CN109295213A - 免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用。该miRNA标记物为hsa‑miR‑302e，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；该miRNA标记物的引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。将miRNA标志物及其引物用于制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒。本发明的miRNA标记物能够用于判断免疫性血小板减少症的进程和严重程度；在其基础上开发的hsa‑miR‑302e引物及诊断试剂盒和检测方法操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用于早期和不同阶段免疫性血小板减少症的诊断，具有明显的临床应用价值。

Description

免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，尤其涉及一种免疫性血小板减少症的miRNA标 志物及试剂盒和应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是存在于体内的一种长度大约为19-23nt的微小非编码 RNA，通过碱基配对原则与靶基因mRNA 5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列结合， 使mRNA降解或者抑制相关蛋白质的翻译，从而在转录后水平对基因的表达进行调 控，一个microRNA可能结合多个mRNA，一个mRNA也可能被多个microRNA所 调节。生物机体内约有1/3的基因受miRNA的调控。然而，ITP患者中具体有哪些 miRNA表达异常目前还存在争议，miRNA在ITP的发生发展中的具体作用机制至今 还未阐明。
原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性疾病。其特点为血小板生成减少及破坏增加，临床以皮肤黏膜出血为 主，严重者可有内脏出血，出血风险随年龄而增加。ITP的病因十分复杂，涉及包括 遗传、感染、免疫功能异常等在内的众多因素，目前普遍认为以免疫学发病机制为主， 患者体内产生针对血小板特异性糖蛋白GPIIb-IIIa和GPIb-IX的自身抗体，进而引发 单核/巨噬细胞Fc受体介导的血小板清除，导致血小板数量降低。ITP治疗上多为对 症治疗，疾病进展可产生脊髓或颅内出血，严重影响患者生活质量，也带来沉重的经 济负担。在中国，儿童ITP的年发病率约为46/100万人口，成人为38/100万人口。 ITP急性期一般六个月内自愈，但有20％-30％可发展为病程持续超过12个月、治疗 较为棘手的慢性ITP和难治性ITP。
miRNA是调节基因表达的内源性非编码RNA，在转录后水平对基因表达进行调 控，参与细胞周期、凋亡、分化和新陈代谢等生理过程。miRNA在细胞中表达失调 会导致免疫性血小板减少症等多种疾病的发生，最新研究表明，一些miRNA在免疫 性血小板减少症患者外周血异常表达，但何种miRNA与免疫性血小板减少症的发生、 发展有关仍未达成共识。因此有必要寻找与免疫性血小板减少症发生、发展有关的 miRNA，从而为临床上判断和治疗免疫性血小板减少症提供一种有效手段。
发明内容
基于现有技术免疫性血小板减少症检测与治疗中所存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物；本发明的第二目的在于提供 一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物的引物；本发明的第三目的在于提供 miRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅 助诊断试剂盒中的应用；本发明的第四目的在于提供miRNA标志物的引物在制备抑 制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用； 本发明的第五目的在于提供一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒；本发明的第六 目的在于提供一种检测免疫性血小板减少症的miRNA标志物的方法。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一方面，本发明提供一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物，该miRNA标 记物为hsa-miR-302e，其碱基序列为UAAGUGCUUCCAUGCUU(如SEQ ID NO：1 所示)。该hsa-miR-302e为hsa-miR-302e的初始miRNA在人细胞内被剪切并表达为 的成熟hsa-miR-302e。
另一方面，一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物的引物，该miRNA标记 物的引物的碱基序列为：
引物F的序列(5'-3')为：GGGTAAGTGCTTCC(如SEQ ID NO：2所示)
引物R的序列(5'-3')为：CAGTGCGTGTCGTGGAGT(如SEQ ID NO：3所示)。
再一方面，本发明提供上述miRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药 物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。
再一方面，本发明提供上述miRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少 症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。
再一方面，本发明提供一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血中hsa-miR-302e的表达水平。
上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒含有免疫性血小板减少症的miRNA标志 物；所述miRNA标志物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒含有miRNA标志物的引物，所述引物的 碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒还包括总RNA提取常用试剂、cDNA反 转录引物、反转录常用试剂、荧光定量Q-PCR反应常用的聚合酶及试剂和荧光检测 试剂。
