CN108037082A - 一种测定线粒体泵氢能力的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定线粒体泵氢能力的新方法，属于科研实验领域，包括以下步骤：S1：将磁力搅拌器置于分光光度计比色杯架下方；S2：将分光光度计设置到时间扫描状态；S3：将比色杯放入分光光度计中，并加入KCl，启动磁力搅拌器，开始扫描；S4：加入8‑羟基‑1,3,6‑三磺酸芘；S5：加入亚铁细胞色素c、缬氨霉素、2,3‑二甲氧基‑5‑甲基‑6‑(10‑溴基)‑1,4‑苯醌和线粒体溶液；S6：吸收线走平后记录吸收值A1；S7：加入1μl 5mM的铁氰化钠，记录吸收值A2；S8：加入质子载体羰基氰化氯苯腙，记录吸收值A3；S9：加入铁氰化钠，记录吸收值A4；S10：计算泵氢能力(H+/e)＝x/y＝(A1‑A2)/(A3‑A4)。本方法设计合理，操作简单，受环境干扰小，测定结果的精确度和重复性好，适合一般实验室应用。
Description
技术领域
本发明涉及科研实验技术领域，具体是涉及一种测定线粒体泵氢能力的新方法。
背景技术
生物体通过呼吸作用将糖类、蛋白质、脂肪等营养物质氧化分解，同时通过氧化磷酸化，将这些有机物中储藏的能量转化为化学能，不断供给生理活动的需要。
这些过程主要是在线粒体中进行和完成的。线粒体进行电子传递时，会同时将线粒体中的H+泵到线粒体膜外，这样就形成了膜内外的H+浓度差，即质子动力势。在质子动力势的推动下，线粒体内膜上的ATP酶就可以合成ATP，ATP是生物体各种生命活动的直接能量来源。因此，线粒体被看作是细胞内的“动力工厂”。研究线粒体的泵氢能力是研究线粒体结构和功能的重要环节。
传统的研究线粒体泵氢能力的方法是酸度计法，此法需要多种仪器的配合，如高灵敏度酸度计、磁力搅拌器、记录仪等，实验结果受电磁、震动等外界环境的影响较大。另外，操作过程也过于复杂。这些都降低了实验结果的重复性和可靠性。
发明内容
本发明解决的技术问题是：现有技术中的研究线粒体泵氢能力的方法操作复杂，受干扰因素多，导致结果误差大，降低了重复性和可靠性；进而提供了一种测定线粒体泵氢能力的新方法。
本发明的技术方案如下：
一种测定线粒体泵氢能力的新方法，包括以下步骤：
S1：将磁力搅拌器置于分光光度计比色杯架下方；
S2：将分光光度计设置到时间扫描状态，扫描波长为475nm；
S3：将比色杯放入分光光度计中，并加入1.6ml 150mM KCl作为反应液；把磁力搅拌器转子放入比色杯中，并启动磁力搅拌器；然后调零，开始扫描；
S4：往比色杯反应液中加入5.7μl 14mM的8-羟基-1,3,6-三磺酸芘，使之终浓度为50μM；
S5：待吸收线走平后，往比色杯反应液加入2μl 2mM的亚铁细胞色素c、2μl 0.2mg/ml的缬氨霉素、5μl 5mM的2,3-二甲氧基-5-甲基-6-(10-溴基)-1,4-苯醌和50μl 0.5g/ml的线粒体溶液；
S6：待吸收线走平后，记录吸收值A1；
S7：往比色杯反应液中加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A2；
S8：往比色杯反应液再加入2μl 0.25mg/ml的质子载体羰基氰化氯苯腙；待吸收线变平后，记录吸收值A3；
S9：往比色杯反应液中再加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A4；
S10：计算泵氢能力(H+/e)＝x/y＝(A1-A2)/(A3-A4)。
进一步地，在上述方案中，所述磁力搅拌器为微型磁力搅拌器。
进一步地，在上述方案中，所述比色杯的尺寸为：1×1×3cm。
进一步地，在上述方案中，所述线粒体溶液的分离提纯方法为：
1)制备线粒体粗制品：
将待测生物体投入至研磨缓冲液中，匀浆研磨处理5-10min，再在-15℃冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎，250目过滤，过滤液于8～10℃，2800～3000r/min离心8～10min，收集沉淀，即为线粒体粗制品；
2)酶解处理：
在步骤1)得到的线粒体粗制品中，按1:4～10的体积比加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入酶解液，3～5℃酶解0.5～0.8h，得到酶解液；再将终止酶解反应后的溶液中按1:1的体积比加入洗涤缓冲液，于3～5℃，5000～6000r/min离心8～10min，收集沉淀；
3)配制线粒体提取液：
20mM焦碳酸二乙酯、40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCls、0.3mM异硫氰酸胍、10mM甘露醇、5mM EDTA、20mM聚乙烯吡咯烷酮40000、0.5mM胎牛血清、5mM KH2PO4、100ml蒸馏水，用KOH调整溶液pH值至7.5；
4)配制清洗液：
50mMTris-HCl、0.5M氯酸钠、5mM醋酸钠、5mM KH2PO4溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.5；
