CN110927226A - 一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法。在本发明中，采用鲁米诺luminol为发光体，双氧水H2O2为共反应剂，二氧化铈CeO2和铂纳米粒子PtNPs作为增强剂催化共反应剂H2O2产生更多的活性氧O2•‑，达到双增强鲁米诺发光的效果。将luminol与牛血清白蛋白BSA包覆的金纳米星Au star@BSA进行复合，形成鲁米诺‑金纳米星杂化的二抗Ab2标记物luminol‑Au star@BSA‑Ab2。不同浓度的降钙素原PCT可以结合不同量的luminol‑Au star@BSA‑Ab2，引起传感器发光强度的变化，从而实现对PCT的高灵敏检测。本发明对PCT检测的线性范围为50 fg/mL‑100 ng/mL，检测限为18 fg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法。具体是以luminol为发光材料，CeO2-Au@Pt为共反应促进剂，制备一种检测PCT的双增强型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
败血症是一种由细菌、真菌等感染引起的全身炎症反应，被看作全球性的威胁生命健康的疾病。研究表明，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度，已被探索作为败血症可靠的预后和治疗指标。因此，开发一种新颖灵敏的免疫测定方法用于快速检测PCT是非常有意义的。
近年来，电化学发光ECL作为一种高灵敏度和高选择性的分析方法引起人们极大的研究兴趣。电化学发光是指通过电化学方法产生电生物质，然后这些电生物质之间或电生物质与其它物质之间反应产生的一种发光现象，它是化学发光方法与电化学方法相结合的产物。电化学发光分析具有灵敏度高，线性范围宽；分析速度快，应用范围广；有利于研究快速发光反应和发光反应机理等优势，已经发展为分析化学的一门分支学科。
Luminol是一种传统的电化学发光材料，发光效率较高，近年来受到越来越多的关注。但是luminol发光信号不稳定，不能产生足够强的ECL信号，需要开发新型的共反应剂促进剂来增强luminol的ECL信号。CeO2作为稀土元素的氧化物，因其在氧化还原反应中独特的性能而受到广泛关注，且其中的Ce3+/Ce4+氧化还原对可以快速可逆的转换，具有很高的催化活性和电子转移率。纳米铂Pt催化性能优异，可以催化共反应剂H2O2生成更多的O2•-。在本发明中，luminol为发光体，H2O2为共反应剂，CeO2-Au@Pt为共反应剂促进剂，构建了一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器。
发明内容
本发明目的之一是制备促进发光材料信号稳定和催化性能好的共反应促进剂。
本发明目的之二是构建基于CeO2和PtNPs双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器。
本发明目的之三是通过构建的电化学发光传感器实现对PCT的高灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 本发明所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉进行预处理，用超纯水冲洗干净；将6 μL 1-5 mg/mL的CeO2-Au@Pt溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将6 μL 1 μg/mL的HGC溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 μL 1 mg/mL的Ab1溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，用于封闭Ab1上的非特异性活性位点，在4 oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将5 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，在4 oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 µL 3-7 mg/mL的luminol-Au star@BSA-Ab2溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；本发明中luminol为发光体，CeO2-Au@Pt为共反应剂促进剂催化H2O2产生更多的O2•-，HGC作为一种多肽链，可以使Ab1保持较高的活性并且更好地固定在电极表面；luminol-Au star@BSA-Ab2作为二抗标记物，既可以负载更多发光体以增强发光信号，又能使传感器对PCT浓度变化反应更加灵敏，从而实现对PCT的高灵敏检测。
2. 本发明所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，其特征在于，所述的CeO2-Au@Pt纳米材料，制备步骤如下：
将20 mL 1 mM的HAuCl4溶液加热煮沸，随后加入3 mL质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌10 min至溶液变为酒红色，得到Au纳米粒子溶液；向制备好的Au纳米粒子溶液中加入25 mL超纯水，加热至100oC，随后加入2.5 mL质量分数为1%的H2PtCl4溶液，然后滴入2mL 100mM的AA溶液，在100oC的温度下继续反应20 min，得到Au@Pt溶液；Au@Pt可以与抗体形成稳定的金氨键Au-NH2 ，可结合数量更多的抗体，电子转移效率高，导电性优异，对H2O2的催化效率高；
取0.5 g Ce(NO3)3·6H2O溶于25 mL乙醇与25 mL超纯水的混合溶液中，随后加入0.1 gHMT，70oC油浴反应2 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到CeO2纳米材料；CeO2催化性能优异，生物相容性好，吸附能力强，可以提高电极与电极表面修饰材料的电子转移效率，增强了传感器的发光强度；
取0.1 g上述制备的CeO2纳米材料，分散在含有0.1 mL APTES的10 mL乙醇溶液中，70oC油浴反应1.5 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到了氨基化的二氧化铈纳米材料CeO2-NH2；取50 mg CeO2-NH2分散在制备好的Au@Pt溶液中，超声溶解后在室温下震荡12 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到了纳米复合材料CeO2-Au@Pt；本发明将两种增强剂复合，提高了对H2O2的催化效率，从而极大地放大了luminol的发光信号。