上述的试剂盒中，优选地，所述cDNA反转录的引物序列为：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAG CAT(如SEQ ID NO：4所示)。
上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒还包括标准品和/或对照品。
上述的试剂盒中，优选地，所述标准品和/或对照品为内源性miRNA-U6RNA。
再一方面，本发明还提供一种检测免疫性血小板减少症的miRNA标志物的方法，包括以下步骤：
步骤一，分离纯化外周血，抽提血液样本中的总RNA；
步骤二，将总RNA反转录为cDNA；
步骤三，通过荧光定量Q-PCR对cDNA和参照基因进行扩增检测has-miR-302e 的表达水平；
步骤四，进行统计分析评估。
上述的方法中，优选地，所述反转录采用的引物序列如SEQ ID NO：4所示。
上述的方法中，优选地，所述荧光定量Q-PCR采用的引物序列如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示。
上述的方法中，优选地，所述参照基因为内源性miRNA-U6RNA。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次发现外周血miRNA标志物hsa-miR-302e在免疫性血小板减少 症中明显升高，并且不同分期表达不同，且表达水平与患者血小板呈显著负相关；对 ITP不同时间(初诊期+持续期、慢性期+难治期)的诊断具有很高的诊断价值和显著 的统计学意义，能够用于判断免疫性血小板减少症的进程和严重程度；为免疫性血小 板减少症免疫治疗提供了新的药物靶点。
(2)本发明在miRNA标志物hsa-miR-302e基础上开发的hsa-miR-302e引物及 诊断试剂盒和检测方法，其操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强， 可用于早期和不同阶段免疫性血小板减少症的诊断，具有明显的临床应用价值。
(3)本发明的检测方法采用的是内源性miRNA-U6RNA作为参照基因，避免了 由于疾病个体间差异造成的数据偏差，显著提高了检测结果的稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例1中免疫性血小板减少症病例组和中健康对照组外周血 hsa-miR-302e的表达水平示意图；
图2为本发明实施例1中ITP患者不同分期(初诊断+持续期、慢性期+难治期) 外周血hsa-miR-302e的表达水平示意图；
图3为本发明实施例1中检测样本中hsa-miR-302e水平与血小板水平的相关性 分析示意图；
图4为本发明实施例3中has-miR-302e水平对ITP的诊断价值的ROC曲线图；
图5为本发明实施例4中外周血水平hsa-miR-302e水平对ITP患者初诊断+持续 期的预测价值的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明，其中包括使用材料及具体来源。但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下试剂、仪器的类型及型号，或性 质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。除非另有所指，本发明中用到 的试剂可以是任何合适的市售试剂。下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。
实施例1检测免疫性血小板减少症的miRNA标志物的方法
1、临床样品的采集
发明人于2016年开始至今从解放军第100医院和苏大附院收集大量的免疫性血小板减少症患者，诊断标准均符合“成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共 识(修订版)”；同时选取体检中心健康正对照组，抽取外周血。此研究通过医院伦理 委员会的批准，受试者均签署知情同意书。收集和后续实验各过程符合医学伦理道德 要求并严格遵循，病例资料的保密原则。研究样品的采样、分装、保存条件一致。通 过对病历资料的分析整理，发明人选择了89例符合下列标准的样品作为实时荧光定 量PCR检测的实验样品。
正常人血小板为100-300×109/L，ITP患者血小板<100×109/L，当血小板为 <30×109/L时，必须进行积极治疗。新诊断患者为新确诊ITP病人，且之前无可靠的 临床或实验室确诊证据；慢性患者为已经确诊为ITP且持续12月以上的病人。本次 研究纳入ITP患者共89例，其中新诊断期ITP 25例，持续期ITP 20例，慢性ITP 35 例，难治ITP 9例。正常对照40例。
2、血液中总RNA的抽提
2.1 PBMC的分离：以密度梯度离心法分离枸橼酸钠抗凝血中PBMC。以等量的 生理盐水稀释枸橼酸钠抗凝的静脉血；向一干净的离心管内加入淋巴细胞分离液；将 稀释后的血液沿离心管壁等体积缓慢加于淋巴细胞分离液上；以230转/每分钟(rpm) 的速度离心20分钟(min)；吸出单个核细胞层移入另一干净的离心管中加入5mL生理 盐水，以1000rpm的速度离心10min；重复洗涤细胞2次，所得细胞沉淀即为PBMC。
2.2 RNA抽提
试剂TRIZOL试剂(Invitrogen life technologies)
氯仿上海化学试剂有限公司
异丙醇上海化学试剂有限公司
100％乙醇(上海化学试剂有限公司)
75％乙醇(以DEPC处理的水配制)
无RNA酶的水
2.2.1.将PBMC细胞加入TRIZOL试剂反复吹打使细胞裂解。每5-10×106的细胞 使用1mL TRIZOL试剂，避免在加入TRIZOL试剂进行裂解前清洗细胞，因为清洗 会很可能导致mRNA的降解。
2.2.2两相分离
匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1mL 的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000×g离心15分钟。离心后混合液体将 分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。 水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。
2.2.3 RNA沉淀