5)配制Percoll梯度：
分别取体积比45％，22％，11.5％Percoll混悬液溶于50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液中；
6)线粒体提取分离：
将步骤2)的沉淀取1mg悬浮于1ml清洗液中，将Percoll梯度液按45％，22％，11.5％顺序体积比1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于4℃，3000r/min离心20min，离心后线粒体在45％和22％Percoll之间，为乳白色；将纯化的线粒体溶液用30倍体积的清洗液稀释后，在4℃，6000r/min离心30min，得纯线粒体，用清洗液悬浮，即成。
更进一步地，所述研磨缓冲液的组分为：40～47mmol·L-1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺，0.2～1.8mmol·L-1NaCl,100～120mmol·L-1蔗糖，2～8mmol·L-1beta-巯基乙醇，5-20mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮，5～9mg·L-1牛血清白蛋白，12～26μg·L-1EDTA，所述研磨缓冲液pH为7.5。
所述悬浮缓冲液的组分为：2-6wt％的PEG-6000、20-26wt％的EDTA、3-10wt％的乙二胺四乙酸二钠、5-8wt％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、1.8wt％的巯基乙醇、0.6wt％的PC-300。
所述洗涤缓冲液的组分为：5-8wt％的谷胱甘肽、0.3-0.8wt％的KCl、2-4wt％的甲醇、8-14wt％乙酸钠、5-6wt％的HEPES。
本发明设计的研磨缓冲液、悬浮缓冲液和洗涤缓冲液非常适合于生物体线粒体的分离提纯，能够使得到线粒体纯度更高，品质更好。
进一步地，在上述方案中，重复所述步骤S3-S10多次，将测得的数值求平均值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的方法设计合理，操作过程简单，受环境干扰小，其测定结果的精确度和重复性优于常规的酸度计法。
(2)本发明的方法不需要复杂、价值昂贵的仪器设备，适合一般实验室应用。
附图说明
图1是分光光度计记录的时间扫描图，扫描波长为475nm。
图2是附图1的局部放大。
其中，箭头1表示往比色杯反应液中加入8-羟基-1,3,6-三磺酸芘；箭头2表示加入亚铁细胞色素c、缬氨霉素、2,3-二甲氧基-5-甲基-6-(10-溴基)-1,4-苯醌和线粒体溶液；箭头3表示加入铁氰化钠；箭头4表示加入羰基氰化氯苯腙；箭头5表示加入铁氰化钠。
图中x表示第一次加入铁氰化钠时，475nm处吸光度的下降值，即A1-A2；y表示第二次加入铁氰化钠时，475nm处吸光度的下降值，即A3-A4。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行更一步详细的说明：
实施例1：
一种测定线粒体泵氢能力的新方法，包括以下步骤：
S1：将微型磁力搅拌器(购于上海司乐S21-1)置于分光光度计(购于日立UV-3000,日本)比色杯架下方；
S2：将分光光度计设置到时间扫描状态，扫描波长为475nm；
S3：将比色杯(1×1×3cm)放入分光光度计中，并加入1.6ml 150mM KCl作为反应液；把磁力搅拌器转子放入比色杯中，并启动磁力搅拌器；然后调零，开始扫描；
S4：往比色杯反应液中加入5.7μl 14mM的8-羟基-1,3,6-三磺酸芘，使之终浓度为50μM；
S5：待吸收线走平后，往比色杯反应液加入2μl 2mM的亚铁细胞色素c、2μl 0.2mg/ml的缬氨霉素、5μl 5mM的2,3-二甲氧基-5-甲基-6-(10-溴基)-1,4-苯醌和50μl 0.5g/ml的线粒体溶液；
S6：待吸收线走平后，记录吸收值A1为0.433；
S7：往比色杯反应液中加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A2为0.371；
S8：往比色杯反应液再加入2μl 0.25mg/ml的质子载体羰基氰化氯苯腙；待吸收线变平后，记录吸收值A3为0.361；
S9：往比色杯反应液中再加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A4为0.329；
S10：计算泵氢能力(H+/e)＝x/y＝(A1-A2)/(A3-A4)＝(0.433-0.371)/(0.361-0.329)＝1.938；
S11：再重复所述步骤S3-S10两次，得到线粒体的泵氢能力(H+/e)分别为1.882和1.902。三次的平均值为1.907±0.028。
其中，所述线粒体溶液的分离提纯方法为：
1)制备线粒体粗制品：
