CN117210549A

CN117210549A - 检测人atp5d、cd69和cxcr4基因的物质及其应用

Info

Publication number: CN117210549A
Application number: CN202311095214.7A
Authority: CN
Inventors: 熊柳林; 王文元; 薛璐璐; 王廷华; 余昌胤; 杜若兰
Original assignee: Heluo Xintu Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Heluo Xintu Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2023-08-29
Filing date: 2023-08-29
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本申请公开了检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的物质在制备检测人阿尔茨海默病产品中的应用。本申请还公开了一种检测人阿尔茨海默病的产品，所述产品包括检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质。

Description

检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的物质及其应用

技术领域

本说明书涉及生物技术领域，特别涉及检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的物质及其应用。

背景技术

根据最近的统计，全球约有5000万人正遭受痴呆症带来的病痛，预计该数值每20年会翻一番，到2050年达到约1.52亿例。其中，阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人最常见的神经退行性疾病，以进行性认知功能下降为特征，其主要症状是记忆丧失以及无法产生新的记忆。特别是阿尔茨海默病在疾病发展到一定程度之后，就只能延缓病情发展而无法康复，所以早期诊断和判断病情非常重要。

根据目前的报告，阿尔茨海默病是在淀粉样蛋白级联反应、Tau蛋白磷酸化、神经递质、兴奋性毒性或氧化应激等多种复杂的病理学和生理学条件下诱发的。因此，阿尔茨海默病的发病和疾病进展非常难于预防，所以目前的重点转向了早期诊断和治疗以减缓疾病进展和改善认知衰退。

阿尔茨海默病(AD)的主要病理性特征为β-淀粉样蛋白(Aβ)肽的脑内蓄积或Tau蛋白的神经原纤维缠结(NFT)，这与在其发病过程中因神经元和突触的毒性和破坏而相继产生的神经退行性机制密切相关。

作为目前的诊断方法，有脑成像、认知功能测试、通过脑脊液的检测方法等，但这些方法只有在阿尔茨海默病的很大一部分症状出现后才能应用，因此这些方法不足以进行早期诊断。此外，在经济上也需要花费大量的诊断费用，侵入性检查步骤还存在潜在的危险等，这样的生物标志物的测试并不总是可行的，存在局限性。

与之相对，基于血液的诊断由于是非侵入性的、且廉价、能够进行大规模的多次采样，所以有助于克服这些缺点。因此，在最近的许多研究中，对基于血液的阿尔茨海默病生物标志物和脑的病理学变化之间的相关性进行了研究。然而，尽管做出了这些努力，但仍缺乏能够直接反映阿尔茨海默病的发病和疾病进展的基于血液的阿尔茨海默病生物标志物的检测方法。

发明内容

本申请提供了检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的物质在制备检测人阿尔茨海默病产品中的应用。

本申请还提供了一种检测人阿尔茨海默病的产品，所述产品包括检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质。

本申请带来的有益效果包括但不限于：1、本申请提供的检测阿尔茨海默病的物质在阿尔茨海默病患者的外周血或脑切片能够检测到B淋巴细胞数量及其特异性基因ATP5D、CD69和CXCR4的表达水平均降低，特异性强、准确度高；2、根据上述物质制备的试剂盒可通过抽血检查实现诊断或预测，克服了现有技术中在无症状期仅能通过脑脊液诊断的技术障碍，极大地减轻了患者的痛苦，推动了实现疾病早发现、早诊治的治疗方针，对于阿尔茨海默病的诊治和研究具有重大的意义。

附图说明

本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：

图1为根据本申请一些实施例所示的AD患者B淋巴细胞中ATP5D，CD69和CXCR4表达的单细胞RNA测序分析图；图1A：正常、早期和晚期AD患者的B淋巴细胞中差异基因的热图。红色代表高表达，蓝色代表低表达；图1B：AD患者和正常受试者的B淋巴细胞中上调和下调的差异蛋白质的火山图，绿色和红色的点分别表示下调和上调的基因；图1C：RT-qPCR检测正常(n＝41)个体和AD患者(n＝43)中ATP5D、IL32、JUNB、LGALS1、HLA-DRB5、MT-CYB、MT-ND2、CCL5、CD69、CXCR4、S100A4、S100A6的表达变化。使用独立样本t检验分析原始数据；图1D：单细胞RNA测序和RT-qPCR结果的对比图，筛选趋势相同的基因，ATP5D，CD69和CXCR4，用于后续研究；图1E-图1F：t-SNE和定量线图分别显示了18个细胞群中ATP5D、CD69和CXCR4的表达变化，红色阴影表示不同的表达水平，绿色和红色分别表示下调和上调，AD:老年痴呆症。

图2为根据本申请一些实施例所示的ATP5D、IL32、JUNB、LGALS1、HLA-DRB5、MT-CYB、MT-ND2、CCL5、CD69、CXCR4、S100A4、S100A6在不同CDR评分、年龄、性别下的表达变化，这12种因子在图2A正常人和CDR为1(n＝15)，2(n＝16)，3(n＝12)的患者，图2B年龄小于78岁(n＝16)或大于78岁(n＝20)的患者，以及图2C男性(n＝11)和女性(n＝22)患者中的表达。原始数据通过单因素方差分析进行分析，然后进行post hoc检验(图2A)，或通过独立样本t检验进行分析(图2B、图2C)。CDR：临床痴呆等级。

