CN109207585A - 免疫性血小板减少症lncRNA标志物及试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种免疫性血小板减少症lncRNA标志物及试剂盒和应用。该lncRNA标志物为LOC100506314，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；该lncRNA标记物的引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。将lncRNA标志物及其引物用于制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒。该lncRNA标记物能够用于判断免疫性血小板减少症的进程和严重程度；在其基础上开发的LOC100506314引物及诊断试剂盒和检测方法操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用临床监测疾病进展，对疾病发病、用药疗效、预后具有辅助诊断作用，具有明显的临床应用价值。

Description

免疫性血小板减少症lncRNA标志物及试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，尤其涉及一种免疫性血小板减少症lncRNA标志物及试剂盒和应用。

背景技术

原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种自身免疫性疾病，患者体内产生针对血小板特异性糖蛋白GPIIb-IIIa和GPIb-IX的自身抗体，进而引发单核/巨噬细胞Fc受体介导的血小板清除，导致血小板数量降低。其特点为血小板生成减少及破坏增加，临床以出血为主，出血风险随年龄而增加。ITP的病因十分复杂，涉及包括遗传、感染、免疫功能异常等在内的众多因素，目前普遍认为以免疫学发病机制为主，ITP治疗上多为对症治疗，疾病进展可产生脊髓或颅内出血，严重影响患者生活质量，也带来沉重的经济负担。在中国，儿童ITP的年发病率约为46/100万人口，成人为38/100万人口。ITP急性期一般六个月内自愈，但有20％-30％可发展为病程持续超过12个月、治疗较为棘手的慢性ITP和难治性ITP。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是真核细胞中一类转录本长度大于200个核苷酸的非编码RNA，以前被认为无生物学功能，是基因转录中的“暗物质”。但随着近年来的研究，发现lncRNA具有复杂的生物学功能，广泛参与细胞周期、代谢、凋亡及黏附运动等生理过程，其异常表达与包括自身免疫病在内的多种人类疾病密切相关。

最新研究已证实lncRNA-TMEVPG1可以作为增强子促进干扰素γ(IFNG)转录，并与Th1型转录因子T-bet，STAT1和STAT4表达有关，在免疫性血小板减少症发病中起重要作用，但目前针对lncRNA在免疫性疾病的研究仍处在起步阶段，有哪些lncRNA表达异常目前还存在争议。

发明内容

基于现有技术的研究缺陷，本发明的第一目的在于提供一种免疫性血小板减少症的lncRNA标志物，发明人在利用lncRNA芯片筛选了与ITP发病相关的lncRNA，应用PCR的方法首次在ITP者的外周血中检测出异常表达的LOC100506314，提出其能够作为ITP诊断及预后判断的生物标志物，LOC100506314作为ITP诊断标志物的价值至今尚未见文献报道；本发明的第二目的在于提供一种免疫性血小板减少症的lncRNA标志物的引物；本发明的第三目的在于提供lncRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用；本发明的第四目的在于提供lncRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用；本发明的第五目的在于提供一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒；本发明的第六目的在于提供一种检测免疫性血小板减少症的lncRNA标志物的方法。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种免疫性血小板减少症的lncRNA标志物，该lncRNA标志物为LOC100506314，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，具体如下：