将待测生物体投入至研磨缓冲液中，匀浆研磨处理5min，再在-15℃冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎，250目过滤，过滤液于8℃，2800r/min离心8min，收集沉淀，即为线粒体粗制品；所述研磨缓冲液的组分为：40mmol·L-1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺，0.2mmol·L-1NaCl，100mmol·L-1蔗糖，2mmol·L-1beta-巯基乙醇，5mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮，5mg·L-1牛血清白蛋白，12μg·L-1EDTA，所述研磨缓冲液pH为7.5；
2)酶解处理：
在步骤1)得到的线粒体粗制品中，按1:4的体积比加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入酶解液，3℃酶解0.5h，得到酶解液；再将终止酶解反应后的溶液中按1:1的体积比加入洗涤缓冲液，于3℃，5000r/min离心8min，收集沉淀；所述悬浮缓冲液的组分为：2wt％的PEG-6000、20wt％的EDTA、3wt％的乙二胺四乙酸二钠、5wt％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、1.8wt％的巯基乙醇、0.6wt％的PC-300；所述洗涤缓冲液的组分为：5wt％的谷胱甘肽、0.3wt％的KCl、2wt％的甲醇、8wt％乙酸钠、5wt％的HEPES；
3)配制线粒体提取液：
20mM焦碳酸二乙酯、40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCls、0.3mM异硫氰酸胍、10mM甘露醇、5mM EDTA、20mM聚乙烯吡咯烷酮40000、0.5mM胎牛血清、5mM KH2PO4、100ml蒸馏水，用KOH调整溶液pH值至7.5；
4)配制清洗液：
50mM Tris-HCl、0.5M氯酸钠、5mM醋酸钠、5mM KH2PO4溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.5；
5)配制Percoll梯度：
分别取体积比45％，22％，11.5％Percoll混悬液溶于50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液中；
6)线粒体提取分离：
将步骤2)的沉淀取1mg悬浮于1ml清洗液中，将Percoll梯度液按45％，22％，11.5％顺序体积比1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于4℃，3000r/min离心20min，离心后线粒体在45％和22％Percoll之间，为乳白色；将纯化的线粒体溶液用30倍体积的清洗液稀释后，在4℃，6000r/min离心30min，得纯线粒体，用清洗液悬浮，即成。
实施例2：与实施例1不同之处在于，所述线粒体溶液的分离提纯方法为：
1)制备线粒体粗制品：
将待测生物体投入至研磨缓冲液中，匀浆研磨处理10min，再在4℃冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎，250目过滤，过滤液于10℃，3000r/min离心10min，收集沉淀，即为线粒体粗制品；所述研磨缓冲液的组分为：47mmol·L-1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺，1.8mmol·L-1NaCl，120mmol·L-1蔗糖，8mmol·L-1beta-巯基乙醇，20mg·L-1聚乙烯吡咯烷酮，9mg·L-1牛血清白蛋白，26μg·L-1EDTA，所述研磨缓冲液pH为7.5；
2)酶解处理：
在步骤1)得到的线粒体粗制品中，按1:10的体积比加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入酶解液，5℃酶解0.8h，得到酶解液；再将终止酶解反应后的溶液中按1:1的体积比加入洗涤缓冲液，于5℃，6000r/min离心10min，收集沉淀；所述悬浮缓冲液的组分为：6wt％的PEG-6000、26wt％的EDTA、10wt％的乙二胺四乙酸二钠、8wt％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、1.8wt％的巯基乙醇、0.6wt％的PC-300；所述洗涤缓冲液的组分为：8wt％的谷胱甘肽、0.8wt％的KCl、4wt％的甲醇、14wt％乙酸钠、6wt％的HEPES；
3)配制线粒体提取液：
20mM焦碳酸二乙酯、40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCls、0.3mM异硫氰酸胍、10mM甘露醇、5mMEDTA、20mM聚乙烯吡咯烷酮40000、0.5mM胎牛血清、5mM KH2PO4、100ml蒸馏水，用KOH调整溶液pH值至7.5；
4)配制清洗液：