图3为根据本申请一些实施例所示的ATP5D、CD69和CXCR4在健康受试者和AD患者PBMCs以及皮质和海马中的表达，图3A：ATP5D、CD69和CXCR4在健康受试者(n＝41)和AD患者中的表达，CDR评分为1(n＝15)、2(n＝16)和3(n＝12)。原始数据通过单因素方差分析进行分析，然后进行post hoc检验；图3B：ATP5D、CD69和CXCR4的表达与CDR评分的相关性分析(CDR 0(健康受试者)n＝41；CDR 1,n＝15；CDR 2,n＝16；CDR 3,n＝12)。使用Pearson's相关系数对数据进行分析；图3C-图3D：来自健康受试者、早期和晚期AD患者的PBMCs的细胞涂片中的CD19和ATP5D(n＝5表示健康，n＝6表示早期AD，n＝7表示晚期AD)、CD19和CD69(n＝7表示健康，n＝8表示早期AD，n＝7表示晚期AD)、CD19和CXCR4(n＝7表示健康，n＝7表示早期AD，n＝8表示晚期AD)表达的免疫荧光染色和定量分析。标尺＝50μm。通过单因素方差分析原始数据，然后进行post hoc检验；图3E-图3H：海马中CD19和ATP5D、CD19和CD69、CD19和CXCR4表达的免疫荧光染色和定量分析(CD19:健康者n＝6，AD者n＝7；ATP5D:健康者n＝7，AD n＝7；CD69:n＝4代表健康，n＝5代表AD；CXCR4:n＝6代表健康，n＝5代表AD)和皮质(CD19:n＝5代表健康，n＝5代表AD；ATP5D:健康者n＝5，AD者n＝5；CD69:n＝5代表健康，n＝3代表AD；CXCR4:健康者n＝5，AD者n＝4)来自3名健康个体和5名AD患者。使用独立样本t检验呈现和分析原始数据。白色箭头为阳性细胞，绿色表示CD19阳性细胞(B淋巴细胞标记)，红色分别表示ATP5D、CD69和CXCR4，蓝色表示DAPI(细胞核)，CDR:临床痴呆等级；AD:老年痴呆症。

图4为根据本申请一些实施例所示的ATP5D、CD69和CXCR4在WT和AD小鼠大脑皮层、海马和B淋巴细胞中的表达及生物信息学分析图，图4A-图4C：3个月龄(n＝6)、10个月龄(n＝6)、18个月龄(n＝6)的WT小鼠和15个月龄(n＝6)的AD小鼠以及3个月龄(n＝6)的WT小鼠和15个月龄(n＝6)的AD小鼠的B淋巴细胞中ATP5D、CD69和CXCR4的表达。原始数据通过单因素方差分析进行分析，然后进行post hoc检验或独立样本t检验；图4D：B淋巴细胞相关差异基因的PPI图，绿圈表示与ATP5D相关的基因，红圈表示与CD69相关的基因，黄圈表示与CXCR4相关的基因，圆圈越大，连线越粗表示相关性越显著。在STRING上对差异基因进行蛋白互作分析(https://string-db.org/)并与Cytoscape(https://cyto scape.org/)一起显示。(E-F)B淋巴细胞相关基因的KEGG和GO(BP，CC和MF)分析，红框表示最相关的途径以及BP、CC和MF，R软件，“clusterProfiler”包用于KEGG和GO分析，并通过“enrichplot”包进一步可视化，M:月，WT:野生型，AD:阿尔茨海默病。

图5为根据本申请一些实施例所示的对照组与AD患者在B细胞中ATP5D，CD69和CXCR4表达差异及3种因子组合的诊断效力。(A)对照组(n＝29)与AD组(n＝33)患者在B细胞中ATP5D表达箱式散点图，具有统计学意义(P＜0.05)。(B)对照组与AD组患者在B细胞中CD69表达箱式散点图，具有统计学意义(P＜0.05)。(C)对照组与AD组患者在B细胞中CXCR4表达箱式散点图，具有统计学意义(P＜0.05)。(D)独立分析了ADP5D预测AD的ROC曲线图，显示AUC为0.6520，P＜0.05。(E)独立分析了CD69预测AD的ROC曲线图，显示AUC为0.7482，P＜0.05。(F)独立分析了CXCR4诊断AD的ROC曲线图，显示AUC为0.6729，P＜0.05。(G)使用logistic分析中的预测值，通过ROC曲线，分析了ATP5D，CD69和CXCR4结合使用3个因子的预测能力，显示AUC为0.7461，P＜0.05。(H)合并了独立分析ATP5D、CD69、CXCR4诊断AD的ROC曲线图，显示AUC分别为0.6520、0.7482、0.6729。

