CN111830102A - 一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21‑1的电化学发光免疫传感器的制备方法。具体是采用铜掺杂的Tb基MOF作为传感界面，铜掺杂的Tb基MOF具有大的比表面积和稳定的电化学发光信号。AuPdPt纳米花与铜掺杂的Tb基MOF复合，能够提高铜掺杂的Tb基MOF的导电性，并且贵金属纳米花具有催化活性，能够进一步放大电化学发光信号。本发明对CYFRA 21‑1检测的线性范围为0.1 pg·mL‑1‑100 ng·mL‑1，检测限为32 fg·mL‑1。

Description

一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传 感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法。具体是采用铜掺杂的Tb基MOF与AuPdPt纳米花的复合物作为发光材料和传感界面，制备了一种检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器，属于电化学发光传感器领域。
背景技术
肺癌发病率的逐年增长使我们必须重视对肺癌早期准确的诊断和治疗，以延长病人的寿命、改善其生活质量。因此，寻找灵敏而特异的生化指标协助诊断就成了当务之急。细胞角蛋白19片段21-1（CYFRA21-1）是细胞角蛋白19的可溶性片段，当肿瘤细胞死亡或者发生溶解时，大量的CYFRA 21-1会释放进入肿瘤患者的血液循环内，进而使血清CYFRA 21-1水平显著升高，因此能作为诊断肺癌的一个首选标志物。如何高效灵敏地检测CYFRA 21-1是目前亟待解决的问题。
目前常用的检测方法有放射免疫法、酶联免疫吸附法等，这些方法对检测的灵敏度都有所提高，但操作麻烦，费时费力。为克服以上传统分析方法的弊端，本发明设计了一种操作简单快速、灵敏度高的电化学发光免疫传感器，从而建立高灵敏度、方便、快速的检测体系，为临床诊治的普及提供支持。
电化学发光（ECL）是由电化学反应直接或间接引发的化学发光现象，作为电化学和化学发光互相交叉渗透的产物，该方法既有发光分析的超高灵敏度，又结合了电化学电位可控的优点，所以引起了分析化学和生物分析等诸多领域的高度重视。目前用于检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器大多是基于夹心型免疫传感策略，该传感策略标记步骤复杂、实验成本高且耗时长。基于此，本发明设计了一种检测CYFRA 21-1的无标型电化学发光传感器，该传感器具有操作简单、响应迅速、成本较低等优点。
传统电化学发光材料如鲁米诺、三联吡啶钌等具有固定困难、发光信号不稳定等缺点。因此，本发明制备了一种铜掺杂的Tb基MOF，该材料能够产生强而稳定的电化学发光信号且易于固定在电极表面。在本发明中，与Tb基MOF相比，该铜掺杂的Tb基MOF具有更大的比表面积和更稳定的电化学发光信号。AuPdPt纳米花具有良好的导电性与催化活性，将其与该铜掺杂的Tb基MOF复合后提高了该材料的导电性与生物相容性，进一步放大了电化学发光信号。本发明将铜掺杂的Tb基MOF作为发光材料和传感界面，构建了一种无标型电化学发光免疫传感器，实现了对CYFRA 21-1的灵敏检测。
发明内容
本发明的目的之一是合成铜掺杂的Tb基MOF并将其作为电化学发光材料。Tb基MOF呈光滑的球状，具有较大的比表面积，铜的掺杂使其表面变粗糙，比表面积进一步增大，同时电化学发光信号增强。
本发明的目的之二是合成AuPdPt纳米花并使其与铜掺杂的Tb基MOF复合，AuPdPt纳米花能够提高Tb基MOF的导电性，并且能够通过Au-NH2键与抗体相连接，同时贵金属纳米花具有催化活性，能够进一步放大电化学发光信号。
本发明的目的之三是提供一种简单易行的CYFRA 21-1传感器的制备方法。将铜掺杂的Tb基MOF作为发光材料和传感界面，不需要复杂繁琐的标记技术，即可实现对CYFRA21-1的快速灵敏检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 本发明所述的一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法，其制备步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
（2）将6 µL、浓度为2～12 mg/mL的Tb基MOF的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6 µL、浓度为1～12 µL /mL的CYFRA 21-1的抗体溶液于玻碳电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6 μL、浓度为0.0001-100 ng/mL的一系列不同浓度的CYFRA 21-1滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测CYFRA 21-1的电化学发光生物传感器。
2. 本发明所述的一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法，所述铜掺杂的Tb基MOF，其制备步骤如下：
将2 mL、浓度为20 mM的TbCl3水溶液和2 mL、浓度为20 mM的Cu(NO3)2溶液加入到5 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，在搅拌的条件下加入2 mL、浓度为40 mM 的邻苯二甲酸，磁力搅拌20分钟后，将上述溶液转移至高压反应釜中，160 ℃反应3小时。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF；
为增强铜掺杂的Tb基MOF的导电性与生物相容性，称取4.3 mg的普朗尼克 F127和0.35mg的十六烷基氯化吡啶一水合物溶解于2.5 mL蒸馏水中，在慢速搅拌下依次加入30 μL 、浓度为10 mM的HAuCl4溶液，120 μL 、浓度为10 mM的Na2PdCl4溶液和120 μL 、浓度为10 mM的K2PtCl4溶液，再加入500 μL、浓度为2.5 mg/mL的铜掺杂的Tb基MOF溶液，超声处理30分钟后缓慢加入450 μL、浓度为30.4 mM的L-抗坏血酸，在室温下剧烈搅拌1小时后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF与AuPdPt纳米花的复合物。
3. 本发明所述的一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法，用于CYFRA 21-1的检测，其步骤如下：
（1）将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描速率设置为0.1V/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（4）使用含100 mM KCl和40～140 mM K2S2O8的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的CYFRA 21-1产生的电化学发光信号强度；所述PBS缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，用0.1 M Na2HPO4和0.1 M KH2PO4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与CYFRA 21-1浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）与三联吡啶钌等发光试剂相比，Tb基MOF合成方法简单且易于固定在玻碳电极表面，具有良好的电化学发光性质。铜的掺杂使Tb基MOF的比表面积显著增大，电化学发光信号强度进一步增强；
