CN104777109A - 一种脓毒症诊断方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估的方法，即外周血白细胞中线粒体呼吸链超复合物：NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR）的酶活性水平，线粒体NCR酶活性水平与脓毒症的器官功能障碍和预后存在密切相关。本发明还提供了一种检测外周血白细胞线粒体呼吸链超复合物NCR酶活性的检测方法和检测试剂。本发明提供的外周血线粒体NCR活性检测的方法可以快速、特异和灵敏的测定样本中线粒体NCR酶活性，对于脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估具有重要意义。

Description

一种脓毒症诊断方法及试剂

技术领域

本发明属于感染炎症类疾病的危重程度判定和预后评估技术领域，即脓毒症（Sepsis）的多器官功能障碍的判定和预后评估。具体而言本发明提供了一种从线粒体亚细胞水平对脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估的检测方法，该检测方法主要是测定线粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR ）的酶活性，同时本发明还提供了作为线粒体NCR的酶活性分析和检测的方法和试剂。

背景技术

脓毒症（Sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome, SIRS），是由于微生物（如细菌、真菌、病毒、寄生虫等）侵入人体而诱发的激烈全身炎症反应，并对组织具有损伤性的病理生理过程的一组临床表现，常常继发于严重疾病，如严重烧伤、多发伤、外科手术后等。严重脓毒症可以导致脓毒性休克、多器官功能障碍（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），是重症监护病房内非心脏病死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30%～70%，全球每天约14,000人死于其并发症，对人类健康和经济发展构成极大的威胁和挑战。

临床实践表明, 脓毒症的许多特异性治疗手段如抗炎治疗、促炎治疗、皮质激素的使用等都是非常危险的“双刃剑”， 这些治疗的选择必须在对病人进行正确分级、分期的基础上进行。仅仅根据临床表现和非特异性的实验室数据，盲目使用很可能导致病情恶化和脏器功能衰竭，以及对医疗资源的浪费。随着现代生物技术的发展，人们发现很多生物标志物可用于脓毒症的早期诊断、病情及预后判断、疗效评估，并以此判断疾病的病理生理状态，从而指导治疗。有效的生物学标志物检测成为了脓毒症诊断治疗的重要手段，其中比较有价值的生物标志物有C 反应蛋白、降钙素原、sTREM-1、NT-proBNP以及部分细胞因子和白细胞分化抗原等。

C 反应蛋白( C-reactive protein，CRP)系急性时相蛋白，不仅能够与细菌、真菌等微生物的多聚糖结合，而且可激活补体系统，促进噬菌作用。CRP 由肝实质细胞产生，正常人群水平在10 mg /L以下，感染发生后4～6 h 即开始升高，36～50 h 达高峰，峰值可达正常参考值的数百倍，感染消除后其水平急骤下降，1 周内可恢复至正常，而在病毒感染时无显著升高，这为早期感染类型的鉴别提供了极其重要的依据。因此，作为相关的非特异性炎性标志物被广泛应用。但CRP 对脓毒症的诊断价值差异较大，其作为成人脓毒症生物标志物具有较低的特异性，通常用于新生儿早期脓毒症的筛查。此外，其他炎症性疾病( 如烧伤、创伤、大手术、恶性肿瘤等)也可导致CRP 明显升高。

降钙素原( Procalcitonin，PCT) 是降钙素激素的前体，被视为细菌感染的可靠生物标志物之一。研究显示，正常人血清PCT浓度低于0.1ug/L，非特异性感染、病毒性炎症及局部感染等疾病时不增加或轻微增加，感染后2 h即可在血浆中迅速检测到，严重感染时可升高2000 倍以上，PCT半衰期为22~26h，与CRP等急性时相蛋白相比更具优势。研究证明PCT 的最佳阈值为0.47μg/L时，其对脓毒症的诊断灵敏度和特异度分别为83%和81%。但也有研究者质疑PCT 对脓毒症的诊断和预后的准确性，认为PCT 并不与感染严重程度相一致。一项就PCT 对脓毒症诊断价值荟萃分析发现，其平均灵敏度和特异度只有71%，受试者工作特征曲线下面积也只有0.78。虽然如此，目前，PCT水平已被用于指导急性慢性支气管炎加重，社区获得性肺炎(CAP)及脓毒症的实验性抗菌治疗。并且，PCT水平还可以和常规的临床参数一起辅助判断患者的实验性抗菌治疗是否有效。通过连续监测PCT水平来判断是否可以结束抗菌素治疗是其最有价值的应用。