图6为根据本申请一些实施例所示的不同年龄在B细胞中ATP5D，CD69和CXCR4表达差异及3种因子组合的诊断效力。(A)AD患者中小于78岁(14人)与大于78岁(19人)在B细胞中ATP5D表达箱式散点图，具有统计学意义(P＜0.05)。(B)AD患者中小于78岁与大于78岁在B细胞中CD69表达箱式散点图，具有统计学意义(P＜0.05)。(C)AD患者中小于78岁与大于78岁在B细胞中CXCR4表达箱式散点图，具有统计学意义(P＜0.05)。(D)独立分析了ADP5D在诊断小于78岁与大于78岁AD患者的ROC曲线图，显示AUC为0.7331，P＜0.05。(E)独立分析了CD69在诊断小于78岁与大于78岁AD患者的ROC曲线图，显示AUC为0.9586，P＜0.05。(F)独立分析了CXCR4在诊断小于78岁与大于78岁AD患者的ROC曲线图，显示AUC为0.8083，P＜0.05。(G)使用logistic分析中的预测值，通过ROC曲线，分析了ATP5D，CD69和CXCR4结合使用3个因子的诊断能力，显示AUC为0.9586，P＜0.05。(H)合并了独立分析ATP5D、CD69、CXCR4诊断小于78岁与大于78岁AD患者的ROC曲线图，显示AUC分别为0.7331、0.9586、0.8083。

图7为根据本申请一些实施例所示的不同性别在B细胞中ATP5D，CD69和CXCR4表达差异及3种因子组合的诊断效力。(A)AD患者中男性(11人)和女性(22人)在B细胞中ATP5D表达箱式散点图，无统计学意义(P＞0.05)。(B)AD患者中男性和女性在B细胞中CD69表达箱式散点图，无统计学意义(P＞0.05)。(C)AD患者中男性和女性在B细胞中CXCR4表达箱式散点图，无统计学意义(P＞0.05)。(D)独立分析了ATP5D在诊断男性和女性AD患者的ROC曲线图，显示AUC为0.5455，P＞0.05。(E)独立分析了CD69在诊断男性和女性AD患者的ROC曲线图，显示AUC为0.5744，P＞0.05。(F)独立分析了CXCR4在诊断男性和女性AD患者的ROC曲线图，显示AUC为0.5826，P＞0.05。(G)使用logistic分析中的预测值，通过ROC曲线，分析了ATP5D，CD69和CXCR4结合使用3个因子的诊断能力，显示AUC为0.9586，P＞0.05。(H)合并了独立分析ATP5D、CD69、CXCR4诊断男性和女性AD患者的ROC曲线图，显示AUC分别为0.5455、0.5744、0.5726。

具体实施方式

为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。

如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。

本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种慢性进展的神经退行性疾病，具有发病率高、医疗成本高、精神负担重等特点，是全球共同面临的重要健康问题。以AD为代表的痴呆，在全球范围内累及4700万患者，到2050年，该数字将增为三倍。研究阿尔茨海默疾病的临床诊断指标，对早期诊断阿尔茨海默病，早期干预、治疗具有重要的临床价值。

本申请提供检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的物质在制备检测人阿尔茨海默病产品中的应用。

在一些实施例中，所述ATP5D、CD69和CXCR4基因可以为B淋巴细胞特异性基因。

所述ATP5D基因在NCBI GenBank数据库中Gene ID为513。所述CD69基因在NCBIGenBank数据库中Gene ID为969。所述CXCR4基因在NCBI GenBank数据库中Gene ID为7852。

在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以为CD19阳性细胞。

在一些实施例中，优选的，所述B淋巴细胞可以来源于外周血和/或中枢神经系统。

在一些实施例中，所述阿尔茨海默病患者外周血和/或中枢神经系统中B淋巴细胞数量减少。

在一些实施例中，所述阿尔茨海默病患者外周血和/或中枢神经系统中B淋巴细胞特异性基因ATP5D、CD69和CXCR4的表达水平均降低。

在一些实施例中，所述ATP5D、CD69和CXCR4的表达可以随临床痴呆症评分的增加而降低；

在一些实施例中，所述ATP5D、CD69和CXCR4的相对表达水平可以与临床痴呆症评分呈负相关。

在一些实施例中，所述检测ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质可以包括引物对、探针或抗体中至少一种。在一些实施例中，优选的，所述检测ATP5D引物对如下：

正向引物：5'-CCCCAACCAGATGTCCTTCA-3'(SEQ ID NO.3)，和反向引物：5'-TCTTCGGCCAACAACTGCA-3(SEQ ID NO.4)；

在一些实施例中，优选的，所述检测CD69引物对如下：

正向引物：5'-ATGGTGCTACTCTTGCT-3'(SEQ ID NO.7)，和反向引物：5'-ATGCTGCTGACCTCTGT-3'(SEQ ID NO.8)；

在一些实施例中，优选的，所述CXCR4引物对如下：

正向引物：5'-AAATCTTCCTGCCCACCAT-3'(SEQ ID NO.9)，和反向引物：5'-CGCCAACATAGACCACCTT-3'(SEQ ID NO.10)。

本申请还提供一种检测人阿尔茨海默病的产品，所述产品包括检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质。

在一些实施例中，所述产品可以为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列、组合物或检测系统之任一。

在一些实施例中，所述ATP5D、CD69和CXCR4基因可以为B淋巴细胞特异性基因。在一些实施例中，优选的，所述B淋巴细胞可以为CD19阳性细胞。在一些实施例中，进一步优选的，所述B淋巴细胞可以来源于外周血和/或中枢神经系统。

在一些实施例中，所述检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质可以为引物对、探针或抗体中至少一种。

