胀队列验证CMV lgM抗体和PRDM9转座子融合联合早期诊断先天性巨结肠的诊断效果；其中，A为PRDM9-type I含量，B为PRDM9-type II-1含量，C为PRDM9-type II-2含量，D为PRDM9-TE ratio，E为CMV lgM含量，F为ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。
本文使用的术语”CMV”为巨细胞病毒，是乙型疱疹病毒亚科的一个属，其先天感染与出生缺陷性疾病有密切关系。
本发明所述“转座子”是指一段可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的DNA序列。
本发明所述“PRDM9转座子融合”是指位于PRDM9上游调控区域二个位点有转座子融合(PRDM9-type I，PRDM9-type II-1，PRDM9-type II-2)。PRDM9-type I的命名是无神经节段下调为type I的转座子，位于人第5号染色体的第23299411位(hg19)。PRDM9-type II-1，PRDM9-type II-2的命名是无神经节段上调为type II的转座子，type II有两个位点分别命名为1和2，分别位于第5号染色体的第23262356位和第23245181位(hg19)。其未发生融合的序列分别如SEQ ID NO：2、4和6所示，融合序列为SEQ ID NO：1、3和5所示，是本发明的有效标记物。
本发明所述“先天性巨结肠疾病”又称希尔施普龙病，是由于结肠缺乏神经节细胞导致肠管持续痉挛，粪便淤滞于近端结肠，近端结肠肥厚、扩张，是小儿常见的先天性肠道疾病之一，其中对于先天性巨结肠疾病而言，按照严重程度递增，临床上可分为短段型，普通型，长段型，全结肠型。短段型病变位于直肠近、中段，距肛管不超过6.5cm；常见型病变位于直肠近端或直肠乙状结肠远端，距肛管约9cm；长段型病变延至乙状结肠或降结肠；全结肠型病变波及全部结肠及回肠末端，距回盲瓣30cm以内。
本发明所述“早期诊断”是指对具体疾病的早期诊断。先天性巨结肠目前的诊断时间是3个月-3岁，先天性巨结肠疾病的早期诊断，是指对3个月内的新生儿进行诊断，优选在年龄为1个月内的有新生儿腹胀、胎粪延迟、新生儿肠梗阻、新生儿便秘等症状的新生儿进行的早期诊断。
本发明所述“ROC曲线”是1-特异性(假阳性率)和敏感性(真阳性率)变化的曲线，反应了二分类器的诊断能力。一个好的分类器真阳性率与假阳性率的变化比值是大于1的，远离45度直线。
本发明所述“AUC”是指ROC曲线下面积，介于0.1和1之间，用于评价分类器的好坏，越接近1分类器越好，在应用ROC下AUC诊断疾病的领域，一般其AUC达到0.55或以上则具有一定的临床应用价值。
本发明所述PRDM9-TE异常融合水平用PRDM9-TE ratio来表示，PRDM9-TE ratio＝PRDM9-typeII-1+PRDM9-typeII-2-PRDM9-typeI；CMV联合PRDM9-TE异常融合水平拟合为0.1×CMV lgM+PRDM9-TE ratio，该拟合参数参考逻辑回归的参数得到。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1.血浆、血中DNA和组织样本采集和分组
取样分为巨结肠队列和新生儿腹胀队列，具体为：
(1)巨结肠队列：
(a)血液样品：
在巨结肠队列中，血液DNA样品分为先天性巨结肠患儿组(32例)，其它肠病对照组(16例)，健康儿童组(27例)，年龄介乎3个月到3岁，3/4为男性，疾病组和对照组年龄和性别匹配。
所有样品来源于广州市妇女儿童医疗中心，健康儿童组为健康儿童体检后剩余血样。
采血方式为抗凝采血，离心分离白细胞提取DNA。
(b)组织样品：
结肠组织样品为52个先天性巨结肠患儿手术切除的病变组织，包括有神经节段和无神经节段。
(2)新生儿腹胀队列：
收集诊断为新生儿腹胀的新生儿，年龄在1个月内的全血，并进行后续随访，随访时间为一年。
实施例2.CMV感染作为判断巨结肠严重程度的指示作用
为了研究CMV感染与巨结肠的严重程度之间的关联性，发明人对上述实施例中提取的组织样品中病毒感染和HSCR亚型(短段型，常见型，长段型，全结肠)的相关性进行比对分析。
通过比对149种人类病毒在组织样品中的基因组上的整合情况，来判断组织样品中病毒的感染情况。其中，在排除掉感染人数低于8％的病毒后，发明人发现巨结肠组织样品中共发现28种病毒在肠道中有整合，其中只有CMV与巨结肠亚型显著相关，而且，在严重的巨结肠病人(全结肠和长段型)中，CMV感染比率远远高于轻微的巨结肠病人(短段型和常见型)(见图1)。这些结果提示CMV感染跟巨结肠相关。
实施例3.CMV lgM抗体在先天性巨结肠患儿中异于其它类型腹胀
基于上述实施例的结果，发明人进一步对此进行试验验证。
发明人分别以先天性巨结肠新生儿腹胀新生儿冻存血清和非先天性巨结肠新生儿腹胀新生儿冻存血清进行比对，以此探究新生儿期的CMV感染是否与HSCR发生有关。
其中，所选新生儿腹胀病人共计159例，100例小于1个月，59例为1～2个月的新生儿。
结果如图2所示。
