CN102818893B

CN102818893B - 金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用

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Publication number: CN102818893B
Application number: CN 201210309662
Authority: CN
Inventors: 魏琴; 吴丹; 郭爱平; 张勇; 李贺; 杜斌; 马洪敏; 于海琴; 庞雪辉; 朱宝存; 崔振涛; 王志玲; 闫良国; 罗川南; 孙蒙; 范大伟
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2032-08-28
Also published as: CN102818893A

Abstract

本发明涉及一种金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用，属于新型功能材料、生物传感与临床检验技术领域。本发明利用AuPd核壳纳米材料，具有比表面积大，生物相容性好，催化效率高等特点，显著提高了免疫传感器的灵敏度。该方法采用AuPd核壳纳米材料固载一抗和标记二抗，通过层层自组装构建一种肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器。本发明的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器优点在于灵敏度高、特异性好、易于操作，能实现血清样品中多种肺癌肿瘤标志物的灵敏、快速、准确检测，对肺癌的早期诊断具有重要的意义。

Description

金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用

技术领域

本发明涉及一种金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备及应用。具体是采用AuPd核壳纳米材料构建的检测多种肺癌肿瘤标志物的标记型电化学免疫传感器，属于新型功能材料、生物传感与临床检验技术领域。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的疾病之一，具有高发病率和高死亡率，若在癌症发展的早期阶段将其诊断出来，将显著提高病人的存活率。

因此，早期肿瘤诊断已成为人们研究的热点问题【参见：(a) Rükan G.; Deirdre M.; Alex F.;Mayreli O.; Ciara K. O’Sullivan. Anal. Chem., 2011, 83 (2), 563-570. (b) Zhong Z.Y.; Peng N.; Qing Y.; Shan J.L.; Li M.G.; Guan W.; Dai N.; Gu X.Q.; Wang D. Electrochimica Acta, 2011, 56, 5624-5629. (c) Zhang H.S.; Qi S.W. Clinica Chimica Acta, 2011, 412, 1572-1577.】。

肿瘤标志物是在肿瘤发生和增殖过程中，机体内产生的某种特异性物质，通过这些特殊物质的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。

目前临床研究较多，相对比较认同的肺癌相关肿瘤标志物有癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC）、细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）、组织多肽抗原（TPA）、糖类抗原（CA125）、糖类抗原（CA242）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）等七种肿瘤标志物。

检测肿瘤标志物的方法主要有放射免疫测定法、酶免疫分析测定法、化学发光免疫分析等，这些检测方法具有如下特点：

（1）放射免疫测定法：该法在生物医学各个领域已得到广泛的应用，其具有操作简便、成本低等优点，但其放射性污染严重，灵敏度低，使其应用受到限制。

（2）酶免疫分析测定法：该法标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，得到了迅速地普及和发展，但因酶容易失活，导致其信号时间短，降低了方法的灵敏度和重现性。

（3）化学发光免疫分析测定法：该法具有灵敏度高、选择性强、重现性好、易于操作等优点，但其影响化学发光分析检测结果的因素较多，稳定性较差，且在发生化学反应之后，样品的发光无法再现。

为解决上述方法存在的不足，本发明制备了一种无放射性污染、设备简单、操作方便、灵敏度高、重现性好、特异性强的电化学免疫传感器。

近年来，纳米材料在单分子水平的各种探针技术、纳米集成阵列器件、电极表面修饰等方面的研究取得了突飞猛进的发展。

AuPd核壳纳米材料，具有大的比表面积，优越的电化学催化性能，以及良好的生物相容性等特性，可直接用于固载和标记生物分子。

本发明采用AuPd核壳纳米材料同时固载一抗和标记二抗，这样既保留了Au、Pd两种贵金属纳米材料的性能优势，又简化了操作步骤，增强了传感器的稳定性，体现出优异的协同增敏效果；同时提高了电极表面的电子传递效率，降低了检测限，增加了电化学免疫传感器的检测灵敏度，制备了一种适用于检测多种肺癌肿瘤标志物的电化学免疫传感器。

目前CN201110043433.1公开了一种非标记型电流型免疫传感器及其制备方法及应用，该传感器对癌胚抗原（CEA）的检测限达到3pg·mL^-1，本发明CEA的检测限可以达到0.32pg·mL^-1。