髓系细胞表达触发受体-1（TREM-1）属于免疫球蛋白超家族，选择性地表达于中性粒细胞和部分单核细胞，在多种炎症反应中表达上调。机体在细菌或真菌感染时中性粒细胞和单核-巨噬细胞表面表达TREM-1 显著增加，脱落入血即sTREM-1(可溶性髓系细胞表达触发受体1)。研究证明，在区分脓毒症和非感染性炎症时， sTREM-1是一个非常有意义的早期参数。虽然如此，一项对11个研究（包括1795例患者）的荟萃分析发现，sTREM-1对脓毒症的诊断的整体灵敏度和特异性分别为79%（95%置信区间，65~89）和80%（95%置信区间，69~88），ROC曲线下面积为0.87（95%置信区间，0.84~0.89）。最终得出，血浆sTREM-1在区分脓毒症及SIRS中表现中等，不足以用于系统性炎症患者的脓毒症诊断。

尿钠肽(BNP)为活化的神经内分泌激素，由心室肌细胞产生，心肌壁及心室壁压力的增加为主要刺激源，促进BNP的释放。BNP的生理学效应包括利尿、拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统及刺激鸟苷酸环化酶引起血管扩张。NT-proBNP为BNP前体氨基末端，心室容积扩大及心力衰竭时，血浆BNP和NT-proBNP水平升高，是一种有效的心室前负荷和心功能预测标志物。脓毒症早期常出现血流动力学改变和心脏功能障碍。据报道，脓毒症、脓毒性休克及急性心衰与BNP和NT-proBNP水平升高有关。且因NT-proBNP在血液循环中比尿钠肽有更长的半衰期，这使得它具有更好的敏感性和特异性。统计分析57例脓毒症患者的数据后发现，血浆B 型尿钠肽前体N 末端水平在严重脓毒症时可作为一个早期心功能障碍和心肌抑制有用的生物指标，如果阈值定在3360 ng /L，其灵敏度为75%，特异性为90.2%。

细胞因子中有代表性的包括白细胞介素家族（IL-1、2、4、6、8、10及12）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等。这些因子在脓毒症早期有一定的诊断价值，其中研究较多的IL-6一般认为对脓毒症有重要的预测价值，且IL-6有缓慢而稳定的动力学特征，容易在血液中被检测，成为脓毒症的重要细胞因子生物标志物。研究表明，脓毒症患者血IL-6 水平明显增高，且脓毒症的严重程度及预后与其增高幅度相关，IL-6水平持续增高者多器官功能障碍综合征的发生率和病死率明显增加，如以25 ng /L为阈值时，对脓毒症有较高的诊断价值，其灵敏度为81.1%，特异度为78.9%。但也有研究显示，IL-6水平在全身炎性反应综合征和脓毒症之间的差别不大，诊断脓毒症的灵敏度( 67%) 和特异度( 65%)不高。

白细胞分化抗原是白细胞表面标志物，其异常表达通常意味着白细胞数目和功能的变化，故可能作为脓毒症的标志物，迄今报道的表面抗原包括CD10、11、14、18、25、28、40、48、64、69、80及163等。其中CD64研究较多，它选择性表达于单核/巨噬细胞，正常人成熟中性粒细胞不表达。研究发现脓毒症患者中性粒细胞表面CD64表达增加，可刺激并诱导炎症介质γ-干扰素和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的释放。中性粒细胞表面CD64可以作为区分感染、脓毒症和严重组织损伤的诊断性生物标志物，在脓毒症的早期诊断中其敏感性和特异性分别为65.8%和64.6%。另外，在炎症期，血浆蛋白酶水解CD14产生可溶性片段（sCD14），其中称为sCD14亚类（sCD14-ST）或presepsin的组分，在健康人体血清中浓度很低，但在细菌感染后升高，近期的两个研究发现presepsin是早期诊断脓毒症及评估脓毒症患者预后的有效生物标志物（灵敏度为71~72%，特异性为70~86%）。