通过检测血清中CMV lgM和lgG的含量(检测方法采用本领域常规的实验室检测方法，在下述实施例中，均使用ELISA方法进行检测)。发明人发现，在新生儿时期，最终被确诊为巨结肠的新生儿腹胀患者体内的CMV lgM抗体显著高于非巨结肠新生儿腹胀患者。而且，在在诊治的1～2个月中，还发现这些被确诊巨结肠的患儿的CMV lgM会出现显著降低，但lgG会显著升高。这种相反的变化常常预示了急性CMV感染，由此可知，新生儿期的CMV感染与先天性巨结肠有关，检测新生儿中CMV lgM抗体，可以为先天性巨结肠的早期诊断提供有力的证据。
实施例4.CMV联合PRDM9转座子融合用于早期诊断先天性巨结肠的诊断效果
PRDM9-TE融合在先天性巨结肠中的诊断效果参照发明人的在先授权专利(CN112852957B，CN 112708673B)，PRDM9-TE融合用于先天性巨结肠中的诊断的灵敏性为100％时，特异性为76.74。由此可见，PRDM9转座子融合可以有效诊断和筛选先天性巨结肠，表现出很好的效果。
在本实施例中，PRDM9的三个转座子融合位置为chr5 23299411，23262356，23245181，三者序列及对照序列如下所示。
PRDM9-type I位于人第5号染色体的第23299411位(chr5 23299411)，其核苷酸序列为：5’-GGGTGACAGAGTGAGACTCCATCTCAAAAATTTAAAAAAAAAAAAAAAAGCCTGTGGTTATTTTGATGGGATAGCAAGGATAACATGAACCATGTAAGGTTTGGCATAAATAGTTCATAGTTTACCTGGTCTGTCTGACTGTCTGAGATGTCACTGAGTCATTTGATGACCTTGAAATGCTAAAGCATTGGAATGAATGTCTGTAGATCAGGACAGAGGTGGGTTCAGAGAACTATTTAGGAGACATCTGGGTGGGAGTTGTGGCCAAC-3’(SEQ ID NO.1)；
其未发生融合的野生型序列(wt1)为：5’-GGGTGACAGAGTGAGACTCCATCTCAAAAATTTTATTTCCTTAACAAGTACTTATTTTTTTATTTTTATTTTTTTAAGACTAGTCAAGTGCAATAATGAGAAGGAGGAAAAGAGTAGAACAGAAGTTCGATCTGTGACTGTGAACAATCAATTGAGATAATGCGTTATCTCTGGACAAGCCTCTTCAAGTATTTAATGAACACATTATAATCATATTGAACTAATTTTAAAATTATGTAATTTATATAAACTTATATGTAAATTGCACAT-3’(SEQ ID NO.2)。
PRDM9-type II-1位于人第5号染色体的第23262356位(chr5 23262356)，其核苷酸序列为：5’-AACCTTCTCACTGAATAGAGCTCTAGGAAGCAAATAAAAAGGAAAAAATGTTTTTACAACAAAGGTAACCAAAAATCACATAATTTTCGCATGAAAAATCTTTTTTAGTCCAGGTACAGTGGCTCATGCCTATAATTCCAGCACCTTGAGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAG-3’(SEQ ID NO.3)；
其未发生融合的野生型序列(wt2)为：5’-TTCAAAAACACAAAATATTCTGGGGGGATTGGGTTTTATCCCGGTTTAAAGCTGAAACCACTTTAAGGCATGTTGTGGCAATACAGTGATGGCAGGGTGGTTCTGGAAACTGTTAAATCTACAGTGTTCAGCTAACAAAAAGAATGTTTTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAG-3’(SEQ ID NO.4)。
PRDM9-type II-2位于人第5号染色体的第23245181位(chr5 23245181)，其核苷酸序列为：5’-TATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAGTCTCACTCTGTCGTCCAGGCTGGAGTGCAGTGGAGTGATCTTGGCTCACTACATTTCTCTCTTAGGTTCAAGCGATTCTTCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTAGAATTACAGGCATGCACCACCACGCCCAGTTAATTTTTGTATTTT-3’(SEQ ID NO.5)；
其未发生融合的野生型序列(wt3)为：5’-TATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAAATACAGTGTTTCCTCTTCCAATTTTGAGAAGATTTCTTATTTTTAAAGGTTTGTCTCAAAGTATATACATGCATATTTTTCATTTAAATCATTTTTCCTTTTCTTAGCTTTGAAATATGTCTTTCATTATATATTTTCCTGAAATGCCT-3’(SEQ ID NO.6)。
每个融合位点设计2对引物，分别检测野生型(wt)和融合型的DNA水平，其中野生型用来做内参，引物序列如下所示。
PRDM9-type I的引物对：
上游引物F：5’-GGGTGACAGAGTGAGACTCCA-3’(SEQ ID NO.7)；