CN03113053.4公开了一种检测CA125无试剂安培免疫传感器，采用酶标记抗体。

本发明制备了一种无酶肺癌肿瘤标志物免疫传感器，其制备过程简单、成本较低，对7种肺癌肿瘤标志物的检测限在0.30~0.41pg·mL^-1范围内，由此可见，灵敏度得到了显著提高，所制备的传感器能够快速、特异、灵敏地检测，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。

发明内容

本发明的目的之一是避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、对检验人员的高技能要求及仅检测一种肺癌肿瘤标志物的缺点，提供一种低成本、高灵敏、特异性的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备方法，其制备技术成熟可靠。

本发明的目的之二是提供所制备的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的应用，所述的电化学免疫传感器可以准确快速地检测出多种肺癌肿瘤标志物。

本发明的技术方案如下：

1. 本发明的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）AuPd核壳纳米材料的制备；

（2）AuPd标记的二抗的制备；

（3）肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备。

（1）中所述的AuPd核壳纳米材料的制备，步骤如下：

1）金纳米粒子胶体溶液的制备：在三口烧瓶中加入0.008~0.012g HAuCl₄·3H₂O，加入90~110mL超纯水，磁力搅拌，沸腾时加入2.5~3.5mL的质量分数为1%的柠檬酸钠，持续搅拌，溶液变成酒红色，保持沸腾40~50min，直至金纳米粒子胶体溶液的颜色不再变化，待反应完成后，冷却至室温。

2）氯钯酸溶液的制备：取0.0638g PdCl₂，加入0.5 ~0.7mL的1.2mol·L^-1 HCl，加超纯水稀释至3mL，超声至完全溶解。

3）AuPd核壳纳米材料的制备：取55~65mL金纳米粒子胶体溶液，置于4℃水浴中，搅拌加入1.0~2.0mL H₂PdCl₄溶液，然后缓慢加入14~18mL 10mmol·L^-1的抗坏血酸，搅拌，反应30~40min，离心分离，去除上清液，洗涤4~5次，真空干燥，制得AuPd核壳纳米材料。

（2）中所述的AuPd标记的二抗的制备，步骤如下：

取浓度1mL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的二抗，加入1~3mg AuPd，充分混合，4℃震荡培养22~26h ，然后，4℃冷冻离心，去除上清液，加入1mL pH=7.0~7.8的磷酸盐缓冲液，制得AuPd标记的二抗，4℃储存备用。

（3）中所述的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，步骤如下：

1）将直径4mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面；

2）将6~8μL AuPd混合溶液滴涂到步骤1）处理后的玻碳电极表面，室温干燥；

3）在步骤2）修饰的工作电极表面滴涂5~7μL 10μg·mL^-1肺癌肿瘤标志物的一抗，4℃保存至干燥；

4）在步骤3）修饰的工作电极表面滴涂3~4μL 100μg·mL^-1牛血清白蛋白，4℃保存至干燥，超纯水清洗，晾干成膜，4℃储存；

5) 在步骤4）处理后的工作电极表面滴涂5~7μL不同浓度的肺癌肿瘤标志物抗原，4℃保存至干燥；

6）在步骤5）修饰的工作电极表面滴涂5~7μL AuPd标记的肺癌肿瘤标志物的二抗，4℃保存至干燥，制得肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器。

2．本发明所述的制备的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，其特征是包括以下步骤：

（1）本发明将所述肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器作为工作电极，将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和工作电极正确连接在电化学工作站上；

（2）在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，每隔相同时间段连续加入0.5~1.5mmol H₂O₂，通过计时电流法检测电流的响应变化；

（3）根据所得的电流差值与肺癌肿瘤标志物浓度的线性关系，绘制工作曲线。

3. 本发明所述的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器，其特征是所述肺癌肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC）、细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）、组织多肽抗原（TPA）、糖类抗原（CA125）、糖类抗原（CA242）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）。

本发明的有益成果

（1）AuPd核壳纳米材料具有比表面积大、导电性好、电催化活性高和生物相容性好的特点，是一种理想的电极修饰和标记材料，显著改善了传感器的性能，使制备的传感器具有较低的检出限和较高的灵敏度。