在一些实施例中，所述ATP5D的检测引物可以为：

正向引物：5'-CCCCAACCAGATGTCCTTCA-3'(SEQ ID NO.3)，和反向引物：5'-TCTTCGGCCAACAACTGCA-3(SEQ ID NO.4)。

在一些实施例中，所述CD69的检测引物可以为：

正向引物：5'-ATGGTGCTACTCTTGCT-3'(SEQ ID NO.7)，和反向引物：5'-ATGCTGCTGACCTCTGT-3'(SEQ ID NO.8)。

在一些实施例中，所述CXCR4的检测引物可以为：

本申请所用术语“引物”指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖DNA或依赖RNA的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模版或靶序列)互补。通常，一套引物将由至少两条引物组成，一条“上游引物”和一条“下游引物”，它们共同限定扩增子(将利用所述引物扩增的序列)。

术语“探针”是指能够选择性结合靶生物分子(例如，与探针杂交的核酸序列)的任何分子。在一些实施例中，探针可被标记，例如用荧光基团和淬灭基团标记。在一些实施例中，探针可以是Taqman探针，5’端添加荧光报告基团，3’端添加荧光猝灭基团。

抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。在一些实施例中，抗体可以用作检测试剂检测基因的表达情况。在一些实施例中，可以使用特定抗体检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达情况。

本申请还公开了一种人阿尔茨海默病的诊断方法，所述方法利用上述的产品检测来自待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量是否相对于健康人降低。

在一些实施例中，所述方法可以包括下列步骤：(1)收集待检样本，提取样本基因组DNA；(2)配制反应体系，所述反应体系包括样本基因组DNA、DNA聚合酶、脱氧核苷酸(dNTP)混合物、缓冲溶液；(3)进行扩增反应；(4)对结果进行分析，得到待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量；(5)判断待检样本对应的人是否患有阿尔茨海默病。

本申请通过统计大量样本，得到健康人群中ATP5D、CD69和CXCR4基因的平均表达量分别为2.26、2.82和6.78，健康人群中CD19阳性B淋巴细胞在PBMC中的平均含量为7.18％。

在一些实施例中，当待检样本ATP5D的表达量显著低于2.26(p小于0.05)，可以判断待检样本对应的人患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本CD69的表达量显著低于2.82(p小于0.05)，可以判断待检样本对应的人患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本CXCR4的表达量显著低于6.78(p小于0.05)，可以判断待检样本对应的人患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量分别显著低于2.26、2.82和6.78(p小于0.05)，可以判断待检样本对应的人患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量分别显著低于2.26、2.82和6.78(p小于0.05)，并且CD19阳性B淋巴细胞在PBMC中的含量显著低于7.18％(p小于0.05)，可以判断待检样本对应的人患有阿尔茨海默病。

本申请还公开了一种用于预测受试者发生阿尔茨海默病的风险的方法，所述方法利用上述的产品检测来自待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量是否相对于健康人降低。

在一些实施例中，所述方法可以包括下列步骤：(1)收集待检样本，提取样本基因组DNA；(2)配制反应体系，所述反应体系包括样本基因组DNA、DNA聚合酶、脱氧核苷酸(dNTP)混合物、缓冲溶液；(3)进行扩增反应；(4)对结果进行分析，得到待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量；(5)，预测受试者发生阿尔茨海默病的风险。

在一些实施例中，当待检样本ATP5D的表达量显著低于2.26(p小于0.05)，可以预测待检样本对应的受试者患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本CD69的表达量显著低于2.82(p小于0.05)，可以预测待检样本对应的受试者患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本CXCR4的表达量显著低于6.78(p小于0.05)，可以预测待检样本对应的受试者患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量分别显著低于2.26、2.82和6.78(p小于0.05)，可以预测待检样本对应的受试者患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，当待检样本ATP5D、CD69和CXCR4基因的表达量分别显著低于2.26、2.82和6.78(p小于0.05)，并且CD19阳性B淋巴细胞在PBMC中的含量显著低于7.18％(p小于0.05)，可以预测待检样本对应的受试者患有阿尔茨海默病。

在一些实施例中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。

在一些实施例中，扩增反应可以是聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施例中，扩增反应可以是实时荧光定量PCR。聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)也可称为qPCR，是一种在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，可通过内参或者外参法对待测样本中的特定DNA序列进行定量分析。

术语“样本”是指从受试者分离出的含有核酸的任何组合物。在一些实施例中，所述样本可以选自血液、组织、血细胞、骨髓、腹水、细针活检样本、含有细胞的体液、游离漂浮核酸、痰液、唾液、尿液、精液、脑脊液腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、皮肤拭子、口服拭子、鼻拭子或灌洗物中的至少一种。在一些实施例中，优选地，所述样本可以为血液或脑切片。

在一些实施例中，组织样本可以包括新鲜的组织样本、福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)等。在一些实施例中，样本可以是新鲜的或者是冷冻的(例如，液氮保存、-80°冰箱保存、-20°冰箱保存)。可以从受试者中获取新鲜的样本后直接进行后续处理(例如，提取RNA等)，也可以将样本进行冷冻保存后，待需要时再进行后续处理。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本申请实施例中的相关试验方法如下：