其它生物标志物还有热休克蛋白70（Hsp70）、内皮素-1前体（proET-1）、血管生成素-1（Ang-1）、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活受体（suPAR）凝血因子、细胞凋亡产物、激素水平、调节性T细胞（Treg）、病原微生物本身及其产物（内毒素、核酸）等，但这些标志物对脓毒症的预测灵敏度和特异性相对较差，临床认可度和使用率较低。

由于脓毒症是一组综合征，机体的病理生理反应过程具有不同的阶段性特点，发病表现多样、发病机制复杂，目前还没有一个标志物的变化能完全反应其整个过程，没有一个标志物的能独立的用于脓毒症的各期预测、诊断、治疗监测及预后判断。寻找高灵敏度及特异性的脓毒症生物标志物、分析各种标志物及其组合对脓毒症的诊断价值仍是脓毒症研究的主要领域。

严重脓毒症的危害性是公认的，其发生机制仍不清楚，越来越多的证据表明，线粒体损伤在严重脓毒症及其诱导的MODS的发生发展中起到了重要作用。

线粒体是细胞氧化的重要部位，细胞生命活动所需的能量有95%来自线粒体，严重脓毒症时，重要器官线粒体功能障碍导致细胞生物能量不足，并发展为多器官功能衰竭。因此，线粒体损伤可能与严重脓毒症引起的多器官功能障碍或衰竭及不良预后密切相关。

在严重脓毒症患者中发现的线粒体损伤促使人们从线粒体亚细胞水平寻找新的可靠的生物标志物，通过该标志物再结合当前的生物标志物可能有助于脓毒症患者多器官功能障碍或衰竭的早期识别，并预测不良预后，为从线粒体水平对脓毒症进行干预来改善预后提供依据，但目前距此目标相差甚远。

我们前期的研究支持线粒体损伤与儿童严重脓毒症的多器官功能障碍及不良预后密切相关这一假设。我们发现，脓毒症儿童的外周血白细胞的线粒体中会出现严重的电子传递链（ETC）功能障碍，NCR即线粒体复合物I-III活性与脓毒症儿童的病死率呈显著负相关。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提供一种新的严重脓毒症的临床诊断和预后监测的标志物，即一种评估线粒体NCR酶活性水平的方法。同时本发明还提供用于吸光法测定线粒体NCR的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的分光光度计或酶标仪等检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，可以得到切实的推广使用。

线粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶，英文名称为NADH: cytosome C oxidoreductase，简称NCR，也经常简称为复合物I+III或复合物I-III，英文名称为complex I and III。本发明的摘要，权利要求书和说明书中用到上述名称的任何一个都是相同意思的表达。

为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供的一种诊断和监测严重脓毒症的发展和预后情况的方法，其组成为：检测脓毒症患者外周血白血细胞中的线粒体NCR酶活性水平；其降低可以用于严重脓毒症的诊断、疾病程度的监测和预后判定。

本发明提供的如权利要求书1所述的方法，其中外周血白细胞线粒体NCR的水平是通过检测其酶活力来确定的，其酶活性检测的原理为：NCR在特定条件下催化将NADH中的电子转移给电子受体辅酶Q，生成的还原型辅酶Q进一步将电子转移给氧化型细胞色素C生成还原型细胞色素C；还原型细胞色素C在特定的波长下具有特异的光吸收，在特定的条件下可检测到还原型细胞色素C的光吸收值，由于NCR催化底物反应的速率与还原型细胞色素C的生产量成正比，因此，检测还原型细胞色素C的吸光值，即可计算出NCR酶活性水平。

本发明还提供了一种线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书2所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于线粒体呼吸链超复合物NCR酶活性分析和检测。