（2）采用AuPd核壳纳米材料修饰电极、固载一抗，同时标记二抗，这样既避免了交联剂的使用，又减小了对抗体活性的影响，简化了操作手续。

（3）利用AuPd核壳纳米材料制备无酶传感器，避免了酶的失活问题，从而使制备的传感器稳定性好、结果的重现性高。

（4）采用AuPd核壳纳米材料同时固载一抗和标记二抗，这样既保留了Au、Pd两种贵金属纳米材料的性能优势，体现出优异的协同增敏效果。

（5）利用抗原与抗体的特异性结合构建了肺癌肿瘤标志物免疫传感器，实现了七种不同肺癌肿瘤标志物的特异性识别。

（6）本发明传感器用于不同肺癌肿瘤标志物的测定，灵敏度高、特异性好、操作简单快速，体系易于集成化、微型化和商品化。

附图说明

图1为AuPd核壳纳米材料的透射电镜。

图2为金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备过程示意图。

图2中GCE为玻碳电极，BSA为牛血清白蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器制备方法

（1）AuPd核壳纳米材料的制备，步骤如下：

1）金纳米粒子胶体溶液的制备：在三口烧瓶中加入0.010g HAuCl₄·3H₂O，加入100mL超纯水，磁力搅拌，沸腾时加入3mL的质量分数为1%的柠檬酸钠，持续搅拌，溶液变成酒红色，保持沸腾40min，直至金纳米粒子胶体溶液的颜色不再变化，待反应完成后，冷却至室温。

2）氯钯酸溶液的制备：取0.0638g PdCl₂，加入0.6mL的1.2mol·L^-1 HCl，加超纯水稀释至3mL，超声至完全溶解。

3）AuPd核壳纳米材料的制备：取60mL金纳米粒子胶体溶液，置于4℃水浴，搅拌加入1.5mL H₂PdCl₄溶液，缓慢加入16mL 10mmol·L^-1的抗坏血酸，搅拌，反应30min，离心分离，去除上清液，并洗涤4~5次，真空干燥，制得AuPd核壳纳米材料，其纳米材料的形貌见图1，由图1可以看出，AuPd为核壳型结构，其粒径为40nm，材料分散性好、颗粒均匀，是一种可用于制备电化学免疫传感器的优质材料。

（2）AuPd标记的二抗的制备，步骤如下：

取浓度1mL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的二抗，加入2mg AuPd，充分混合，4℃震荡培养24h，4℃冷冻离心，去除上清液，加入1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液，制得AuPd标记的二抗，4℃储存备用。

（3）肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，步骤如下：

1）将直径4mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面；以下根据图2 金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备过程示意图进行制备；

2）将6μL的AuPd混合溶液滴涂到步骤1）处理后的玻碳电极表面，室温干燥；

3）在步骤2）修饰的工作电极表面滴涂6μL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的一抗，4℃保存至干燥；

4）将步骤3）修饰的工作电极表面滴涂3μL 100μg·mL^-1牛血清白蛋白，4℃保存至干燥，超纯水清洗工作电极表面，晾干成膜，4℃储存；

5) 在步骤4）处理后的工作电极表面滴涂6μL不同浓度的肺癌肿瘤标志物抗原，4℃保存至干燥；

6）在步骤5）修饰的工作电极表面滴涂6μL AuPd标记的肺癌肿瘤标志物的二抗，4℃保存至干燥，制得肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器。

实施例2 肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器制备方法

（1）AuPd核壳纳米材料的制备，步骤如下：

1）金纳米粒子胶体溶液的制备：在三口烧瓶中加入0.008g HAuCl₄·3H₂O，然后加入90mL超纯水，进行磁力搅拌，至沸腾时加入2.5mL的质量分数为1%的柠檬酸钠，持续搅拌，溶液变成酒红色，并保持沸腾45min，直到金纳米粒子胶体溶液的颜色不再变化，待反应完成后，冷却至室温。

2）氯钯酸溶液的制备：取0.0638g PdCl₂，加入0.5mL的1.2mol·L^-1 HCl，加超纯水稀释至3mL，然后超声至完全溶解。

3）AuPd核壳纳米材料的制备：取55mL金纳米粒子胶体溶液，置于4℃水浴中，在搅拌的条件下加入1.0mL H₂PdCl₄溶液，然后缓慢加入14mL 10mmol·L^-1的抗坏血酸，搅拌，反应持续保持35min，离心分离，去除上清液，并洗涤4~5次，置于真空干燥箱干燥，制得AuPd纳米材料。

（2）AuPd标记的二抗的制备，步骤如下：

取浓度1mL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的二抗，加入1mg AuPd，充分混合，在4℃的培养箱中震荡22h，然后，在冷冻离心机中离心分离，去除上清液，再加入1mL pH=7.0磷酸盐缓冲液，制得AuPd标记的二抗，保存在4℃的冰箱中。

（3）肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，步骤如下：

1）将直径4mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面，以下根据图2金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的构建过程进行制备；