将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇 的量为每个样品匀浆时加入1mL TRIZOL试剂的此时加0.5mL的异丙醇。混匀后15 到30℃孵育10分钟后，于4℃12000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉 淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
2.2.4 RNA清洗
移去上清液，每1mL TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1mL的75％乙醇，清 洗RNA沉淀。振荡后，4℃7500×g离心5分钟。
2.2.5重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA 沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280 比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55℃ 到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。
3、逆转录为cDNA：
试剂：RNA酶抑制剂(Epicentre)
SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(Invitrogen)
5×RT缓冲液(Invitrogen)
2.5mM dNTP混合液(HyTest Ltd)
Primer(英骏生物技术有限公司)
反转录RT引物序列为：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAG CAT(如SEQ ID NO：4所示)
3.1配制退火混合物
混合液在65℃水浴5分钟，冰上放置2分钟。
3.2短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液
混合后37℃恒温1分钟。移液枪轻轻吸打几次混合均匀；50℃温育60分钟； 70℃温育15分钟使酶失活；cDNA置冰浴待用或-20℃保存。
4、实时荧光定量PCR检测hsa-miR-302e表达
试剂：2×PCR master mix(Arraystar)
4.1针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板 进行PCR反应：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min；40 个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒；收集荧光)。
其中：
引物F的序列(5'-3')为：GGGTAAGTGCTTCC(如SEQ ID NO：2所示)
引物R的序列(5'-3')为：CAGTGCGTGTCGTGGAGT(如SEQ ID NO：3所示)。
4.2进行Realtime PCR反应
4.2.1将所有cDNA样品(参照基因采用的是内源性miRNA-U6RNA)分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。
其中：
引物F的序列(5'-3')为：GGGTAAGTGCTTCC(如SEQ ID NO：2所示)
引物R的序列(5'-3')为：CAGTGCGTGTCGTGGAGT(如SEQ ID NO：3所示)。
4.2.2加样：将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μlcDNA，小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备 好的PCR板放在冰上。
4.2.3将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒； 60℃，60秒(收集荧光)。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60 秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/ 秒)。
5、数据处理与分析
将定量PCR结果以2-ΔΔCT表示。ΔΔCT＝[ΔCT(ITP)]–[ΔCT(健康对照)]，ΔCT＝[CT(miRNA)]–[CT(内参基因)]。采用Graphpad prism6.0进行统计分析，组间均值 比较采用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关。P<0.05为差异具有统计学 意义。
结果如图1和表1所示，ITP患者hsa-miR-302e水平明显高于健康对照，差异具 有显著的统计学意义(P<0.001)。
表1 ITP和正常对照外周血hsa-miR-302e水平
均值 标准差 中位数 范围
健康对照(n＝40) 1.018 0.379 1.006 0.360-1.912
ITP(n＝89) 2.737 1.325 2.722 0.486-6.298
经Graphpad软件进行统计分析，hsa-miR-302e在免疫性血小板减少症和健康对照组的表达水平具有显著差异(P<0.001)见图1。由图1可以看出ITP患者外周血 hsa-miR-302e的表达水平明显高于健康对照组，差异具有显著的统计学意义 (P<0.001)。
图2为ITP患者不同分期(初诊断+持续期、慢性期+难治期)外周血hsa-miR-302e的表达水平。由图2可知：外周血hsa-miR-302e的表达水平在ITP早期最高，随着 ITP的发展，hsa-miR-302e水平逐渐降低，初诊断+持续期与慢性期+难治期比较差异 有统计学意义(P<0.001)；因此检测hsa-miR-302e水平，可用于ITP的分期鉴别。
图3为检测样本中hsa-miR-302e水平与血小板水平的相关性分析示意图；由图3可以看出hsa-miR-302e水平与血小板呈明显负相关(R＝-0.6140，P<0.001)，P<0.05认 为具有统计学意义。
由此可以确定，hsa-miR-302e在免疫性血小板减少症患者外周血液中明显升高，且疾病的不同疾病状态中表达不同。可以作为ITP检测分子标志物。
实施例2