50mM Tris-HCl、0.5M氯酸钠、5mM醋酸钠、5mM KH2PO4溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.5；
5)配制Percoll梯度：
分别取体积比45％，22％，11.5％Percoll混悬液溶于50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液中；
6)线粒体提取分离：
将步骤2)的沉淀取1mg悬浮于1ml清洗液中，将Percoll梯度液按45％，22％，11.5％顺序体积比1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于4℃，3000r/min离心20min，离心后线粒体在45％和22％Percoll之间，为乳白色；将纯化的线粒体溶液用30倍体积的清洗液稀释后，在4℃，6000r/min离心30min，得纯线粒体，用清洗液悬浮，即成。
Claims (6)
1.一种测定线粒体泵氢能力的新方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将磁力搅拌器置于分光光度计比色杯架下方；
S2：将分光光度计设置到时间扫描状态，扫描波长为475nm；
S3：将比色杯放入分光光度计中，并加入1.6ml 150mM KCl作为反应液；把磁力搅拌器转子放入比色杯中，并启动磁力搅拌器；然后调零，开始扫描；
S4：往比色杯反应液中加入5.7μl 14mM的8-羟基-1,3,6-三磺酸芘，使之终浓度为50μM；
S5：待吸收线走平后，往比色杯反应液加入2μl 2mM的亚铁细胞色素c、2μl 0.2mg/ml的缬氨霉素、5μl 5mM的2,3-二甲氧基-5-甲基-6-(10-溴基)-1,4-苯醌和50μl 0.5g/ml的线粒体溶液；
S6：待吸收线走平后，记录吸收值A1；
S7：往比色杯反应液中加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A2；
S8：往比色杯反应液再加入2μl 0.25mg/ml的质子载体羰基氰化氯苯腙；待吸收线变平后，记录吸收值A3；
S9：往比色杯反应液中再加入1μl 5mM的铁氰化钠，启动反应；待反应完毕吸收线变平时，记录吸收值A4；
S10：计算泵氢能力(H+/e)＝x/y＝(A1-A2)/(A3-A4)。
2.根据权利要求1所述的一种测定线粒体泵氢能力的新方法，其特征在于，所述磁力搅拌器为微型磁力搅拌器。
3.根据权利要求1所述的一种测定线粒体泵氢能力的新方法，其特征在于，所述比色杯的尺寸为：1×1×3cm。
4.根据权利要求1所述的一种测定线粒体泵氢能力的新方法，其特征在于，所述线粒体溶液的分离提纯方法为：
1)制备线粒体粗制品：
将待测生物体投入至研磨缓冲液中，匀浆研磨处理5-10min，再在-15℃冰浴中用超声波细胞破碎仪破碎，250目过滤，过滤液于8～10℃，2800～3000r/min离心8～10min，收集沉淀，即为线粒体粗制品；
2)酶解处理：
在步骤1)得到的线粒体粗制品中，按1:4～10的体积比加入悬浮缓冲液，混匀，然后加入酶解液，3～5℃酶解0.5～0.8h，得到酶解液；再将终止酶解反应后的溶液中按1:1的体积比加入洗涤缓冲液，于3～5℃，5000～6000r/min离心8～10min，收集沉淀；
3)配制线粒体提取液：
20mM焦碳酸二乙酯、40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCls、0.3mM异硫氰酸胍、10mM甘露醇、5mM EDTA、20mM聚乙烯吡咯烷酮40000、0.5mM胎牛血清、5mM KH2PO4、100ml蒸馏水，用KOH调整溶液pH值至7.5；
4)配制清洗液：
50mMTris-HCl、0.5M氯酸钠、5mM醋酸钠、5mM KH2PO4溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.5；
5)配制Percoll梯度：
分别取体积比45％，22％，11.5％Percoll混悬液溶于50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液中；
6)线粒体提取分离：
将步骤2)的沉淀取1mg悬浮于1ml清洗液中，将Percoll梯度液按45％，22％，11.5％顺序体积比1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于4℃，3000r/min离心20min，离心后线粒体在45％和22％Percoll之间，为乳白色；将纯化的线粒体溶液用30倍体积的清洗液稀释后，在4℃，6000r/min离心30min，得纯线粒体，用清洗液悬浮，即成。
5.根据权利要求1所述的一种测定线粒体泵氢能力的新方法，其特征在于，重复所述步骤S3-S10多次，将测得的数值求平均值。
6.根据权利要求1所述的一种测定线粒体泵氢能力的新方法，其特征在于，重复所述步骤S3-S10，将测得的数值求平均值。
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