下游引物R：5’-CTGAACCCACCTCTGTCCTG-3’(SEQ ID NO.8)。
PRDM9-type I的内参wt1的引物对：
上游引物F：5’-GGGTGACAGAGTGAGACTCCA-3’(SEQ ID NO.7)；
下游引物R：5’-TTGAAGAGGCTTGTCCAGAGA-3’(SEQ ID NO.9)。
PRDM9-type II-1的引物对：
上游引物F：5’-GCTCTAGGAAGCAAATAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO.10)；
下游引物R：5’-CTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.11)。
PRDM9-type II-1的wt2的引物对：
上游引物F：5’-ATTGGGTTTTATCCCGGTTT-3’(SEQ ID NO.12)；
下游引物R：5’-CTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.11)。
PRDM9-type II-2的引物对：
上游引物F：5’-TATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO.13)；
下游引物R：5’-AAAATTAACTGGGCGTGGTG-3’(SEQ ID NO.14)。
PRDM9-type II-2的wt3的引物对：
上游引物F：5’-TATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO.13)；
下游引物R：5’-TGCATGTATATACTTTGAGACAAACC-3’(SEQ ID NO.15)。
采用PCR方法检测PRDM9转座子融合。
为了进一步验证联合CMV lgM抗体和PRDM9转座子融合水平(PRDM9-typeI，PRDM9-typeII-1和PRDM9-typeII-2)是否能在先天性巨结肠的诊断中，尤其选择早期诊断中，达到更好的甚至协同的效果，发明人收集了一个新生儿腹胀队列(n＝34)，这个队列来源于1个月内因为不明原因腹胀而入住NICU的儿童，对这些患儿，发明人进行了至少半年的电话随访(2019-2020)，并最终确认这个队列中共13个新生儿为巨结肠病人，16个为其他肠疾病对照(包括肛门闭锁、肠狭窄等)。另外15个胃肠功能紊乱患者作为非器质性病变的对照。使用上述的引物对其样品DNA进行qPCR，分析PRDM9-TE融合水平，对其血清使用ELISA来检测CMVlgM的水平。PRDM9-TE异常融合水平用PRDM9-TE ratio来表示，其中，PRDM9-TE ratio＝(PRDM9-type II-1)+(PRDM9-type II-2)-(PRDM9-type I)；用同一个人对应的血清做ELISA检测CMV的lgM抗体的水平，CMV联合PRDM9-TE异常融合水平拟合为0.1×CMV+PRDM9-TE ratio。
结果如图3所示。
可以发现，PRDM9-TE识别巨结肠和非巨结肠的AUC可以到0.8425(95％CI，0.7122to0.9728)。CMV lgM抗体在巨结肠中的含量也高于非巨结肠，AUC为0.8571(95％CI，0.7290to0.9853)。将两者联合检测用于区分巨结肠和非巨结肠的AUC相比单一检测有显著提高，可以达到0.9267(95％CI，0.8403to 1.000)。两者达到最佳界限时对应的特异性为91.48％，灵敏性为84.62％。此结果表明PRDM9-TE融合和CMV感染可以协同有效的预测巨结肠的发生，两者联合应用可以作为巨结肠的诊断或早期诊断的有效标志物组合。
实施例5.冻存样品的腹胀队列验证CMV联合PRDM9转座子融合诊断先天性巨结肠的效果
为了进一步评估以上联合诊断标志物(CMV lgM抗体和PRDM9转座子融合)的诊断效果的稳定性，发明人用同时冻存有DNA和血清的一个回顾性的新生儿腹胀队列作为试验对象进行验证性试验。
该新生儿腹胀队列的患儿共40例，包括先天性巨结肠患儿组(12例)；非先天性巨结肠患儿组(28例)，非先天性巨结肠患儿包括其它肠病15例(包括肠闭锁、肠狭窄、新生儿坏死性小肠结肠炎)，生理性腹胀13例。
用冻存的DNA基于上述引物进行qPCR，检测PRDM9-TE融合的位点的水平，然后用同一个人对应的血清做ELISA检测CMV的lgM抗体的水平。
结果如图4所示。
可以发现，CMV lgM单独区分新生儿腹胀中巨结肠和非巨结肠时，AUC值仅为0.7173(95％CI，0.5477to 0.8868)；PRDM9-TE融合位点单独区分新生儿腹胀中巨结肠和非巨结肠时，AUC值为0.8363(95％CI，0.6894to 0.9892)。而当两者联合诊断时，AUC可以达到更优秀的协同诊断效果，AUC提升至0.8899(95％CI，0.7842to 0.9956)；最佳界限对应特异性为82.25％，灵敏性为83.33％。由此可见，CMV的lgM抗体和PRDM9转座子融合的联合可以用于先天性巨结肠的诊断，尤其是早期诊断，且具有相对单一性检测更加优异的特异性和灵敏度，达到了协同作用，与实施例4的结果吻合。
