CN112748166A

CN112748166A - 一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法

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Publication number: CN112748166A
Application number: CN202110121470.3A
Authority: CN
Inventors: 何保山; 王博韬; 谢玲玲; 曹晓雨; 白春启; 卫敏; 金华丽; 任文洁; 索志光; 吴立根; 王涛
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN112748166B

Abstract

本发明涉及了一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，包括以下步骤：利用金属硝酸化合物和贵金属三聚体采用原位生长法制得稀土金属有机框架@贵金属三聚体纳米复合材料，通过共价键合构建稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极，根据目标物与双金属纳米复合材料/人工抗原/TH信号探针中的人工抗原竞争免疫活性位点，利用结合的数量来指示样品中硝基呋喃类代谢物残留含量，得到了用于硝基呋喃类药物代谢物残留含量检测的免疫型电化学传感器，同其它用于硝基呋喃类代谢物残留含量检测的方法相比，所制备的免疫型电化学传感器具有响应速度快，信噪比高，灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。

Description

一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，尤其涉及一种基于稀土金属有机框架@贵金属三聚体纳米复合材料以及信号探针的制备方法。

背景技术

硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗菌药物，因其作为一种广谱抗生素，可以抑制生物体内的酶，以此对大多数革兰氏阳性菌、阴性菌以及原虫和真菌病原体起到杀灭作用，同时该类药物具有价格低廉，疗效显著等优点，曾被广泛应用于畜牧养殖业和水产养殖业中动物传染病的预防和治疗。硝基呋喃类药物是呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基团的一类人工合成抗菌药，包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因。由于硝基呋喃类药物被摄入动物体内后极不稳定能迅速分解，半衰期很短，一般为几个小时。然而其代谢物分子可与蛋白质结合形成稳定的蛋白结合物。当人们食用了该类含有残留的食品后，代谢物在胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来危害人体健康，导致人体慢性中毒，甚至致癌、致畸和致突变。由此，如果仅测定该类药物的原药残留是不够科学的，所以通常以测定代谢物残留量来判断硝基呋喃类药物使用情况。目前，1995年，欧盟将呋喃唑酮列为不得检出药物；我国农业部在 2002年发布1号193号、235号公告明确禁止呋喃它酮、呋喃唑酮用于所有动物源性食品，规定其不得检出，在2005年的56号公告中将呋喃西林、呋喃妥因列为禁用兽药。目前，硝基呋喃类药物残留的检测方法主要为分光光度法、色谱分析法和免疫分析法。最常用的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），虽然具有较高的灵敏度和准确度，但样品前处理复杂，检测周期长而且对检测的技术水平要求较高，需要专业的工作人员来完成，在基层单位推广普及难度大，难以对家禽、家畜、鱼类等的养殖、加工、流通等环节进行全面监控。因此，随着食品工业的快速发展与人们生活节奏的加快，建立发展适用于硝基呋喃类代谢物残留的快速检测技术具有十分重要的实际意义。

发明内容

本发明涉及一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法。

一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，其步骤如下：

稀土金属有机框架@贵金属三聚体的制备：稀土金属有机框架的制备，称取0.300g~0.500 g金属硝酸化合物加入15 mL去离子水中；称取0.10~0.25 g H₃BTC加入到去离子水与有机溶剂的混合溶液里，其中有机溶剂与去离子水的体积之比为1:1~1:3，将溶液放置超声中完全溶解；在300 rpm~600 rpm条件下搅拌金属硝酸化合物溶液，将H₃BTC溶液加入金属硝酸化合物溶液中，溶液由无色变为白色，将混合物在40℃~70℃下水浴加热0.5 h~2h。通过离心收集后，用水与有机溶剂混合溶液进行冲洗。得到稀土金属有机框架。贵金属三聚体的制备，将0.5 mL~0.9 mL浓度为10 mM~20 mM的贵金属溶液A，以及20 μL~55μL质量分数2%~6%的贵金属溶液B，以及85.0 μL~89.0 μL质量分数为1 %~6 %的贵金属溶液C，与0.01g~0.03 g的表面活性剂在烧杯中混合，加入0.1 mL~0.4 mL 浓度为0.2 M~0.5 M的还原剂，将混合溶液在500 rpm~1000 rpm以及2 ℃~5 ℃下搅拌。1~5小时后，离心收集产物并洗涤1~5次，最后将离心产物分散在300 μL~600 μL去离子水中，得到贵金属三聚体溶液。用原位生长法制备稀土金属有机框架@贵金属三聚体，称取1 mg~3 mg制成的稀土金属有机框架试剂分散于1 mL~3 mL去离子水里，加入1 mL~3 mL制备成功的贵金属三聚体溶液，混合均匀，加入1 mL ~3 mL 1 mg/mL~3 mg/mL的PVP溶液，超声搅拌10~15分钟。在600 rpm~900 rpm搅拌条件下，滴加1 mL ~3 mL 6.0 mg/mL~8.0 mg/mL的还原剂。将混合物在室温下搅拌20min ~40 min，在4000 rpm~6000 rpm条件下离心8 min~12 min，超纯水洗涤1~4次。得到稀土金属有机框架@贵金属三聚体复合材料。

稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极的制备：分别用0.3 μM和0.05 μM氧化铝粉末在麂皮上依次打磨金电极，用去离子水与有机溶剂超声水浴1 min~5min。在室温条件下烘干电极，将制备的稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体纳米复合材料用交联剂修饰在金电极上，然后将2 μL~5 μL硝基呋喃类代谢物抗体 (1 μg/mL ~3 μg/mL)固定在纳米复合材料上。随后，用1 μL ~3 μL 1 %~3 %蛋白溶液孵育1~4小时。然后，用pH值为 6~8的缓冲溶液洗涤电极，得到稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极。

信号探针的制备：量取10μL ~30μL 5 mM~10 mM贵金属溶液和10 μl~20 μl 10 mM~15 mM 金属硝酸溶液以摩尔比例1：1~1：3与1 mL~3 mL去离子水快速混匀。搅拌后立即加入0.1 M~0.4 M 还原剂，剧烈搅拌溶液10 s~30 s内，溶液颜色变为蓝色，随后加入0.5 mL~1 mL 0.1 M ~0.3 M 表面活性剂，持良好分散性，得到双金属纳米复合材料溶液；将5μL ~15μL 5 mg/mL~20 mg/mL人工抗原加入到双金属纳米复合材料溶液中，摇床37℃震荡孵育5h ~24 h，5000 rmp~10000 rmp离心5 min ~10min,去除上清液，将沉淀分散于100 μL~500μL的PBS中，得到双金属纳米复合材料/人工抗原溶液，-10℃~-20℃保存备用。取10μL~100μL制备的双金属纳米复合材料/人工抗原溶液与20μL ~80μL（0.5 mmol/L ~2 mmol/L）硫堇溶液混合，摇床37℃震荡孵育3 h ~12 h，得到双金属纳米复合材料/人工抗原/硫堇信号探针。

电化学传感器是以稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，根据目标物与信号探针中的人工抗原进行竞争免疫活性位点，通过信号探针与抗体结合的数量来指示样品中硝基呋喃类代谢残留含量，得到了用于硝基呋喃类药物代谢残留含量检测的电化学传感器。

所述的金属硝酸化合物为硝酸铈、硝酸镧、硝酸镨、硝酸锌、硝酸铁、硝酸铜中的一种或多种；

所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、乙醇、乙醚中的一种或多种；

所述的贵金属溶液A为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；

所述的贵金属溶液B为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；

所述的贵金属溶液C为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；

所述的表面活性剂B为Pluronic F127、蔗糖酯、CATB、椰油基葡糖苷中的一种或多种；

所述的还原剂为：抗坏血酸、硼氢化钠、硼氢化钾、草酸中的一种或多种；

所述的稀土金属有机框架材料为镧金属有机框架、铈金属有机框架、镨金属有机框架中的一种或多种；

所述的交联剂为壳聚糖、过氧化苯甲酰、过氧化二枯基中的一种或多种；

所述的蛋白溶液为牛血清蛋白、鸡卵白蛋白、人血清蛋白中的一种或多种；

所述的缓冲溶液为柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的一种或多种。

所述的贵金属溶液为为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；

所述的金属硝酸溶液为硝酸铈、硝酸银、硝酸镧、硝酸镨、硝酸锌、硝酸铁、硝酸铜中的一种或多种；

所述的表面活性剂A为Pluronic F127、蔗糖酯、CATB、椰油基葡糖苷中的一种或多种。

本发明涉及的传感器中，以为稀土金属有机框架@贵金属三聚体复合材料为金电极的修饰材料，根据目标物与信号探针中的人工抗原进行竞争免疫活性位点，通过信号探针与抗体结合的数量来指示样品中硝基呋喃类代谢残留含量，同其它用于硝基呋喃类代谢残留含量检测的方法相比，所制备的新型电化学传感器具有响应速度快，信噪比高，灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行描述：

