CN115094131A

CN115094131A - 一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用

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Publication number: CN115094131A
Application number: CN202210671109.2A
Authority: CN
Inventors: 张盛洪; 王莹; 韩婧
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN115094131B

Abstract

本发明了公开了一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用。本发明首次公开了SPINK4作为IBD诊断的血浆及肠道组织标志物，并通过实验首次发现了SPINK4在IBD患者血浆中呈现上调表达，提示SPINK4可能在IBD的疾病活动及预后评估中存在重要的临床价值；经检测发现SPINK4在IBD患者血浆标本中表达升高，进一步通过ROC曲线分析SPINK4相比于其他CRP、ESR、Hb、Ht、PLT等炎症活动指标而言，具有较好的诊断敏感度和特异性。

Description

一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及炎症性肠病检测技术领域，更具体地，涉及一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)主要是由肠道微生物群和免疫系统紊乱而引起的慢性非特异性肠道炎性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease，简称CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，简称UC)。IBD在全球范围内影响较大，据统计，IBD患病在美国约100万人，在欧洲约250万人，在全球范围内的人数更多，并且IBD的诊疗费用也相对较高。研究表明，越早确定IBD的活动性越能降低手术率和病死率。影响IBD发生发展的主要因素包括肠道免疫系统的功能失调、肠道微生态紊乱以及宿主的遗传背景等。

但是，IBD的发病机制及关键分子还远未阐明，仍然缺乏活动性诊断的金标准。临床上主要依靠内镜和病理检查来评估，但是内镜操作的侵袭性、长期随访的可行性以及操作者的主观性等因素影响了其临床诊断价值。当下针对于IBD疾病活动度的评估主要依赖于：1)实验室指标：血浆炎症指标(包括CRP、ESR、ALB等)；2)粪便炎症指标(以粪钙卫蛋白为主)；3)疾病活动度评分：包括内镜及临床评分，其中内镜评分主要包括克罗恩病的SESCD评分、CDEIS评分、术后的Rutgeerts评分，溃疡性结肠炎的UCEIS评分，临床评分主要包括CD的CDAI评分和UC的Mayo评分。

针对于目前的实验室检查指标，血浆炎症指标不能将炎症靶向于胃肠道，而粪便钙卫蛋白检测结果的不稳定性导致肠道炎症的不准确评估，而针对于内镜或临床的综合评估一方面存在检查者的主观性偏倚，除此之外对于临床症状或内镜下表现较轻的活动性患者评估同样存在偏颇，而IBD疾病活动的评估对于指导患者下一步用药方案有着极其重要的作用，一定程度上决定患者的预后及生存质量。因此，通过易获得的具有高灵敏度和特异性的生物标志物来客观反映肠黏膜的炎症情况、判断IBD的活动性对于调整IBD患者的诊疗及管理显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测生物标志物的试剂在制备用于诊断炎症性肠病的产品中的应用，其特征在于，包括：a)鉴定受试者的样品中的生物标志物，其中所述生物标志物为SPINK4(NM_014471.3)；以及b)将所述生物标志物与参照进行比较，其中与参照相比的所述生物标志物的差异用于检测炎症性肠病。

进一步，所述样品为血浆或肠黏膜组织。

进一步，与参照相比，生物标志物表达水平上调。

进一步，所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR、新一代测序、原位杂交、芯片或免疫测定技术检测SPINK4的试剂，其不限于：

特异性识别SPINK4基因的探针；或

特异性扩增SPINK4基因的引物；或

特异性结合SPINK4编码的蛋白的抗体或配体。

优选地，所述SPINK4基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述SPINK4编码蛋白序列如SEQ ID NO.6所示；所述特异性扩增SPINK4基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步地，所述参照为健康人群。

本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括检测SPINK4水平的试剂。

特异性识别SPINK4基因的探针；或

特异性扩增SPINK4基因的引物；或

特异性结合SPINK4编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，所述特异性扩增SPINK4基因的引物序列如SEQID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了SPINK4作为炎症性肠病血浆标志物在制备监测IBD疾病活动情况的试剂或试剂盒中的应用。