综上所述，本发明实施例通过验证发现联合CMV感染情况和PRDM9转座子融合情况，可以定性检测儿童先天性巨结肠，尤其是早期诊断，具有良好的诊断效果，而当其分开单独用于儿童先天性巨结肠的检测时，AUC分别可以达到了0.7173和0.8571的水平。而当联合两者，共同作为检测标志物组合时，在两个独立的检测队列中，诊断效果分别为：AUC＝0.9267(95％CI，0.8403to 1.000)，最佳界限对应特异性为91.48％，灵敏性为84.62％；AUC＝0.8899(95％CI，0.7842to 0.9956)，最佳界限对应特异性为82.25％，灵敏性为83.33％。
综上所述，本发明通过对先天性巨结肠病毒因素的筛选，找到与先天性巨结肠密切相关的病毒CMV，并证实定量检测CMV对儿童先天性巨结肠的诊断，尤其是早期诊断，具有良好的诊断效果，在两个独立的检测队列中AUC分别达到了0.7173和0.8571的水平。同时CMV联合PRDM9转座子融合水平检测(参照发明人的在先授权专利CN 112852957B，CN112708673B)，进一步提高了诊断或早期诊断先天性巨结肠的效果，在两个独立的检测队列中，联合检测的诊断效果分别为：AUC 0.9267(95％CI,0.8403to 1.000)，最佳界限对应特异性为91.48％，灵敏性为84.62％；AUC 0.8899(95％CI，0.7842to 0.9956)，最佳界限对应特异性为82.25％，灵敏性为83.33％。
且本发明实施例中的检测方法具有确诊时间更早、操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠诊断或早期诊断的替代或辅助检测手段。而且稳定性好，在两个独立队列中都得到较好的诊断效果，填补了先天性巨结肠在诊断或早期诊断领域中的空白。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
本发明公开了CMV与PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠诊断标志物及其应用。其利用CMV独立或联合PRDM9转座子融合检测作为先天性巨结肠的标记物，相对于传统诊断方法(钡灌肠等)，本发明中的检测方法具有确诊时间更早、操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠诊断(尤其是早期诊断)的替代或辅助检测手段。而且，本方法稳定性好，在两个独立队列中都得到较好的诊断效果，填补了先天性巨结肠在诊断或早期诊断领域中的空白。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> CMV与PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 269
<212> DNA
<213> PRDM9-type I
<400> 1
gggtgacaga gtgagactcc atctcaaaaa tttaaaaaaa aaaaaaaaag cctgtggtta 60
ttttgatggg atagcaagga taacatgaac catgtaaggt ttggcataaa tagttcatag 120
tttacctggt ctgtctgact gtctgagatg tcactgagtc atttgatgac cttgaaatgc 180
taaagcattg gaatgaatgt ctgtagatca ggacagaggt gggttcagag aactatttag 240
gagacatctg ggtgggagtt gtggccaac 269
<210> 2
<211> 270
<212> DNA
<213> wt1
<400> 2
gggtgacaga gtgagactcc atctcaaaaa ttttatttcc ttaacaagta cttatttttt 60
tatttttatt tttttaagac tagtcaagtg caataatgag aaggaggaaa agagtagaac 120
agaagttcga tctgtgactg tgaacaatca attgagataa tgcgttatct ctggacaagc 180
ctcttcaagt atttaatgaa cacattataa tcatattgaa ctaattttaa aattatgtaa 240
tttatataaa cttatatgta aattgcacat 270
<210> 3
<211> 190
<212> DNA
<213> PRDM9-type II-1
<400> 3
aaccttctca ctgaatagag ctctaggaag caaataaaaa ggaaaaaatg tttttacaac 60
aaaggtaacc aaaaatcaca taattttcgc atgaaaaatc ttttttagtc caggtacagt 120
ggctcatgcc tataattcca gcaccttgag actttttttt tttttttttt tttttttttt 180
tttgagacag 190
<210> 4
<211> 190
<212> DNA
<213> wt2
<400> 4
ttcaaaaaca caaaatattc tggggggatt gggttttatc ccggtttaaa gctgaaacca 60
ctttaaggca tgttgtggca atacagtgat ggcagggtgg ttctggaaac tgttaaatct 120