AAACATACACACACCCCTGATTCCAGAAACACAACAGGAGCTGACTCAAAAGGGAGTGTCTGGTGCAGGCATGCAGGGAGGAAGAATGACTCTGAGCTTGACCATTCAACTTCGAAACTTTAACATCAATGGATCAGCACACACTGGTGTACGGTCTGCTATGCATGCAGCCCTGTGCTAGGCAAAAGAAGTATCAGACCAGGAACTGACAGCCTCACTGCAACAGGAAGAGAGGCTTCACACAATAAGCGTTTCATTCAACCAGGCTGGACCTGTGCTTATTGAGTTGAACATCACTGAGCACAAAATGCAAGCCAGACACCATAAGAGCTGTAAGGATGATAAAGATGTCTTTCTACCCTCGAGAGCTCTAAGTGTGGTCAGGAGAGAAACACATGCAAAGATTATGCTGGCTGGAAGGAAATGCTGGAATGAAGGTGGAAGCATTCTATTCATCTAAAAGCACCGGTAATTAACGATGCTAATAAATGTATAATCCCTTTGTAAACATCTCTTCACAAGGTCATAAAGAAGGAAGACTGAATGAAGGACGCCAGGCTTTCATTTTAGAATTAATTTTGTCATTGAATGCACTCACTGCATTATTTGATAGAGTACTTTTGCATTTGAAGTAGTACATTTGCCTTCTACCATCTCATTAACATTGCTTTCAACAGAATCAGAAATAACACAAACCACTGCAGGGTAATTTTGAATGCTCATTTGACTATGCAGTGACATCAAGTGGCGAGTTGAGGAATGATCATATGCTGTGTGAGAACTCCGTGTTAAAAATTCCATGGAGCCAGGCTAGACACCACATTTGGCACTTTCAGCTGTTTAGATTTCAGAGAATTAAAAGGAAATGGTCACCGACCTGCCTTTGATAGTACCCGTATACCCCTTCCCACCATAAGAAACCAGCGTTCCTTAGAGAAATGGCTAATTCTAGCTCTAGGGCAAGAAATGCTAAGATGTGCTCAAAACATCTCATTATACCAGCAAGCCAGGGAGCCATCAACGACTACTGGAGCTGTGTCAAAAGGACCAACAAACCAACTTGAAGAGGCTCCCGCTGGCCAACAGTGGGGCAATTAGAGCATCAATAAGAATAATATCTGTAACAAACTGAAACGTATCAAATATGTTTAAATTCATATGTTTATAATTACACTCAAAAAACGAAGATGCAGACCACTTTACCTTGAGGATGTTACAGAATGAAATTATCATTCTGAAAACTGGTAAATAAAGAGAAGGTATCAAGTAAGCATGTATCTGGCTTTTTCTATATGAAATAAAGGAAGCCAAATAGTAAACGAGGGGAAGTTTCTCTTTACTGAAATATTGCAGGTAATAAAAGAAGAAGGAGAAACAGAGAACATTATCGTTTTATGGCCTCTAATGGAACAAGACATCTAGGCAATGATGAACTATGGTCACCAACATCACTCAATCAGGGACAATCAGACACTGTGGGCCCCTGAAGGAAGTAAACACCACCACGTAGGAAATATTCTCACCAAAACTTCAAAAACTTGAATCTGATCTAGTCTTTAGTTTCAACTACTAATTTACAGGCAATACGGGGCTCAGAGGGATGTGGTAAAATGTCACGGAAATATAATCAGCAAAATCCAGTACAGATAATAAGAAGACAAATGATCCACAGATGGAAAGGAAGAATGTAAAGTTGTGTTGGTAAAGAAATTCACAGATTAATAAAAGCTTAAAAATGTACCATCA

另一方面，本发明还提供一种免疫性血小板减少症的lncRNA标志物的引物，该lncRNA标志物的引物的碱基序列为：

正向引物Forward(5'-3')为：CAGGGAGCCATCAACGACTA(如SEQ ID NO：2所示)

反向引物Reverse(5'-3')为：TTCAAGTTGGTTTGTTGGTCCT(如SEQ ID NO：3所示)。

再一方面，本发明还提供上述lncRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。

再一方面，本发明还提供上述lncRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。

再一方面，本发明还提供一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测外周血中LOC100506314的表达水平。

上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒含有免疫性血小板减少症的lncRNA标志物；所述lncRNA标志物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒含有lncRNA标志物的引物，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒还包括反转录体系和标准PCR反应体系。

上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒还包括内参基因β-actin；所述内参基因β-actin的引物序列为：

正向引物Forward(5'-3')为：GTGGCCGAGGACTTTGATTG(如SEQ ID NO：4所示)

反向引物Reverse(5'-3')为：CCTGTAACAACGCATCTCATATT(如SEQ ID NO：5所示)。

再一方面，本发明还提供一种检测免疫性血小板减少症的lncRNA标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，分离纯化外周血，抽提血液样本中的总RNA；

步骤二，将总RNA反转录为cDNA；

步骤三，通过荧光定量Q-PCR对cDNA和内参基因β-actin进行扩增检测LOC100506314的表达水平；

步骤四，进行统计分析评估。

上述的方法中，优选地，所述荧光定量Q-PCR采用的引物序列如SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示。

上述的方法中，优选地，所述内参基因β-actin采用的引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

本发明的有益效果：

(1)本发明的内参基因β-actin作为参照基因，在荧光定量PCR检测外周血中LOC100506314水平中，相对于其他的β2MG、Hsp90ab1、18sRNA等内参基因，β-actin在正常对照和ITP中具有更高的稳定性，内参的选择避免了由于疾病个体间差异造成的数据偏差，提高了检测结果的可信性和稳定性；