（2）AuPdPt纳米花提高了铜掺杂Tb基MOF的导电性和生物相容性，并且能够催化共反应剂过硫酸钾的分解，从而进一步放大电化学发光信号；
（3）本发明首次将铜掺杂的Tb基MOF作为电化学发光材料，并将其作为基底构建了无标型电化学发光传感器用于CYFRA 21-1的检测。该传感器操作简单，反应迅速，可以实现对CYFRA 21-1的高选择性和高灵敏检测。本发明对CYFRA 21-1检测的线性范围为0.1 pg·mL-1-100 ng·mL-1，检测限为32 fg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1. 一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法
（1）铜掺杂的Tb基MOF的制备
将2 mL、浓度为20 mM的TbCl3水溶液和2 mL、浓度为20 mM的Cu(NO3)2溶液加入到5 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，在搅拌的条件下加入2 mL、浓度为40 mM 的邻苯二甲酸，磁力搅拌20分钟后，将上述溶液转移至高压反应釜中，160 ℃反应3小时。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF；
为增强铜掺杂的Tb基MOF的导电性与生物相容性，称取4.3 mg的普朗尼克 F127和0.35mg的十六烷基氯化吡啶一水合物溶解于2.5 mL蒸馏水中，在慢速搅拌下依次加入30 μL 、浓度为10 mM的HAuCl4溶液，120 μL 、浓度为10 mM的Na2PdCl4溶液和120 μL 、浓度为10 mM的K2PtCl4溶液，再加入500 μL、浓度为2.5 mg/mL的铜掺杂的Tb基MOF溶液，超声处理30分钟后缓慢加入450 μL、浓度为30.4 mM的L-抗坏血酸，在室温下剧烈搅拌1小时后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF与AuPdPt纳米花的复合物；
（2）电化学发光免疫传感器的制备
1）将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
2）将6 µL、浓度为4 mg/mL 的Tb基MOF的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
3）滴涂6 μL、浓度为6 μg/mL的CYFRA 21-1的抗体溶液于玻碳电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
4）滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
5）将6 μL、浓度为0.0001-100 ng/mL的一系列不同浓度的CYFRA 21-1滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
2. 所述的电化学发光免疫传感器用于CYFRA 21-1的检测
（1）将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描速率设置为0.1V/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（4）使用含100 mM KCl和40～140 mM K2S2O8的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的CYFRA 21-1产生的电化学发光信号强度；所述PBS缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，用0.1 M Na2HPO4和0.1 M KH2PO4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与CYFRA 21-1浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例2
1. 一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法
（1）Tb基MOF的制备
将3 mL、浓度为20 mM的TbCl3水溶液和3 mL、浓度为20 mM的Cu(NO3)2溶液加入到5 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，在搅拌的条件下加入3 mL、浓度为40 mM 的邻苯二甲酸，磁力搅拌20分钟后，将上述溶液转移至反应釜中，160 ℃反应3小时。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF；
为增强铜掺杂的Tb基MOF的导电性与生物相容性，称取4.3 mg的普朗尼克 F127和0.35mg的十六烷基氯化吡啶一水合物溶解于2.5 mL蒸馏水中，在慢速搅拌下依次加入30 μL 、浓度为10 mM的HAuCl4溶液，120 μL 、浓度为10 mM的Na2PdCl4溶液和120 μL 、浓度为10 mM的K2PtCl4溶液，再加入500 μL、浓度为2.5 mg/mL的铜掺杂的Tb基MOF溶液，超声处理30分钟后缓慢加入450 μL、浓度为30.4 mM的L-抗坏血酸，在室温下剧烈搅拌1小时后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF与AuPdPt纳米花的复合物；
（2）电化学发光免疫传感器的制备
1）将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
2）将6 µL、浓度为8 mg/mL的Tb基MOF的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
3）滴涂6 μL、浓度为6 μg/mL的CYFRA 21-1的抗体溶液于玻碳电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
4）滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
5）将6 μL、浓度为0.0001-100 ng/mL的一系列不同浓度的CYFRA 21-1滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
2. 所述的电化学发光免疫传感器用于CYFRA 21-1的检测
（1）将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描速率设置为0.1V/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（4）使用含100 mM KCl和40～140 mM K2S2O8的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的CYFRA 21-1产生的电化学发光信号强度；所述PBS缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，用0.1 M Na2HPO4和0.1 M KH2PO4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与CYFRA 21-1浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例3