本发明提供的如权利要求书3所述的线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2所述的电子受体氧化型细胞色素C和电子供体NADH，这种检测试剂主要用于NCR的酶活性的分析和检测。氧化型细胞色素C是辅酶Q-细胞色素C还原酶的天然底物，在反应中主要是起一种电子传递体的作用；它可以是从不同动物物种（常见的比如猪，牛和羊等）中提取获得，其来源虽然有差异，但都可以在本试剂中体现相同的作用。NADH是NADH-Q还原酶的天然底物，在反应中主要是起一种电子供体的作用。

本发明提供的如权利要求书3-4所述的线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NCR酶活力的试剂或分子。线粒体NCR酶的特异酶活性可以通过计算NCR的总活性（不加抑制剂得到的酶活力）与NCR的非特异活性（加入一定浓度的抑制剂后得到的酶活力）的差值得到。这种检测试剂主要用于NCR的酶活性的分析和检测。这种抑制剂包括但不限于以下实例：鱼藤酮、安密妥、安密妥钠盐、氰化物、叠氮钠等。

本发明提供的如权利要求书3-4所述的线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂。它的存在可以稳定NCR的物化性质，利于线粒体NCR的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：Triton x-100、Tween20、NP40、Brij-35。

本发明提供的如权利要求书3-4所述的线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括缓冲试剂。所述缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0-9.0的范围中的试剂，它的存在可以有效的稳定线粒体NCR的催化反应的pH值，并可以稳定NCR的物化性质，从而利于线粒体NCR的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：

乙酸钠/乙酸：pH 2.6-5.8

柠檬酸/柠檬酸钠：pH 3.0-6.6

磷酸氢盐/柠檬酸（盐）：pH 2.2-8.0

磷酸盐：pH 4.9-8.2

柠檬酸/氢氧化钠/盐酸：pH 2.2-6.5

MES：pH5.5-6.7

MOPS：pH6.5-7.9

HEPES：pH6.8-8.2

Tris-盐酸：pH 7.1-8.9

硼酸-硼砂缓冲液：pH7.4-9.0

本发明提供的一种外周血白细胞线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-6所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

如权利要求书6所述的缓冲液 10—1000mmol/L

pH范围 5.0—9.0

如权利要求书6所述的稳定剂 0.01%—10%

NADH 0.01—10mmol/L

如权利要求书5所述的抑制剂 0—20mmol/L

氧化型细胞色素C 0.005—1mmol/L

这种检测试剂主要用于外周血白细胞线粒体NCR还原酶的酶活性分析和检测。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双剂还是三剂，如下成分关系的本发明线粒体NCR酶活性检测试剂较为理想：

缓冲液 25 —100mmol/L

pH范围 6.5—8.0

稳定剂 0.1—0.5%

NADH 0.05—0.2mmol/L

抑制剂 0.001—0.01mmol/L

氧化型细胞色素C 0.02—0.2mmol/L

本发明的外周血线粒体NCR酶活性检测试剂可以配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液，稳定剂，NADH，氧化型细胞色素C

试剂2

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。

也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液，稳定剂，NADH

试剂2

缓冲液，稳定剂，氧化型细胞色素C

试剂3

抑制剂

试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。

本发明提供的如权利要求书2-10所述的外周血线粒体NCR酶活性测定的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的线粒体呼吸链NCR酶活性；特别是可以用于分析和检测人体的各种体液、组织和细胞样本中线粒体NCR酶活性；也可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中线粒体NCR酶活性。

本发明提供的如权利要求书2-9所述的外周血线粒体NCR酶活性检测的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与外周血线粒体NCR酶活性异常导致的各种疾病。

本发明提供的如权利要求书1-10所述的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于严重脓毒症的诊断、疾病危重程度监测和预后评估。

本发明提供的如权利要求书1-12所述的方法，严重脓毒症患者外周血线粒体NCR酶活性水平明显降低，此类患者的外周血白细胞线粒体NCR酶活力往往低至正常对照该酶活性的60%及以下。