特异性识别SPINK4基因的探针；或

特异性扩增SPINK4基因的引物；或

特异性结合SPINK4编码的蛋白的抗体或配体。

本发明的优点如下：本发明首次公开了SPINK4作为IBD诊断的血浆标志物，并通过实验首次发现了SPINK4在IBD患者血浆中呈现上调表达，提示SPINK4可能在IBD的疾病活动及预后评估中存在重要的临床价值；经检测发现SPINK4在IBD患者血浆标本中表达升高，尤其是在CD升高2.06倍，UC升高1.85倍；进一步通过ROC曲线分析SPINK4相比于其他CRP(C-reactive protein)、ESR(erythrocyte sedimentation rate)、Hb(haemoglobin)、Ht(Hematocrit)、PLT(platelet/lymphocyte Ratio)等炎症活动指标而言，具有较好的诊断敏感度和特异性。

附图说明

图1为是利用QPCR检测SPINK4基因在IBD患者肠黏膜组织中的表达情况图；

图2是利用ELISA检测SPINK4蛋白在IBD患者血浆中的表达情况图；

图3是SPINK4在CD患者中的ROC曲线分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1筛选与IBD相关的标志物

1、样品收集

收集10名患有克罗恩病(CD)和10名患有溃疡性结肠炎(UC)的患者以及10名健康人群的血液外周静脉血3mL并同期获取肠镜肠黏膜组织标本，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的入选标准是根据参考中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组对我国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年，广州)。排除标准是有明显消化系统其他肠道疾病；有自身免疫疾病及恶性肿瘤病史；未签署知情同意，未留取血样者。

健康对照的入选标准是无明确消化系统肠道疾病；无消化系统及其他系统恶性肿瘤病史；无自身免疫病史。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取肠道黏膜中总RNA，具体步骤详见说明书。利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建。使用试剂盒去除核糖体rRNA，向反应体系中加入fragmentation buffer将RNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加碱基A，连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，加UNG酶消化cDNA二链，最后进行PCR扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，使用建好的文库上机测序。

4、上机测序

使用Illumina Hiseq X-ten/Miseq测序平台，进行2*100bp/300bp测序，具体操作按说明书进行。

5、高通量转录组测序数据分析

使用TopHat将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，参考基因组来自于Ensembl V84，将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，使用R包limma package分析基因的差异表达，筛选标准是p<0.01。

6、结果

RNA-seq结果显示，SPINK4基因(NM_014471.3)在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中的表达水平显著高于正常人的表达量，提示SPINK4作为可能的个性化指标应用于炎症性肠病的诊断。

实施例2 QPCR验证肠黏膜组织中SPINK4基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择SPINK4基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的方法收集选择收集32名患有克罗恩病(CD)(n＝32)和24名患有溃疡性结肠炎(UC)(n＝24)的患者以及65名健康人群的肠镜肠黏膜组织2块。

2、RNA提取

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，具体步骤详见说明书。

3、逆转录

采用AG逆转录试剂盒进行反转录，具体操作详见说明书。

4、QPCR检测

4.1引物设计

根据编码SPINK4的基因(NM_014471.3)和β-ACTIN基因的序列设计QPCR扩增引物，由广州天一辉远基因科技有限公司合成。具体引物序列如下：

SPINK4：

正向引物为5’-CTCAAGAATGCCCATCTGTGAA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-TGTCCTGTTTGGTTTTTATCCG-3’(SEQ ID NO.2)。

β-ACTIN：

正向引物为5’-CACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TTCTCCATGTCGTCCCAGTTGGT-3’(SEQ ID NO.4)。

4.2QPCR扩增检验

采用AG公司

GreenPremix Pro Taq HS qPCR Kit II(Rox Plus)(SYBRGreen)进行扩增，在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量；实验操作按详见说明书。

5、结果

结果如图1所示，与正常人相比，SPINK4在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中的表达显著上调，差异具有统计学意义P<0.0001。说明SPINK4可作为个性化指标应用于炎症性肠病的诊断。

实施例3 ELISA验证血浆样本中SPINK4蛋白的差异表达

1、血浆样本获取

收集57名患有克罗恩病(CD)(n＝57)和48名患有溃疡性结肠炎(UC)(n＝48)的患者以及90名健康人群的血液样本，取3-5ml的血标本于EDTA抗凝管，将血标本于4度下离心1900g 10min，最上层即为血浆标本，小心吸取后，16000g 10min离心，获得上清，备用。