1、患者招募与伦理

入选对象为四川大学华西医院(四川，中国)，分组为AD患者及年龄匹配的健康对照组。根据美国国家老龄研究所(NIA)和阿尔茨海默氏症协会(AA)的诊断指南，受试者被诊断为可能患有AD。招募的AD患者符合以下标准：简易精神状态检查(MMSE)评分不超过26分。此外，招募的健康对照组符合以下标准：(1)过去或现在没有精神或神经疾病史，(2)MMSE得分高于27分。所有纳入这项研究的患者都接受了年龄、性别和临床痴呆症评分(CDR)评估。HIS评分大于7分的受试者，排除其他不太可能是AD痴呆的痴呆综合征，如血管性痴呆、路易体痴呆、麻痹性痴呆，以及由其他脑或身体疾病引起的痴呆综合征，抑郁性假性痴呆，精神错乱，或其他严重影响认知功能的急性精神疾病，还有有严重肢体运动障碍、失语、视觉听力障碍以及其他原因不能配合研究的患者。

所有涉及人体的研究程序均经四川大学华西医院临床试验与生物医学伦理委员会批准(批准号20150236；中国临床试验注册号CHCTR1900022805)。这项研究是在《赫尔辛基宣言》的指导下进行的。首先采集41例健康人和43例AD患者不同病期的静脉血，用RT-qPCR方法验证分子表达的变化，并进行相关性分析。四川大学提供诊断良好的AD患者(n＝5)和年龄匹配的非痴呆患者(n＝3)的尸脑标本，以进一步验证候选分子在B淋巴细胞中的表达。通过比较两个独立样本的平均值，用MedSci样本量工具估计样本量：α＝0.05，POWER＝0.8。临床研究的主要指标是健康对照组和AD患者不同阶段静脉血单个核细胞的scRNA-seq以及差异表达基因的验证。次级指标包括观察从scRNA-seq数据分析中获得的差异分子与患者病情严重程度(CDR评分)之间的关系。在收集血液和大脑样本之前获得了所有参与者知情同意。

2、单细胞RNA-seq及其数据处理

根据本实验的单细胞RNA-seq结果(本申请的单细胞RNA测序数据已存放在美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因表达综合数据库(GEO)，可通过GEO系列登录号GSE168522访问(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE168522))，进行进一步的分析。通过碱基调用分析，将单细胞RNA-seq获得的原始图像数据文件转换为原始测序序列。它被称为原始数据或原始读取。结果以FASTQ(简称FQ)文件格式存储，其包含测序序列(Reads)的序列信息及其相应的测序质量信息。对数据进行大量的分析，如tSNE维度聚类分析、热图、差异基因筛选、差异基因火山图谱、PPI、GO和KEGG分析。

3、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)

为了进一步验证B淋巴细胞的差异表达，筛选12个丰富的基因来验证AD患者PBMC中的基因表达差异，并用RT-qPCR检测WT(3、10、18个月)和AD(15个月)小鼠大脑皮质和海马区ATP5D、CD69和CXCR4的表达，以及WT(3个月)和AD(15个月)小鼠提取的B淋巴细胞中ATP5D、CD69和CXCR4的表达。简单地说，使用RNAiso Plus(日本，Takara)按照制造商的方案提取总RNA，并由Revetaid First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo，美国)进行互补DNA(CDNA)。然后用聚合酶链式反应(PCR)检测目的基因的信使RNA(MRNA)水平。使用CFX96^TM实时系统(美国Bio-Rad)进行实时聚合酶链式反应。使用2^-ΔΔCT方法将目标基因的表达水平归一化到每个样本中的GAPDH值。引物序列如表1所示。

表1

4、免疫荧光染色

正常人、早期和晚期AD患者PBMCs细胞涂片以及AD晚期脑切片用来进一步检测ATP5D、CXCR4和CD69在B淋巴细胞(CD19)的表达。细胞涂片预处理：将冻存的PBMCs复苏以后，用0.01M PBST清洗弃去上清液，再用4％多聚甲醛浸泡20min固定PBMCs。然后100g离心10min，0.01M PBST清洗两次，去掉上清液加入50μl的0.01M PBST，均匀涂在玻片上。石蜡切片预处理同上面描述，之后用5％的羊血清+0.3％TritonX-100封闭。将一抗兔抗CD19抗体(bs-0079，1:200)和鼠抗ATP5D抗体(66673-1-IgG1，1:200)或者鼠抗CXCR4(sc-53534-IgG1，1:200)或者鼠抗CD69(sc-373799，1:200)用2％的羊血清稀释后，一起在4℃孵育18h。之后用0.01M PBST再次漂洗3次，每次5min。二抗羊抗鼠IgG 594(红色荧光，abbkine,1:200)、羊抗兔IgG 488(绿色荧光，abbkine,1:200)用2％的羊血清稀释以后，37℃孵育1h。0.01M PBST中漂洗后滴加含抗荧光淬灭剂的DAPI封片并在双光子共聚焦显微镜(LeicaTCS SP8 DIVE)高倍镜(x400)下观察、采集图像。随机选取5个视野，利用Image J软件分析CD19、ATP5D、CXCR4和CD69因子的光密度值。

5、富集分析和生存分析

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)：将50个差异表达基因(DEGs)导入到字符串数据库中分析蛋白质相互作用，使用Cytoscape软件(版本3.7.2)MCODE获取连接度更高的子网络。CytoNCA中”betweenness”拓扑算法进一步对因子进行排序，进行可视化网络分析。

Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)用于对三组间的差异表达基因(DEGs)进行功能注释以调整后的P值作为功能富集的指标。分析步骤由“clusterProfiler”包实现，并通过“enrichplot”包进一步可视化。

6、统计学分析

所有数据均用原始数据作图，误差棒表示标准差，P<0.05表示结果具有统计学意义，所有统计分析均使用SPSS21.0软件(IBM Corporation，NY，USA)进行。使用独立样本T检验分析两组间的比较，用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析多组间的比较。此外使用Pearson's相关系数分析CDR评分与ATP5D、CXCR4和CD69因子表达的相关性。

实施例1--AD患者外周和中枢神经系统中B淋巴细胞及其特异性基因ATP5D、CD69和CXCR4的表达水平均降低

基于来自早期单细胞RNA测序的基因表达数据的聚类分析，筛选来自健康、早期和晚期AD患者的B淋巴细胞中显著上调和下调的基因(图1A)。基于火山图筛选12个基因(ATP5D、IL32、JUNB、LGALS1、HLA-DRB5、MT-CYB、MT-ND2、CCL5、CD69、CXCR4、S100A4、S100A6)用于进一步研究(图1B)。RT-qPCR证实ATP5D、CXCR4、CD69、S100A4的表达下调(p＝0.026，p＝0.048，p＝0.019，p＝0.032)，2个基因(MT-CYB、MT-ND2)在B淋巴细胞中上调(图1C，p＝0.009)。此外，还检测这12个基因在CDR中的表达。除IL32、LGALS1和CCL5外，它们都随着CDR评分的增加而变化(图2A)。此外，与小于78岁的患者相比，CD69、LGALS1、CXCR4、S100A6、HLA-DRB5和MT-ND2在78岁以上的AD患者中表达较低(图2B)。相反，JUNB、S100A4和S100A6在女性AD患者中的表达低于男性(图2C)。由于AD患者B淋巴细胞表达下调，因此选择B淋巴细胞中下调的差异基因进行进一步研究。通过比较测序和RT-qPCR结果，选择具有一致下调趋势的ATP5D、CD69和CXCR4用于后续验证(图1D)。T-SNE图显示，在AD患者的所有18个细胞簇中ATP5D表达减少，同时，在簇9和12中CD69和CXCR4同时减少，簇9和12是B淋巴细胞特异性细胞簇(图1E-F)。此外，ATP5D、CD69和CXCR4的表达随着CDR评分的增加而降低，并且它们的降低最为显著，尤其是在CDR＝2时(图3A，p＝0.003，p＝0.005，p＝0.022)。同时，这三个基因的相对表达与CDR评分之间的相关性分析证明，ATP5D(Y＝-0.5742*X+2.942)、CD69(Y＝-1.329*X+3.737)和CXCR4(Y＝-3.607*X+11.55)的相对表达水平均与CDR评分呈负相关(图3B，p＝0.0206，p＝0.0349，p＝0.0267)。这些结果表明，ATP5D、CXCR4和CD69在B淋巴细胞中的特异性可能在AD的进展中起关键作用。

为了验证来自AD患者PBMC的B淋巴细胞中ATP5D、CD69和CXCR4的表达，制备PBMC的细胞涂片并采用免疫荧光染色，其显示与正常对照相比，早期和晚期AD患者中CD19阳性细胞(B淋巴细胞)的数量显著减少(图3C)。类似地，在AD患者的B淋巴细胞中ATP5D阳性和CXCR4阳性细胞的数量明显少于健康对照组(图3C，D，p＝0.002，p<0.001)。有趣的是，在早期AD中观察到ATP5D表达下调(p＝0.002)，但在晚期AD中CXCR4的下调更明显(图3D，p<0.001)。为了进一步验证ATP5D、CD69和CXCR4在AD患者大脑皮层和海马中的B淋巴细胞中的分布和表达，收集由四川大学华西医院(中国四川)提供的健康和AD患者的脑切片样品。CD19和ATP5D的免疫荧光染色显示，AD患者海马中的B淋巴细胞显著减少(p＝0.001)，而AD患者大脑皮层中的B淋巴细胞与对照组相比没有显著差异(图3E-F)。与健康对照组相比，AD患者大脑皮层和海马中ATP5D的荧光强度明显较弱(图3F，p＝0.007，p<0.001)。类似地，与健康对照相比，AD患者的皮质和海马中CD69以及海马中CXCR4的荧光强度显著降低(p<0.001)，而AD患者的皮质中CXCR4的表达高于健康对照(图3G-H，p＝0.002)。总之，在AD患者的外周和中枢神经系统中，B淋巴细胞和ATP5D、CD69和CXCR4的表达水平降低。