(2)本发明通过临床样本检测，发现新的外周血lncRNA标志物LOC100506314在免疫性血小板减少症中显著升高，且表达水平与患者血小板呈显著负相关；进一步分析发现在不同临床阶段，LOC100506314表达不同；慢性和难治性ITP患者中显著增高。

(3)在本发明lncRNA标志物基础上开发的诊断试剂盒检测方法操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用临床监测疾病进展，对疾病发病、用药疗效、预后具有辅助诊断作用，具有明显的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中健康对照组和ITP组外周血LOC100506314的表达水平示意图；

图2为本发明实施例1中ITP患者不同分期(初诊断+持续性、慢性期+难治性)外周血LOC100506314的表达水平；

图3为本发明实施例1中检测样本中LOC100506314水平与血小板水平的相关性分析示意图；

图4为本发明实施例2中LOC100506314水平对ITP的诊断价值的ROC曲线图；

图5为本发明实施例3中外周血水平LOC100506314水平对ITP患者慢性期+难治性的预测价值的ROC曲线图；

图6为本发明实施例3中外周血水平LOC100506314水平对ITP患者难治性的预测价值的ROC曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，其中包括使用材料及具体来源。但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下试剂、仪器的类型及型号，或性质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂。下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。

实施例1

1、临床样品的采集

发明人于2016年开始至今从解放军第100医院和苏大附院收集大量的免疫性血小板减少症患者,诊断标准均符合“成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识(修订版)”；同时选取体检中心健康正对照组，抽取外周血。此研究通过医院伦理委员会的批准，受试者均签署知情同意书。收集和后续实验各过程符合医学伦理道德要求并严格遵循，病例资料的保密原则。研究样品的采样、分装、保存条件一致。通过对病历资料的分析整理，发明人选择了80例符合下列标准的样品作为实时荧光定量PCR检测的实验样品。

正常人血小板为100-300×10⁹，ITP患者血小板<100×10⁹，当血小板为<30×10⁹时，必须进行积极治疗。新诊断患者为新确诊ITP病人，且之前无可靠的临床或实验室确诊证据；慢性患者为已经确诊为ITP且持续12月以上的病人。本次研究纳入ITP患者共80例，其中新诊断期ITP 20例，持续期ITP 20例，慢性ITP 25例，难治ITP 15例，正常对照40例。

2、血液中总RNA的抽提

2.1 PBMC的分离：以密度梯度离心法分离枸橼酸钠抗凝血中PBMC。以等量的生理盐水稀释枸橼酸钠抗凝的静脉血；向一干净的离心管内加入淋巴细胞分离液；将稀释后的血液沿离心管壁等体积缓慢加于淋巴细胞分离液上；以2300转/每分钟(rpm)的速度离心20分钟(min)；吸出单个核细胞层移入另一干净的离心管中加入5ml生理盐水，以1000rpm的速度离心10min；重复洗涤细胞2次，所得细胞沉淀即为PBMC。

2.2 RNA抽提

试剂TRIZOL试剂(Invitrogen life technologies)

氯仿上海化学试剂有限公司

异丙醇上海化学试剂有限公司

100％乙醇(上海化学试剂有限公司)

75％乙醇(以DEPC处理的水配制)

无RNA酶的水

2.2.1.将PBMC细胞加入TRIZOL试剂反复吹打使细胞裂解。每5-10×10⁶的细胞使用1ml TRIZOL试剂，避免在加入TRIZOL试剂进行裂解前清洗细胞，因为清洗会很可能导致mRNA的降解。

2.2.2两相分离

匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1mL的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

2.2.3 RNA沉淀

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mL TRIZOL试剂的此时加0.5mL的异丙醇。混匀后15℃到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

2.2.4 RNA清洗

移去上清液，每1mL TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1mL的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7500×g离心5分钟。

2.2.5重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55℃到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

3.逆转录为cDNA：

试剂：RNA酶抑制剂(Epicentre)

SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(Invitrogen)

5×RT缓冲液(Invitrogen)

2.5mM dNTP混合液(HyTest Ltd)

Primer(英骏生物技术有限公司)

3.1配制退火混合物

RNA 1.5μg

0.5ug/ul Oligo(dT)18 1μl

dNTPs Mix(2.5mM) 1.6μl

加无RNA酶的H₂O至总体积 14.5μl

混合液在65℃水浴5分钟,冰上放置2分钟。

3.2短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液

混合后37℃恒温1分钟。移液枪轻轻吸打几次混合均匀；50℃温育60分钟；70℃温育15分钟使酶失活；cDNA置冰浴待用或-20℃保存。

4.实时荧光定量PCR检测LOC100506314表达

试剂：2×PCR master mix(Arraystar)