acagtgttca gctaacaaaa agaatgtttt actttttttt tttttttttt tttttttttt 180
tttgagacag 190
<210> 5
<211> 187
<212> DNA
<213> PRDM9-type II-2
<400> 5
tattcttttt tttttttttt tttttttttt ttttacagtc tcactctgtc gtccaggctg 60
gagtgcagtg gagtgatctt ggctcactac atttctctct taggttcaag cgattcttct 120
gcctcagcct cctgagtagc tagaattaca ggcatgcacc accacgccca gttaattttt 180
gtatttt 187
<210> 6
<211> 187
<212> DNA
<213> wt3
<400> 6
tattcttttt tttttttttt tttttttttt ttttacaaat acagtgtttc ctcttccaat 60
tttgagaaga tttcttattt ttaaaggttt gtctcaaagt atatacatgc atatttttca 120
tttaaatcat ttttcctttt cttagctttg aaatatgtct ttcattatat attttcctga 180
aatgcct 187
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggtgacaga gtgagactcc a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgaacccac ctctgtcctg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttgaagaggc ttgtccagag a 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctctaggaa gcaaataaaa agga 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aaa 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
attgggtttt atcccggttt 20
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tattcttttt tttttttttt tttttt 26
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaaattaact gggcgtggtg 20
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgcatgtata tactttgaga caaacc 26
Claims (4)
1.CMV lgM抗体的检测试剂联合PRDM9转座子融合的检测试剂在制备先天性巨结肠诊断产品中的应用；
所述产品包括检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒；
所述检测的待检样本为血液、血浆或血清；
所述PRDM9转座子融合的融合位点选自：
位于chr5: 23299411的PRDM9-type I；和/或
位于chr5:23262356的PRDM9-type II-1；和/或
位于chr5: 23245181的PRDM9-type II-2；
所述早期诊断的诊断对象为年龄小于3个月的新生儿。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断对象为年龄小于1个月的新生儿。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CMV lgM抗体的检测试剂用于执行以下任一种方法：放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、生物质谱法、免疫印记法和酶联免疫吸附法，变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱法；
所述PRDM9转座子融合的检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PRDM9转座子融合检测试剂包括引物；
所述引物包括a~c中的至少一种：
a.用于检测PRDM9-type I的引物序列为SEQ ID NO：7~8；
b.用于检测PRDM9-type II-1的引物序列为SEQ ID NO：10~11；以及
c.用于检测PRDM9-type II-2的引物序列为SEQ ID NO：13~14。
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| 梁彪等.新生儿、小婴儿先天性巨结肠诊疗进展.《中国妇幼保健》.2007,第22卷(第28期),第4045页第1.3节. * |
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