实施例1

具体步骤如下：

（1）稀土金属有机框架@贵金属三聚体的制备：①称取0.434 g Ce(No₃)3·6H₂O加入15 mL去离子水中；称取0.23 g H₃BTC加入到去离子水与乙醇的混合溶液里，其中乙醇与去离子水的体积之比为1：1，将溶液放置超声中完全溶解；在500 rpm条件下搅拌Ce(No₃)₃·6H₂O溶液，将H₃BTC溶液加入Ce(No3)₃·6H₂O溶液中，溶液由无色变为白色，将混合物在60℃下水浴加热1h.通过离心收集后，用水与乙醇混合溶液进行冲洗。得到稀土金属有机框架。②将0.9 mL浓度为20 mm的RuCl₃溶液，以及53.2μL质量分数5 %的HAuCl，以及88.4μL质量分数为5 %的H₂PtCl，与0.01 g的Pluronic F127在烧杯中混合，加入0.3 mL 浓度为0.4 M的抗坏血酸，将混合溶液在800 rpm以及4℃下搅拌。3小时后，离心收集产物并洗涤3次，最后将离心产物分散在500μL去离子水中。得到AuPtRu NPs溶液。③称取1 mg制成的Ce-MOF分散于2 mL去离子水里，加入2 mL制备成功的AuPtRu NPs溶液,混合均匀，加入2 mL 2 mg/mL的PVP溶液，超声搅拌15分钟。在800 rpm搅拌条件下，滴加2 mL 7.5 mg/mL的NaBH₄.将混合物在室温下搅拌30 min,在5000 rpm条件下离心10 min,超纯水洗涤3次。

（2）用0.3μm和0.05 μm氧化铝粉末在麂皮上依次打磨金电极，用去离子水与乙醇超声水浴3 min,去除残留的吸附颗粒。在室温条件下烘干电极，将制备的纳米复合材料修饰在金电极上，然后将4μL硝基呋喃类代谢物抗体 (1μg/mL)固定在纳米复合材料上。随后，用2μL 1% BSA溶液孵育1小时，然后，用PH 6~8的缓冲溶液洗涤电极，将电极存放在2℃~6℃下备用。

（3）量取20μl 10 mM AuCl₄ ^-和20μL 10 Mm AgNo₃溶液以摩尔比例1：1与2 mL去离子水快速混匀。搅拌后立即加入0.1 M AA, 剧烈搅拌溶液。30s内，溶液颜色变为蓝色，说明形成了AuAg NPs,随后加入1m 0.1 M CTAB,使NPs稳定，保持良好分散性。10μL 15 mg/mL人工抗原加入到AuAg NPs溶液中，摇床37℃震荡孵育15 h，8000 rmp离心10 min,去除上清液，将沉淀分散于200μL的PBS中，得到AuAg NPs/人工抗原溶液， -20 ℃保存备用。取50μL制备的AuAg NPs/人工抗原溶液与60μL（1 mmol/L）硫堇溶液混合，摇床37℃震荡孵育6 h。

（4）电化学传感器是以Ce-MOF@AuPtRu/抗体/金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，根据目标物与连接了信号分子以及纳米复合材料的人工抗原进行竞争免疫活性位点，通过信号探针与抗体结合的数量来指示样品中硝基呋喃类代谢残留含量，得到了用于硝基呋喃类药物代谢残留含量检测的电化学传感器。

所制备的电化学传感器对硝基呋喃类代谢物的检测具有准确度高，线性范围宽（0.01～1000 μmol L^-1），检测下限低（0.002 μmol L^-1）的特点。同时，对实际样品(如鱼类、猪肉中的硝基呋喃类代谢物)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。