4.1针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：

特异引物F(5'-3')序列为：CAGGGAGCCATCAACGACTA(如SEQ ID NO：2所示)；

特异引物R(5'-3')序列为：TTCAAGTTGGTTTGTTGGTCCT(如SEQ ID NO：3所示)。

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒；收集荧光)。

4.2进行Realtime PCR反应

4.2.1将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

特异引物F(5'-3')序列为：CAGGGAGCCATCAACGACTA(如SEQ ID NO：2所示)；

特异引物R(5'-3')序列为：TTCAAGTTGGTTTGTTGGTCCT(如SEQ ID NO：3所示)。

4.2.2加样：将8μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μlcDNA，小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

4.2.3将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光)。

为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。

5.数据处理与分析

将定量PCR结果以2-ΔΔCT表示。ΔΔCT＝[ΔCT(ITP)]–[ΔCT(健康对照)]，ΔCT＝[CT(lncRNA)]–[CT(内参基因)]。采用Graphpad prism6.0进行统计分析，组间均值比较采用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关。P<0.05为差异具有统计学意义。

结果如图1和表1所示，ITP患者LOC100506314水平明显高于健康对照，差异具有显著的统计学意义(P<0.001)。

表1ITP和正常对照外周血LOC100506314水平

经Graphpad软件进行统计分析，获得健康对照组和ITP组外周血LOC100506314的表达水平示意图，见图1；由图1可见ITP患者外周血LOC100506314的表达水平明显高于健康对照组，差异具有显著的统计学意义(P<0.001)。

ITP患者外周血LOC100506314不同分期(新诊断+持续期，慢性期+难治期)比较，见图2；由图2可见外周血LOC100506314的表达水平在ITP早期初步增高，随着ITP的发展，LOC100506314水平逐渐增高，中晚期(慢性期+难治期)比早期(初诊断+持续期)表达显著增高(P<0.001)；因此检测LOC100506314水平，可用于ITP的分期鉴别。

检测样本中LOC100506314水平与血小板水平的相关性分析示意图如图3所示；由图3可知LOC100506314水平与血小板呈明显负相关(R＝-0.5839，P<0.001)，P<0.05认为具有统计学意义；由此可以确定，LOC100506314在免疫性血小板减少症患者外周血液中明显升高，且随着疾病进展不同表达不同。LOC100506314可以作为ITP检测分子标志物。

实施例2

应用ROC曲线分析LOC100506314水平对ITP的诊断价值。在120例检测对象中，以ITP患者为靶对象，利用Graphpad软件做出ROC曲线，并分析相关的各种参数。如图4所示，曲线下面积达到0.918±0.024(P<0.001)，说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数Youden’s index最大的原则，判断出LOC100506314的最佳临界值为1.971，对应的敏感性、特异性分别为73.75和97.5％，见表2所示。

表2：

实施例3

应用ROC曲线分析外周血LOC100506314水平对ITP患者临床分期的预测价值。在80例ITP患者中，以慢性断+难治期患者为靶对象，利用Graphpad软件做出ROC曲线，并分析相关的各种参数。如图5所示，曲线下面积达到0.949±0.021(P<0.001)，提示诊断价值较高，说明具有较好的预测价值。利用约登指数最大的原则，判断出LOC100506314的最佳临界值为2.060对应的敏感性和特异性分别为77.5％和100％，见表2所示。以难治期患者为靶对象，如图6所示，ROC曲线下面积达到0.958±0.026(P<0.001)，说明对于新诊断期ITP患者具有较好的预测价值。利用约登指数最大的原则，判断出LOC100506314的最佳临界值为2.310，对应的敏感性、特异性分别为80％和100％。

综上所述，本发明外周血lncRNA标志物LOC100506314在免疫性血小板减少症中显著升高，且表达水平与患者血小板呈显著负相关；进一步分析发现在不同临床阶段，LOC100506314表达不同；慢性和难治性ITP患者中显著增高。在本发明lncRNA标志物基础上开发的诊断试剂盒检测方法操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用临床监测疾病进展，对疾病发病、用药疗效、预后具有辅助诊断作用，具有明显的临床应用价值。本发明的检测方法采用的内参基因β-actin作为参照基因，在荧光定量PCR检测外周血中LOC100506314水平中，相对于其他的β2MG、Hsp90ab1、18sRNA等内参基因，β-actin在正常对照和ITP中具有更高的稳定性，内参的选择避免了由于疾病个体间差异造成的数据偏差，提高了检测结果的可信性和稳定性。