1. 一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法
（1）Tb基MOF的制备
将6 mL、浓度为20 mM的TbCl3水溶液和6 mL、浓度为20 mM的Cu(NO3)2溶液加入到 5 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，在搅拌的条件下加入6 mL、浓度为40 mM 的邻苯二甲酸，磁力搅拌20分钟后，将上述溶液转移至高压反应釜中，160 ℃反应3小时。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF；
为增强铜掺杂的Tb基MOF的导电性与生物相容性，称取4.3 mg的普朗尼克 F127和0.35mg的十六烷基氯化吡啶一水合物溶解于2.5 mL蒸馏水中，在慢速搅拌下依次加入30 μL 、浓度为10 mM的HAuCl4溶液，120 μL 、浓度为10 mM的Na2PdCl4溶液和120 μL 、浓度为10 mM的K2PtCl4溶液，再加入500 μL、浓度为2.5 mg/mL的铜掺杂的Tb基MOF溶液，超声处理30分钟后缓慢加入450 μL、浓度为30.4 mM的L-抗坏血酸，在室温下剧烈搅拌1小时后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF与AuPdPt纳米花的复合物。
（2）电化学发光免疫传感器的制备
1）将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
2）将6 µL、浓度为10 mg/mL的Tb基MOF的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
3）滴涂6 μL、浓度为6 μg/mL的CYFRA 21-1的抗体溶液于玻碳电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
4）滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
5）将6 μL、浓度为0.0001-100 ng/mL的一系列不同浓度的CYFRA 21-1滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
2. 所述的电化学发光免疫传感器用于CYFRA 21-1的检测
（1）将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描速率设置为0.1V/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（4）使用含100 mM KCl和40～140 mM K2S2O8的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的CYFRA 21-1产生的电化学发光信号强度；所述PBS缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，用0.1 M Na2HPO4和0.1 M KH2PO4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与CYFRA 21-1浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。

Claims (3)

1.一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，电化学发光免疫传感器的制备包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
（2）将6 µL、浓度为2～12 mg/mL的铜掺杂的Tb基MOF的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6 μL、浓度为1～12 μg/mL的CYFRA 21-1的抗体溶液于玻碳电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6 μL、浓度为0.0001～100 ng/mL的一系列不同浓度的CYFRA 21-1滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法，所述铜掺杂的Tb基MOF，其特征在于，制备步骤如下：
将2 mL、浓度为20 mM的TbCl3水溶液和2 mL、浓度为20 mM的Cu(NO3)2溶液加入到5 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，在搅拌的条件下加入2 mL、浓度为40 mM的邻苯二甲酸，磁力搅拌20分钟后，将上述溶液转移至高压反应釜中，160 ℃反应3小时，冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF；
为增强铜掺杂的Tb基MOF的导电性与生物相容性，称取4.3 mg的普朗尼克 F127和0.35mg的十六烷基氯化吡啶一水合物溶解于2.5 mL蒸馏水中，在慢速搅拌下依次加入30 μL 、浓度为10 mM的HAuCl4溶液，120 μL 、浓度为10 mM的Na2PdCl4溶液和120 μL 、浓度为10 mM的K2PtCl4溶液，再加入500 μL、浓度为2.5 mg/mL的铜掺杂的Tb基MOF溶液，超声处理30分钟后缓慢加入450 μL、浓度为30.4 mM的L-抗坏血酸，在室温下剧烈搅拌1小时后，离心、洗涤、干燥得到铜掺杂的Tb基MOF与AuPdPt纳米花的复合物。
3.如权利要求1所述的一种铜掺杂的Tb基MOF检测CYFRA 21-1的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，用于CYFRA 21-1的检测的，步骤如下：
（1）将Ag/AgCl电极作为参比电极、铂电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描速率设置为0.1V/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（4）使用含100 mM KCl和40～140 mM K2S2O8的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的CYFRA 21-1产生的电化学发光信号强度；所述PBS缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，用0.1 M Na2HPO4和0.1 M KH2PO4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与CYFRA 21-1浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
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