2）将6μL 的AuPd混合溶液滴涂到步骤1）处理后的玻碳电极表面，室温干燥；

3）将步骤2）修饰的工作电极表面滴涂5μL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的一抗，在4℃冰箱中保存至干燥；

4）将步骤3）修饰的工作电极表面滴涂3μL 100μg·mL^-1牛血清白蛋白，在4℃冰箱中保存至干燥，然后超纯水清洗工作电极表面，晾干成膜，保存在4℃的冰箱中；

5) 将步骤4）处理后的工作电极表面滴涂5μL不同浓度的肺癌肿瘤标志物抗原，在4℃冰箱中保存至干燥；

6）将步骤5）修饰好的工作电极表面滴涂5μL肺癌肿瘤标志物的AuPd标记的二抗，4℃冰箱中保存至干燥，制得肺癌肿瘤标志物的电化学免疫传感器。

实施例3 肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器制备方法

（1）AuPd核壳纳米材料的制备，步骤如下：

1）金纳米粒子胶体溶液的制备：在三口烧瓶中加入0.012g HAuCl₄·3H₂O，然后加入110 mL超纯水，进行磁力搅拌，至沸腾时加入3.5mL的质量分数为1%的柠檬酸钠，持续搅拌，溶液变成酒红色，并保持沸腾50min，直到金纳米粒子胶体溶液的颜色不再变化，待反应完成后，冷却至室温。

2）氯钯酸溶液的制备：取0.0638g PdCl₂，加入0.7mL的1.2mol·L^-1 HCl，加超纯水稀释至3mL，然后超声至完全溶解。

3）AuPd核壳纳米材料的制备：取65mL金纳米粒子胶体溶液，置于4℃水浴中，在搅拌的条件下加入2.0mL H₂PdCl₄溶液，然后缓慢加入18mL 10mmol·L^-1的抗坏血酸，搅拌，反应持续保持40min，离心分离，去除上清液，并洗涤4~5次，置于真空干燥箱干燥，制得AuPd纳米材料。

（2）AuPd标记的二抗的制备，步骤如下：

取浓度1mL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的二抗，加入3mg AuPd，充分混合，在4℃的培养箱中震荡26h，然后，在冷冻离心机中离心分离，去除上清液，再加入1mL pH=7.8磷酸盐缓冲液，制得AuPd标记的二抗，保存在4℃的冰箱中。

（3）肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备，步骤如下：

1）将直径4mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面，以下根据图2 金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的构建过程进行制备；

2）将8μL的AuPd混合溶液滴涂到步骤1）处理后的玻碳电极表面，室温干燥；

3）在步骤2）修饰的工作电极表面滴涂7μL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的一抗，4℃保存至干燥；

4）在步骤3）修饰的工作电极表面滴涂4μL 100μg·mL^-1牛血清白蛋白，4℃保存至干燥，超纯水清洗，晾干成膜，4℃储存；

5) 在步骤4）处理后的工作电极表面滴涂7μL不同浓度的肺癌肿瘤标志物抗原，4℃保存至干燥；

6）在步骤5）修饰好的工作电极表面滴涂7μL AuPd标记的肺癌肿瘤标志物的二抗，4℃保存至干燥，制得肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器。

实施例4 肺癌肿瘤标志物的检测方法

实施例1~3制备的肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器，用于肺癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：

（2）在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，每隔相同时间段连续加入0.5~1.5mmol H₂O₂，通过计时电流法检测对过氧化氢的响应；

（3）根据所得电流差值与肿瘤肿瘤标志物浓度的线性关系，绘制工作曲线。

实施例5 肺癌肿瘤标志物免疫传感器的性能指标测定

一种金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器制备方法及应用，包括以下步骤：

（1）选择能特异性识别肺癌肿瘤标志物的抗体，按照实施例1~3 所述的步骤制备肺癌肿瘤标志物电化学免疫传感器；

（2）按照实施例4所述的步骤进行检测。肺癌肿瘤标志物的检测技术指标见表1。

实施例6 血清中肺癌肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）的检测

（1）新鲜血液5.0mL，过夜后取上层清液，用高速离心机分离后取血清0.8mL，用磷酸盐缓冲溶液稀释五倍，备用。

（2）向血清中加入一定质量浓度的肺癌肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）标准溶液，以处理好的血清为空白，按照实施例4所述的检测方法，进行加标回收实验，测定样品中肺癌肿瘤标志物的平均回收率，结果见表2。