实施例2--ATP5D、CD69和CXCR4与参与AD疾病的B淋巴细胞活化的调节相关

基于ATP5D、CD69和CXCR4在AD患者中的表达，进一步检测这三种因子在3月龄、10月龄、18月龄WT小鼠和15月龄AD小鼠的皮质、海马和B淋巴细胞中的表达，发现ATP5D在15月龄AD小鼠的皮质中的表达显著低于野生型3月龄、10月龄和18月龄小鼠(p<0.001)。并且15个月大的AD小鼠海马中ATP5D的表达和15个月大的AD小鼠皮质中CXCR4的表达显著低于10个月大的WT小鼠(图4A，C，p＝0.045，p＝0.010)。相比之下，与3个月大、10个月大和18个月大的WT小鼠相比，15个月大的AD小鼠的皮质和海马中的CD69和15个月大的AD小鼠的海马中的CXCR4的表达表现出显著增加(图4B-C，p＝0.005，p＝0.006，p＝0.018，p＝0.007，p<0.001)。这些发现表明，年轻B淋巴细胞治疗延缓AD进展可能与B淋巴细胞中ATP5D、CD69和CXCR4的调节有关。此外，还发现AD小鼠的B淋巴细胞中ATP5D和CXCR4的表达明显低于WT小鼠的B淋巴细胞，而CD69没有显示差异(图4A-C，p<0.001)。此外，利用生物信息学分析与ATP5D、CD69和CXCR4相关的差异基因。结果显示，与ATP5D相关的基因有MT-ATP6、MT-CYB、MT-ND2和MT-ND3，与CD69相关的基因有CD3D、CCL5、GZMA、GNLY、KLRB1、HCST、TYROBP和CXCR4，与CXCR4相关的基因有S100A4和CD69。(图4D)。在前12个富集的途径中，包括“阿尔茨海默病”、“轴突导向”和“凋亡”(图4E)。此外，GO分析注释的ATP5D、CD69和CXCR4涉及各种生物学功能，例如“B淋巴细胞活化的正调节”、“B淋巴细胞活化”、“免疫球蛋白复合物，循环”、“免疫球蛋白受体结合”。这些基因可能通过调节免疫相关的B淋巴细胞活化功能和促进B淋巴细胞活化释放抗体和神经营养因子参与神经通路，如AD、轴突介导和凋亡。

实施例3--数据集与统计方法

3.1研究的数据集

本研究共纳入3个数据集。

数据集1包括来自41例健康人和43例AD患者不同病期的静脉血参与者的数据(经去除离散值后，n＝62例，其中包括33名AD患者的受试者和29名健康对照者)。

数据集2为AD患者参与者的数据(n＝33例，其中包括14名小于78岁患有AD的受试者和19名大于78岁患有AD受试者)。

数据集3为AD患者参与者的数据(n＝33例，其中包括11名患有AD的男性受试者和22名女性受试者)。根据结果，参与者分为两组：健康对照组和临床AD。在62位受试者中，有29位是对照组，有33位患有临床AD。我们比较了临床AD患者和健康对照者ATP5D，CD69和CXCR4表达差异及3种因子组合的诊断效力、临床AD中小于78岁患者与大于78岁患者ATP5D，CD69和CXCR4表达差异及3种因子组合的诊断效力、临床AD中男性患者与女性患者ATP5D，CD69和CXCR4表达差异及3种因子组合的诊断效力。以确定ATP5D，CD69和CXCR4是否可以预测临床AD。

所有参与者或其法定监护人均已得到充分知情并签署了书面同意书。这项研究得到了四川大学华西医院的机构审查委员会的批准。

3.2统计分析

使用SPSS22.0(IBM Corp.，Armonk，NY，美国)和GraphPad Prism 9(GraphPadSoftware，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行统计学分析。每个数据集的数据均进行独立分析。本数据为定量资料，因不符合正态分布，采用秩和检验分析。在数据集1、2和3中，使用qPCR结果、年龄，性别作为协变量的二元logistic回归模型计算预测值，然后将其用于ROC曲线分析。所有测试均为两尾，显着性水平设置为P<0.05。