具体实施方式

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由本发明的权利要求书具体限定。

实施例一 人外周血白细胞中线粒体的提取

取人全血2ml，加入8ml裂解液（0.1mM EDTA），处理15min以破碎红细胞，3000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀即是白细胞，用生理盐水洗涤白细胞两次，3500rpm离心5min，弃上清，收集白细胞沉淀。向沉淀加入5ml细胞悬浮液（0.25M Sucrose, 5mM HEPES, 0.5mM EGTA, pH7.4）悬浮细胞，用玻璃匀浆器匀浆20次，匀浆液经1000g离心10分钟，弃沉淀，收集上清；上清于10000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀即为线粒体，线粒体可在-80℃条件下保存。

实施例二 线粒体呼吸链超复合物NCR粗酶液的制备

将实施例一制得的线粒体用悬浮介质（内含0.25M Sucrose, 5mM HEPES, 0.5mM EGTA, pH7.4）悬起，然后超声，超声10s，间歇10s，共超声10次处理，然后用BCA法定蛋白浓度为0.5ug/ul，该悬浮液即为含有呼吸链超复合物NCR的粗酶液，定好浓度后放于4℃环境中待用。

实施例三 人外周血白细胞线粒体NCR的酶活性测定

本实施例的线粒体NCR检测试剂为双剂试剂，包括

试剂1

磷酸缓冲液（pH7.2） 50mmol/L

Tween 20 0.1%

NADH 0.1mmol/L

氧化型细胞色素C 0.1mmol/L

试剂2

鱼藤酮 0.02mmol/L

被测线粒体NCR的样品实施例二中制得的含线粒体呼吸链超复合物NCR的粗酶液，粗酶液用量为10ug，反应体系200ul。本检测方法采用酶动力学法检测线粒体NCR。

总活性测定：将试剂1置于30℃环境中温浴3分钟，然后将试剂1加入到酶标仪中，30℃条件下于550nm进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描吸光值的变化，扫描时间为180秒，记录曲线变化，计算反应的斜率。

非特异活性测定：将试剂1与试剂2提前混合均匀后置于30℃环境中温浴3分钟，然后将试剂混合液加入到酶标仪中，30℃条件下于550nm进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描吸光值的变化，扫描时间为180秒，记录曲线变化，计算反应的斜率。线粒体NCR的酶活力可以从反应曲线的斜率的大小变化就看出来，我们给的酶活力单位为：每分钟每克蛋白转化底物的纳摩尔数。通过还原型细胞色素C的消光系数可以将计算得到的还原型细胞色素C的特异吸光值转化成产物还原型细胞色素C的浓度，根据蛋白用量和反应时间可计算NCR酶活性水平。

线粒体NCR特异性酶活力=总活性－非特异性活性

实施例四 脓毒症外周血白细胞线粒体NCR酶活性检测应用于严重脓毒症的诊断、疾病程度监测和预后评估

以经临床确诊的脓毒症患儿为研究对象，以年龄性别相匹配的健康志愿者为对照，采用实施例一、二和三所描述的方法，提取2组外周血白细胞中的线粒体后，对上述样品进行线粒体NCR酶活性测定，每个样本分别进行3次独立的测定实验，结果显示：样本的NCR测定实验结果稳定（CV值均小于5%），其中脓毒症患者外周血线粒体NCR酶活性水平与对照组存在显著差异，仅为对照组的60%左右，而脓毒症死亡组与存活组的外周血线粒体NCR酶活性水平之间存在显著差异。其余酶复合物活性中脓毒症与对照组相比基本无差异（见表1）。可见本发明提供的外周血白细胞线粒体NCR酶活性的检测方法和试剂稳定、特异、可靠，可应用于临床检测与线粒体NCR酶活性异常相关的疾病。线粒体NCR酶活性水平与脓毒症的病情严重程度与预后情况存在明显的正相关性，因此，线粒体NCR酶活性水平可以作为严重脓毒症诊断、疾病危重程度监测及预后评估的标志物。