以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整分散时间等方法均在本发明专利要求范围之内。

Claims

1.一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）稀土金属有机框架@贵金属三聚体的制备：稀土金属有机框架的制备，称取0.300~0.500 g金属硝酸化合物加入到15~20mL去离子水中；称取0.10~0.25 g H₃BTC加入到去离子水与有机溶剂的混合溶液里，其中有机溶剂与去离子水的体积之比为1:1~1:3，溶液超声中完全溶解；在300 rpm~600 rmp下搅拌金属硝酸化合物溶液，将H₃BTC溶液加入金属硝酸化合物溶液中，溶液由无色变为白色，将混合物在40 ℃~ 70 ℃下水浴加热0.5 h~2 h；离心收集后，用水与有机溶剂混合溶液进行冲洗，得到稀土金属有机框架；贵金属三聚体的制备，将0.5 mL~0.9 mL浓度为10 mM~20 mM的贵金属溶液A，以及20μL~55μL质量分数2 %~6 %的贵金属溶液B，以及85.0 μL~89.0μL质量分数为1 %~ 6%的贵金属溶液C，与0.01 g~0.03g的表面活性剂A在烧杯中混合，加入0.1 mL~0.4 mL 浓度为0.2 M~0.5 M的还原剂，将混合溶液在500 rpm~1000 rpm以及2℃~5℃下搅拌；1~5小时后，离心收集产物并洗涤1~5次，最后将离心产物分散在300 μL~600 μL去离子水中，得到贵金属三聚体溶液；采用原位生长法制备稀土金属有机框架@贵金属三聚体，称取1 mg~3 mg制成的稀土金属有机框架试剂分散于1 mL~ 3 mL去离子水里，加入1 mL~3 mL制备成功的贵金属三聚体溶液，混合均匀，加入1mL ~3 mL 1 mg/mL~3 mg/mL的PVP溶液，超声搅拌10~15分钟；在600 rpm~900 rpm搅拌条件下，滴加1 mL ~3 mL 6.0 mg/mL~8.0 mg/mL的还原剂；将混合物在室温下搅拌20 min ~40min,在4000 rpm~6000 rpm条件下离心8 min~12 min，超纯水洗涤1~4次，得到稀土金属有机框架@贵金属三聚体；

（2）稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极的制备：分别用0.3 μM和0.05μM氧化铝粉末在麂皮上依次打磨金电极，用去离子水与有机溶剂超声水浴1 min~5 min；在室温条件干燥干电极，将制备的稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体纳米复合材料用交联剂修饰在金电极上，然后将2μL~5μL硝基呋喃类代谢物抗体 (1μg/mL ~3μg/mL)固定在纳米复合材料上；随后，用1μL ~3μL 1%~3%蛋白溶液孵育1~4小时；然后，用pH值为 6~8的缓冲溶液洗涤电极，得到稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极；

（3）信号探针的制备：准确量取10 μL ~30 μL 5 mM~10 mM贵金属溶液和10 μl~20 μl10 mM~15 mM 金属硝酸溶液以摩尔比例1：1~1：3与1 mL~3 mL去离子水快速混匀；搅拌后立即加入0.1 M~0.4M 还原剂，剧烈搅拌溶液10 s~30 s，溶液颜色变为蓝色，随后加入0.5 mL~1 mL 0.1 M ~0.3M 表面活性剂B，保持良好分散性，得到双金属纳米复合材料溶液；将5μL~15μL 5 mg/mL~20 mg/mL人工抗原加入到双金属纳米复合材料溶液中，摇床37 ℃震荡孵育5 h ~24 h，5000 rmp ~10000 rmp离心5 min ~10 min，去除上清液，将沉淀分散于100 μL~500 μL的PBS中，得到双金属纳米复合材料/人工抗原溶液，-10 ℃~-20 ℃保存备用；取10μL~100μL制备的双金属纳米复合材料/人工抗原溶液与20μL ~80μL（0.5 mmol/L ~2mmol/L）硫堇溶液混合，摇床37 ℃震荡孵育3 h ~12 h，得到双金属纳米复合材料/人工抗原/硫堇信号探针；

（4）电化学传感器是以稀土金属有机框架材料@贵金属三聚体/抗体/金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银作参比电极，根据目标物与信号探针中的人工抗原进行竞争免疫活性位点，通过信号探针与抗体结合的数量来指示样品中硝基呋喃类代谢残留含量，得到了用于硝基呋喃类药物代谢残留含量检测的电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的金属硝酸化合物为硝酸铈、硝酸镧、硝酸镨、硝酸锌、硝酸铁、硝酸铜中的一种或多种；所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、乙醇、乙醚中的一种或多种；所述的贵金属溶液A为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；所述的贵金属溶液B为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；所述的贵金属溶液C为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；所述的表面活性剂A为Pluronic F127、蔗糖酯、CATB、椰油基葡糖苷中的一种或多种；所述的还原剂为抗坏血酸、硼氢化钠、硼氢化钾、草酸其中的一种或多种；所述的稀土金属有机框架材料为镧金属有机框架、铈金属有机框架、镨金属有机框架中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的交联剂为壳聚糖、过氧化苯甲酰、过氧化二枯基中的一种或多种；所述的蛋白溶液为牛血清蛋白、鸡卵白蛋白、人血清蛋白中的一种或多种；所述的缓冲溶液为柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的贵金属溶液为为氯金酸、氯铂酸、氯化钌、氯化钯、氯化银中的一种或多种；所述的金属硝酸溶液为硝酸铈、硝酸银、硝酸镧、硝酸镨、硝酸锌、硝酸铁、硝酸铜中的一种或多种，所述的表面活性剂B为Pluronic F127、蔗糖酯、CATB、椰油基葡糖苷中的一种或多种。