3.3结果

利用外周血B细胞ATP5D、CD69、CXCR4三个因子及其组合进行诊断

招募了一个相对较大的样本(数据集1)以评估在患有AD的受试者和对照组之间ATP5D、CD69、CXCR4三个因子的表达差异。AD患者的B细胞中显著上调和下调的基因，基于单细胞RNA-seq数据分析处理结果，筛选了12个基因用于进一步研究，由于AD患者B细胞表达下调，因此选择B细胞中下调的差异基因进行进一步研究，通过比较测序和RT-qPCR结果，我们选择了具有一致下调趋势的ATP5D、CD69和CXCR4用于后续验证。总共包括3个因子作为协变量，诊断(AD或对照)作为因变量。使用logistic分析中的预测值，通过接受者操作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析评估了单独或与结合使用的三个因子组合的诊断能力。我们的数据显示，对照组与AD组比较ATP5D(P＝0.040，图5A)、CD69(P＝0.010，图5B)、CXCR4(P＝0.020，图5C)在外周血B细胞中表达均具有统计学意义；ATP5D(AUC＝0.652，P＝0.0401，图5D)、CD69(AUC＝0.7482，P＝0.0008，图5E)和CXCR4(AUC＝0.6729，P＝0.0196，图5F)分别三种因子和三种因子组合(AUC＝0.7461，P＝0009，图5G)的曲线下面积(AUC)值都比较高，表明单独使用三种因子或三种因子组合可以成功地区分患有AD的受试者和对照组，表明ATP5D、CD69和CXCR4是诊断AD的有效因素。此外，分析了AD组中小于78岁和大于78岁患者ATP5D(P＝0.024，图6A)、CD69(P＜0.001，图6B)、CXCR4(P＝0.003，图6C)在外周血B细胞中表达均具有统计学意义；AD患者中年龄(大于78岁与小于78岁)的ROC曲线，显示AD患者中不同年龄ATP5D(AUC＝0.7331，P＝0.0239，图6D)、CD69(AUC＝0.9586，P＜0.0001，图6E)和CXCR4(AUC＝0.8083，P＝0.0028，图6F)分别三种因子和三种因子组合(AUC＝0.9586，P＜0001，图6G)的曲线下面积(AUC)值都比较高，表明单独使用三种因子或三种因子组合可以在高龄(大于78岁)人群中更有利于筛选AD患者，表明ATP5D、CD69和CXCR4是诊断AD的有效因素。我们还分析了三个因子对不同性别AD患者的诊断能力，结果显示男性和女性AD患者ATP5D(P＝0.674，图7A)、CD69(P＝0.492，图7B)、CXCR4(P＝0.445，图7C)在外周血B细胞中表达均无统计学意义；ATP5D(AUC＝0.5455，P＝0.6744，图7D)、CD69(AUC＝0.5744，P＝0.4918，图7E)和CXCR4(AUC＝0.5826，P＝0.4450，图7F)分别三种因子和三种因子组合(AUC＝0.5165，P＝8786，图7G)的曲线下面积(AUC)值都比较低，表明三种因子及其组合对于不同性别AD患者的诊断能力较差。

3.4试验研究结果

在这项样本(数据集1)的实验中，ATP5D、CD69、CXCR4三个因子及其组合结果显示患有AD和对照的受试者B细胞中表达有显著差异(P＞0.05)；根据年龄不同分别把AD患者样本(数据集2)分为小于78岁和大于78岁两组，发现ATP5D、CD69、CXCR4三个因子及其组合在两组间的表达存在显著差异(P＞0.05)；根据性别不同分别把AD患者样本(数据集3)分为男性和女性，发现ATP5D、CD69、CXCR4三个因子及其组合在两组间的表达无明显差异(P＜0.05)。

3.5用单细胞测序方法(scRNA-seq)健康对照组和AD患者不同阶段静脉血单个核细胞基因差异表达，从而筛选出了12表达差异基因，通过比较测序和RT-qPCR结果,选取了一直呈下调趋势ATP5D、CD69和CXCR4的3个基因,这三个基因的相对表达与CDR评分之间的相关性分析证明，ATP5D(Y＝-0.5742*X+2.942)、CD69(Y＝-1.329*X+3.737)和CXCR4(Y＝-3.607*X+11.55)的相对表达水平均与CDR评分呈负相关(图3B，p＝0.0206，p＝0.0349，p＝0.0267)。挑选出对AD具有最高预测准确性(accuracy)的3个基因作为AD候选特征基因，建立AD与正常人的预测模型。

3.6用荧光定量RT-PCR检测了33例AD确诊病人、29例正常人外周血中3个AD基因标志物相对表达量，利用AD预测模型对上述例样本(包括训练集(Training set)和测试集样本(Test set))进行分类预测，将预测结果与AD的临床诊断检测结果比较，得出本发明3个AD基因标志物对AD预测的灵敏度(Sensitivity)、特异性(Specificity)和准确性(Accuracy)，具体检测结果见ROC曲线图5D-5H和表2。

表2

上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。

同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。

一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。

最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims

1.检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因的物质在制备检测人阿尔茨海默病产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ATP5D、CD69和CXCR4基因为B淋巴细胞特异性基因。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述B淋巴细胞为CD19阳性细胞；优选的，所述B淋巴细胞来源于外周血和/或中枢神经系统。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述阿尔茨海默病患者外周血和/或中枢神经系统中B淋巴细胞数量减少；

和/或，所述阿尔茨海默病患者外周血和/或中枢神经系统中B淋巴细胞特异性基因ATP5D、CD69和CXCR4的表达水平均降低。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ATP5D、CD69和CXCR4的表达随临床痴呆症评分的增加而降低；

和/或，所述ATP5D、CD69和CXCR4的相对表达水平与临床痴呆症评分呈负相关。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质包括引物对、探针或抗体中至少一种，优选的，所述检测ATP5D引物对如下：

和/或，优选的，所述检测CD69引物对如下：

和/或，优选的，所述CXCR4引物对如下：

7.一种检测人阿尔茨海默病的产品，其特征在于，所述产品包括检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列、组合物或检测系统之任一；

和/或，所述ATP5D、CD69和CXCR4基因为B淋巴细胞特异性基因；优选的，所述B淋巴细胞为CD19阳性细胞；进一步优选的，所述B淋巴细胞来源于外周血和/或中枢神经系统。

9.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述检测人ATP5D、CD69和CXCR4基因表达的物质为引物对、探针或抗体中至少一种。

10.如权利要求7所述的产品，其特征在于，

所述ATP5D的检测引物为：

正向引物：5'-CCCCAACCAGATGTCCTTCA-3'(SEQ ID NO.3)，和反向引物：5'-TCTTCGGCCAACAACTGCA-3'(SEQ ID NO.4)；

所述CD69的检测引物为：

所述CXCR4的检测引物为：