表1 线粒体呼吸链超复合物NCR检测结果

	NADH: Q氧化还原酶	琥珀酸: 细胞色素C氧化还原酶*	NADH: 细胞色素C氧化还原酶(NCR)	细胞色素C氧化酶 (Complex IV)
					脓毒症患者(A)	110.02±18.92	176.32±38.03	604.22±95.44	133.74±43.49
95% CI (A)	104.64-115.39	165.51-187.12	520.26-688.19	121.38-146.10
					健康对照(B)	107.42±15.50	184.10±29.43	936.03±58.66	138.39±25.73
95% CI (B)	103.02-111.83	175.74-192.47	890.94-981.12	131.08-145.70
					P (A vs B)	0.455	0.266	0.000	0.517
存活组(C)	108.36±16.86	178.25±36.28	709.20±29.18	132.90±44.42
					95% CI (C)	102.48-114.24	165.59-190.91	629.24-789.17	117.40-148.40
死亡组(D)	113.55±22.89	172.21±42.44	381.14±02.51	135.52±42.82
					95% CI (D)	101.35-125.75	149.60-194.83	219.94-542.34	112.70-158.34
P (C vs D)	0.370	0.606	0.000	0.845

*酶活力检测体系中额外添加辅酶Q。

总之，实践证明，采用本发明的线粒体NCR酶活性检测方法和试剂完全可以通过一般的分光检测设备检测得出所需的测定结果，灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于临床检测与线粒体NCR酶活性异常的相关疾病，包括严重脓毒症。

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Claims (13)

1.一种从线粒体水平诊断脓毒症、监测危重程度和评估预后的方法，其组成为：脓毒症患者外周血白血细胞中线粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR）的酶活性水平；线粒体NCR酶活性下降用于脓毒症的诊断、危重程度的监测和不良预后的评估。

2.如权利要求书1所述的方法，其中线粒体NCR功能水平是通过检测其酶活力来确定的，该酶活性检测的原理为：NCR在特定条件下催化将NADH中的电子转移给电子受体辅酶Q，生成还原型辅酶Q进一步将电子转移给氧化型细胞色素C生成还原型细胞色素C；还原型细胞色素C在特定波长下具有特异的光吸收，在特定条件下可检测到还原型细胞色素C的光吸收值，由于NCR催化底物的反应速率与还原型细胞色素C的生产量成正比，因此，检测还原型细胞色素C的吸光值，就可以计算出NCR的酶活性水平。

3.一种NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书2所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于NCR活性分析和检测。

4.如权利要求书3所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2所述的电子受体氧化型细胞色素C和电子供体NADH，这种检测试剂主要用于NCR的酶活性的分析和检测。

5.如权利要求书3-4所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NCR酶活力的试剂或分子。

6.如权利要求书3-4所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0-9.0的范围中的试剂。

7.一种NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-6所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：

如权利要求书6所述的缓冲液 10-1000mmol/L

pH范围 5.0—9.0

如权利要求书6所述的稳定剂 0.01%—10%

NADH 0.01—10mmol/L

如权利要求书5所述的抑制剂 0—20mmol/L

氧化型细胞色素C 0.005—1mmol/L

该检测试剂主要用于NCR的酶活性分析和检测。

8.根据权利要求7所述线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、NADH、抑制剂、氧化型细胞色素C组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、NADH、氧化型细胞色素C组成；试剂2，由抑制剂组成。

9.根据权利要求8所述线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、NADH、抑制剂、氧化型细胞色素C组成三剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、NADH组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氧化型细胞色素C组成；试剂3，由抑制剂组成。

10.如权利要求书2-9所述的线粒体NCR酶活性测定的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的线粒体NCR酶；特别是可以用于分析和检测人体的各种体液、组织和细胞样本中的线粒体NCR酶活性；也可以用于分析和检测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的NCR酶活性。

11.如权利要求书2-9所述的线粒体NCR酶活性检测的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与线粒体NCR酶活性异常导致的各种疾病。

12.如权利要求书1-10所述的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于诊断脓毒症、多器官功能障碍的判定、监测危重程度和评估预后。

13.如权利要求书1-12所述的方法和试剂，脓毒症严重发展的患者其线粒体NCR的酶活性水平明显降低，低至正常对照酶活性的60%及以下。