序列表

<110> 中国人民解放军第一00医院

<120> 免疫性血小板减少症lncRNA标志物及试剂盒和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

aaacatacac acacccctga ttccagaaac acaacaggag ctgactcaaa agggagtgtc 60

tggtgcaggc atgcagggag gaagaatgac tctgagcttg accattcaac ttcgaaactt 120

taacatcaat ggatcagcac acactggtgt acggtctgct atgcatgcag ccctgtgcta 180

ggcaaaagaa gtatcagacc aggaactgac agcctcactg caacaggaag agaggcttca 240

cacaataagc gtttcattca accaggctgg acctgtgctt attgagttga acatcactga 300

gcacaaaatg caagccagac accataagag ctgtaaggat gataaagatg tctttctacc 360

ctcgagagct ctaagtgtgg tcaggagaga aacacatgca aagattatgc tggctggaag 420

gaaatgctgg aatgaaggtg gaagcattct attcatctaa aagcaccggt aattaacgat 480

gctaataaat gtataatccc tttgtaaaca tctcttcaca aggtcataaa gaaggaagac 540

tgaatgaagg acgccaggct ttcattttag aattaatttt gtcattgaat gcactcactg 600

cattatttga tagagtactt ttgcatttga agtagtacat ttgccttcta ccatctcatt 660

aacattgctt tcaacagaat cagaaataac acaaaccact gcagggtaat tttgaatgct 720

catttgacta tgcagtgaca tcaagtggcg agttgaggaa tgatcatatg ctgtgtgaga 780

actccgtgtt aaaaattcca tggagccagg ctagacacca catttggcac tttcagctgt 840

ttagatttca gagaattaaa aggaaatggt caccgacctg cctttgatag tacccgtata 900

ccccttccca ccataagaaa ccagcgttcc ttagagaaat ggctaattct agctctaggg 960

caagaaatgc taagatgtgc tcaaaacatc tcattatacc agcaagccag ggagccatca 1020

acgactactg gagctgtgtc aaaaggacca acaaaccaac ttgaagaggc tcccgctggc 1080

caacagtggg gcaattagag catcaataag aataatatct gtaacaaact gaaacgtatc 1140

aaatatgttt aaattcatat gtttataatt acactcaaaa aacgaagatg cagaccactt 1200

taccttgagg atgttacaga atgaaattat cattctgaaa actggtaaat aaagagaagg 1260

tatcaagtaa gcatgtatct ggctttttct atatgaaata aaggaagcca aatagtaaac 1320

gaggggaagt ttctctttac tgaaatattg caggtaataa aagaagaagg agaaacagag 1380

aacattatcg ttttatggcc tctaatggaa caagacatct aggcaatgat gaactatggt 1440

caccaacatc actcaatcag ggacaatcag acactgtggg cccctgaagg aagtaaacac 1500

caccacgtag gaaatattct caccaaaact tcaaaaactt gaatctgatc tagtctttag 1560

tttcaactac taatttacag gcaatacggg gctcagaggg atgtggtaaa atgtcacgga 1620

aatataatca gcaaaatcca gtacagataa taagaagaca aatgatccac agatggaaag 1680

gaagaatgta aagttgtgtt ggtaaagaaa ttcacagatt aataaaagct taaaaatgta 1740

ccatca 1746

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

cagggagcca tcaacgacta 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

ttcaagttgg tttgttggtc ct 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

gtggccgagg actttgattg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

cctgtaacaa cgcatctcat att 23

Claims (10)

1.一种免疫性血小板减少症的lncRNA标志物，其特征在于：该lncRNA标志物为LOC100506314，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种免疫性血小板减少症的lncRNA标志物的引物，其特征在于：该lncRNA标志物的引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1所述lncRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述lncRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。

5.一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测外周血中LOC100506314的表达水平。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有免疫性血小板减少症的lncRNA标志物；所述lncRNA标志物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有lncRNA标志物的引物，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括反转录体系和标准PCR反应体系。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参基因β-actin；所述内参基因β-actin的引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

10.一种检测免疫性血小板减少症的lncRNA标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，分离纯化外周血，抽提血液样本中的总RNA；

步骤二，将总RNA反转录为cDNA；

步骤三，通过荧光定量Q-PCR对cDNA和内参基因β-actin进行扩增检测LOC100506314的表达水平；

步骤四，进行统计分析评估；

优选地，所述荧光定量Q-PCR采用的引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

优选地，所述内参基因β-actin采用的引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。