2、血浆样本ELISA分析

取步骤1中的250μL，采用义翘神州SPINK4 Elisa试剂盒(SEK11669)进行Elisa检测，具体的检测步骤如试剂盒说明书所述。

3、结果

结果如图2所示，与健康对照相比，SPINK4蛋白在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中的表达显著升高，差异具有统计学意义。

实施例4 SPINK4的检测灵敏度和特异性分析

采用受试者工作特性曲线(Receiver operator characteristic curve,ROCcurve)分析SPINK4对疾病诊断的效力，并划分最佳阀值分数。ROC曲线是以敏感度为纵坐标，以1-特异性为横坐标索绘制的曲线，可准确反映分析方法的特异性和敏感性，ROC曲线月凸近左上角表明诊断价值越大。曲线下面积(Area Under Curve，AUC)可评价诊断试验准确性。ROC曲线下面积范围在化0.5-1之间。在0.5时，说明该试验没有诊断价值，面积在0.5-0.7之间时，有较低的准确性，面积在0.7-0.9之间时，说明有一定准确性，面积>0.9时则有较高的准确性。ROC曲线还有助于选择最佳的诊断界值，并且比较不同诊断试验报告对疾病的识别能力，其目前是确定诊断试验界值的常用方法。

同时，为便于加强对比，本实验还分析了现有技术中已公开的CRP、ESR、Hb、Ht、PLT等炎症活动指标的ROC曲线下面积，结果如图3所示：进SPINK4标志物在CD患者中的ROC曲线下面积远大于CRP、ESR、Hb、Ht、PLT等炎症活动指标，其敏感度49％，特异度高达93％，说明SPINK4可作为个性化指标应用于炎症性肠病的诊断。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> 一种用于炎症性肠病的诊断标志物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ctcaagaatg cccatctgtg aa 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tgtcctgttt ggtttttatc cg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

cacagagcct cgcctttgcc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ttctccatgt cgtcccagtt ggt 23

<210> 5

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gcaggcccca gccagctcag gctacactat cccaggatca gcatggccgt ccgccagtgg 60

gtaatcgccc tggccttggc tgccctcctt gttgtggaca gggaagtgcc agtggcagca 120

ggaaagctcc ctttctcaag aatgcccatc tgtgaacaca tggtagagtc tccaacctgt 180

tcccagatgt ccaacctggt ctgcggcact gatgggctca catatacgaa tgaatgccag 240

ctctgcttgg cccggataaa aaccaaacag gacatccaga tcatgaaaga tggcaaatgc 300

tgatcccaca ggagcacctc aagccatgaa gtgtcagctg gagaacagtg gtgggcatgg 360

agaggatatg acatgaaata aaagatccag cccaactga 399

<210> 6

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Met Ala Val Arg Gln Trp Val Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Val Val Asp Arg Glu Val Pro Val Ala Ala Gly Lys Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Arg Met Pro Ile Cys Glu His Met Val Glu Ser Pro Thr Cys Ser Gln

35 40 45

Met Ser Asn Leu Val Cys Gly Thr Asp Gly Leu Thr Tyr Thr Asn Glu

50 55 60

Cys Gln Leu Cys Leu Ala Arg Ile Lys Thr Lys Gln Asp Ile Gln Ile

65 70 75 80

Met Lys Asp Gly Lys Cys

85

Claims

1.检测生物标志物的试剂在制备用于诊断炎症性肠病的产品中的应用，其特征在于，包括：a)鉴定受试者的样品中的生物标志物，其中所述生物标志物为SPINK4；以及b)将所述生物标志物与参照进行比较，其中与参照相比的所述生物标志物的差异用于检测炎症性肠病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品为血浆或肠黏膜组织。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与参照相比，生物标志物表达水平上调。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR、新一代测序、原位杂交、芯片或免疫测定技术检测SPINK4的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增SPINK4基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

6.一种产品，其特征在于，所述产品包括检测SPINK4水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR、新一代测序、原位杂交、芯片或免疫测定技术检测SPINK4的试剂。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增SPINK4基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

9.SPINK4作为炎症性肠病血浆或肠黏膜组织标志物在制备监测IBD疾病活动情况的试剂或试剂盒中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒中包括：用RT-PCR、实时定量PCR、新一代测序、原位杂交、芯片或免疫测定技术检测SPINK4的试剂。