本实施提供了一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血中hsa-miR-302e的表达水平。该试剂盒含有免疫性血小板减少症的miRNA标志物； 所述miRNA标志物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该试剂盒还包括miRNA标 志物的引物，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。所述试 剂盒还包括总RNA提取常用试剂、cDNA反转录引物、反转录常用试剂、荧光定量 Q-PCR反应常用的聚合酶及试剂和荧光检测试剂(参见实施例1)；所述cDNA反转 录引物序列如SEQ ID NO：4所示。所述试剂盒还包括标准品和/或对照品；所述标 准品和/或对照品为内源性miRNA-U6RNA。
利用该试剂盒可以达到与实施例同等的检测效果且操作更加方便快捷，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用于早期和不同阶段免疫性血小板减少症的 诊断，具有明显的临床应用价值。
实施例3
应用ROC曲线分析hsa-miR-302e水平对ITP的诊断价值。在127例检测对象中， 以ITP患者为靶对象，利用Graphpad软件做出ROC曲线，并分析相关的各种参数。 如图4所示，曲线下面积达到0.8913，说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数 Youden’s index最大的原则，判断出hsa-miR-302e的最佳临界值为1.552，对应的敏 感性、特异性分别为77.54和95％、见表2所示。
表2：
由图4和表2可以看出曲线下面积为0.0.891±0.027(P<0.001)，提示具有很高的诊断价值。hsa-miR-302e浓度最佳临界值为1.552，对应的敏感性、特异性分别为 77.53％、95％。
实施例4
应用ROC曲线分析外周血hsa-miR-302e水平对ITP患者临床分期的预测价值。 在89例ITP患者中，以新诊断+持续期患者为靶对象，利用Graphpad软件做出ROC 曲线，并分析相关的各种参数。如图5所示，曲线下面积达到0.930，说明具有较好 的预测价值。利用约登指数最大的原则，判断出hsa-miR-302e的最佳临界值为1.636， 对应的敏感性和特异性分别为84.4％和95％，见表2所示。以新诊断患者为靶对象， 如图5所示，ROC曲线下面积达到0.945，说明对于新诊断期ITP患者具有较好的预 测价值。利用约登指数最大的原则，判断出hsa-miR-302e的最佳临界值为1.865，对 应的敏感性、特异性分别为88％和95％。
综上所述，本发明miRNA标志物hsa-miR-302e在免疫性血小板减少症中明显升高，并且不同分期表达不同，且表达水平与患者血小板呈显著负相关；对ITP不同时 间(初诊期+持续期、慢性期+难治期)的诊断具有很高的诊断价值和显著的统计学 意义，能够用于判断免疫性血小板减少症的进程和严重程度；为免疫性血小板减少症 免疫治疗提供了新的药物靶点；在miRNA标志物hsa-miR-302e基础上开发的 hsa-miR-302e引物及诊断试剂盒和检测方法，其操作简便，对受检者的创伤性小，且 灵敏度高，特异性强，可用于早期和不同阶段免疫性血小板减少症的诊断，具有明显 的临床应用价值；本发明的检测方法采用的是内源性miRNA-U6 RNA作为参照基因， 避免了由于疾病个体间差异造成的数据偏差，显著提高了检测结果的稳定性。
序列表
<110> 中国人民解放军第一00医院
<120> 免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 1
uaagugcuuc caugcuu 17
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gggtaagtgc ttcc 14
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacaa gcat 54

Claims (10)

1.一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物，其特征在于：该miRNA标记物为hsa-miR-302e，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物的引物，其特征在于：该miRNA标记物的引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
3.权利要求1所述miRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述miRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。
5.一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒用于检测外周血中hsa-miR-302e的表达水平。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有免疫性血小板减少症的miRNA标志物；所述miRNA标志物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有miRNA标志物的引物，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括总RNA提取常用试剂、cDNA反转录引物、反转录常用试剂、荧光定量Q-PCR反应常用的聚合酶及试剂和荧光检测试剂；
优选地，所述cDNA反转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品和/或对照品；
优选地，所述标准品和/或对照品为内源性miRNA-U6RNA。
10.一种检测免疫性血小板减少症的miRNA标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，分离纯化外周血，抽提血液样本中的总RNA；
步骤二，将总RNA反转录为cDNA；
步骤三，通过荧光定量Q-PCR对cDNA和参照基因进行扩增检测has-miR-302e的表达水平；
步骤四，进行统计分析评估；
优选地，所述反转录采用的引物序列如SEQ ID NO：4所示；
优选地，所述荧光定量Q-PCR采用的引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
优选地，所述参照基因为内源性miRNA-U6RNA。
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