由表2可见，血清样品癌胚抗原（CEA）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于2.4%，平均回收率为93.3～102%，表明本发明用于血清中癌胚抗原（CEA）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

实施例7 血清中肺癌肿瘤标志物鳞状细胞癌抗原（SCC）的检测

按照实施例6的检测方法，对血清中肺癌肿瘤标志物鳞状细胞癌抗原（SCC）进行检测，结果见表3。

由表3可见，血清样品鳞状细胞癌抗原（SCC）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于2.8%，平均回收率为95.3～105%，表明本发明用于血清中癌胚抗原（CEA）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

实施例8 血清中肺癌肿瘤标志物细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）的检测

按照实施例6的检测方法，对血清中肺癌肿瘤标志物细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）进行检测，结果见表4。

由表4可见，血清样品细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于3.4%，平均回收率为96.7～105%，表明本发明用于血清中细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

实施例9 血清中肺癌肿瘤标志物组织多肽抗原（TPA）的检测

按照实施例6的检测方法，对血清中肺癌肿瘤标志物组织多肽抗原（TPA）进行检测，结果见表5。

由表5可见，血清样品组织多肽抗原（TPA）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于2.9%，平均回收率为93.5～99.0%，表明本发明用于血清中组织多肽抗原（TPA）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

实施例10 血清中肺癌肿瘤标志物糖类抗原（CA125）的检测

按照实施例6的检测方法，对血清中肺癌肿瘤标志物糖类抗原（CA125）进行检测，结果见表6。

由表6可见，血清样品糖类抗原（CA125）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于2.9%，平均回收率为94.0～98.3%，表明本发明用于血清中糖类抗原（CA125）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

实施例11 血清中肺癌肿瘤标志物糖类抗原（CA242）的检测

按照实施例6的检测方法，对血清中肺癌肿瘤标志物糖类抗原（CA242）进行检测，结果见表7。

由表7可见，血清样品糖类抗原（CA242）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于2.4%，平均回收率为96.0～98.3%，表明本发明用于血清中糖类抗原（CA242）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

实施例12 血清中肺癌肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）的检测

按照实施例6的检测方法，对血清中肺癌肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）进行检测，结果见表8。

由表8可见，血清样品神经元特异性烯醇化酶（NSE）检测结果的相对标准偏差（RSD）小于2.4%，平均回收率为94.8～98.3%，表明本发明用于血清中神经元特异性烯醇化酶（NSE）的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

Claims

1.金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）AuPd核壳纳米材料的制备，步骤如下：

取55~65mL金纳米粒子胶体溶液，置于4℃水浴中，搅拌加入1.0~2.0mL H₂PdCl₄溶液，然后缓慢加入14~18mL 10mmol·L^-1的抗坏血酸，搅拌，反应30~40min，离心分离，去除上清液，洗涤4~5次，真空干燥，制得AuPd核壳纳米材料；

（2）AuPd标记的二抗的制备，步骤如下：取浓度1mL 10μg·mL^-1的肺癌肿瘤标志物的二抗，加入1~3mg AuPd，充分混合，4℃震荡培养22~26h ，然后，4℃冷冻离心，去除上清液，加入1mL pH=7.0~7.8的磷酸盐缓冲液，制得AuPd标记的二抗，4℃储存备用；

（3）肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备。

2.根据权利要求1所述的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征是所述肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备，包括以下步骤：

（1）将直径4mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，使玻碳电极表面呈镜面；

（2）将6~8μL AuPd混合溶液滴涂到步骤（1）处理后的玻碳电极表面，室温干燥；

（3）在步骤（2）修饰的工作电极表面滴涂5~7μL 10μg·mL^-1肺癌肿瘤标志物的一抗，4℃保存至干燥；

（4）在步骤（3）修饰的工作电极表面滴涂3~4μL 100μg·mL^-1牛血清白蛋白，4℃保存至干燥，超纯水清洗，晾干成膜，4℃储存；

（5) 在步骤（4）处理后的工作电极表面滴涂5~7μL不同浓度的肺癌肿瘤标志物抗原，4℃保存至干燥；

（6）在步骤（5）修饰的工作电极表面滴涂5~7μL AuPd标记的肺癌肿瘤标志物的二抗，4℃保存至干燥，制得肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备。

3.根据权利要求1或2所述的金钯核壳材料构建肺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征是所述肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCC）、细胞角蛋白19片断（Cyfra21-1）、组织多肽抗原（TPA）、糖类抗原（CA125）、糖类抗原（CA242）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）。