3. 本发明所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，其特征在于，所述的luminol-Au star@BSA-Ab2溶液，制备步骤如下：
取2 mL制备好的Au纳米粒子溶液，依次加入200 mL 0 .25 mM HAuCl4溶液、2 mL 3 mMAgNO3溶液，然后快速加入1 mL 0.1 M的AA溶液，用NaOH溶液将pH调为7.4，得到Au star纳米材料；随后向溶液中加入500 mg BSA、40 mg NaBH4，强力搅拌12 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，冷冻干燥，得到Au star@BSA；本发明中BSA的比表面积大，官能团丰富，导电性好，亲水性能优异，由此可得到稳定的Au star@BSA纳米复合材料；Au star@BSA纳米复合材料水溶性好，毒性低，生物相容性好，能够有效的保持生物传感器的生物活性，提高了检测灵敏度；
分别取1 mL 2 mg/mL的EDC溶液和1 mL 2 mg/mL 的NHS溶液，然后加入1 mL 2 mg/mL的Au star@BSA溶液混合均匀，在室温下震荡4 h，离心洗涤；然后将所得分散在1 mL 0.1M的luminol溶液中，pH值调为7.4，在室温下继续震荡4 h；离心洗涤固体后得到沉淀，然后将沉淀分散在1 mL 0.01M的pH值为7.4的PBS中；随后加入250 μL 质量分数为12 .5%的GA溶液，在室温下震荡1 h；最后加入500 μL Ab2，4oC下震荡12 h，即得到luminol-Au star@BSA-Ab2溶液，在4 oC冰箱中保存备用。
4. 本发明中所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，所述PCT的检测，步骤如下：
将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.15 V/s；向pH为6.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液PBS中加入10-100 μL 的H2O2作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线。
本发明的有益成果
本发明合成了luminol-Au@BSA纳米复合材料，提高了传感器的灵敏度和发光效率；合成了催化性能优异的CeO2-Au@Pt，其作为新型的共反应促进剂与H2O2反应产生更多的O2•-，从而显著增强了鲁米诺的发光强度，满足了痕量分析的需求。
本发明成功构建了一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学传感器。
本发明通过构建的电化学发光传感器实现了对PCT的高灵敏检测，检测结果具有优异的重现性和稳定性，检测的线性范围为50 fg/mL-100 ng/mL，检测限为18 fg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明保护范围不仅局限于实施例，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变均属于本发明保护范围。
实施例1
将20 mL 1 mM的HAuCl4溶液加热煮沸，随后加入3 mL质量分数1%的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌10 min至溶液变为酒红色，得到Au纳米粒子溶液；向制备好的Au纳米粒子溶液中加入25 mL超纯水，加热至100 oC，随后加入2.5 mL质量分数为1%的H2PtCl4溶液，然后滴入2mL 100mM的AA溶液，在100 oC的温度下继续反应20 min，得到Au@Pt溶液；
取0.5 g Ce(NO3)3·6H2O溶于25 mL乙醇与25 mL超纯水的混合溶液中，随后加入0.1 gHMT，70oC油浴反应2 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到CeO2纳米材料；取0.1 g上述制备的CeO2纳米材料，分散在含有0.1 mL APTES的10 mL乙醇溶液中，70oC的油浴反应1.5 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到了CeO2-NH2纳米材料；取50mg CeO2-NH2分散在制备好的Au@Pt溶液中，超声溶解后在室温下震荡12 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到了CeO2-Au@Pt。
实施例2
取2 mL制备好的Au纳米粒子溶液，依次加入200 mL 0 .25 mM HAuCl4溶液、2 mL 3 mMAgNO3溶液，然后快速加入1 mL 0.1 M的AA溶液，得到Au star纳米材料，随后用NaOH溶液将pH调为7.4；然后向溶液中加入500 mg BSA、40 mg NaBH4，强力搅拌12 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，冷冻干燥，得到Au star@BSA复合材料；
分别取1 mL 2 mg/mL的EDC溶液和1 mL 2 mg/mL 的NHS溶液，然后加入1 mL 2 mg/mL的Au star@BSA溶液混合均匀，在室温下震荡4 h，离心洗涤；然后将所得固体分散在1 mL0.1M的luminol溶液中，pH值调为7.4，在室温下继续震荡4 h；离心洗涤后得到沉淀，然后将沉淀分散在1 mL 0.01M的pH值为7.4的PBS中；随后加入250 μL 质量分数为12 .5%的GA溶液，在室温下震荡1 h；最后加入500 μL Ab2，4oC下震荡12 h，即得到luminol-Au@BSA-Ab2溶液，在4oC冰箱中保存备用。
实施例3
将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉进行预处理，用超纯水冲洗干净；将6 μL 1mg/mL的CeO2-Au@Pt溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将6 μL 1 μg/mL的HGC溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 μL 1 mg/mL的Ab1溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将3 μL质量分数为1%的BSA滴涂于电极表面，用于封闭Ab1上的非特异性活性位点，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将5 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 µL 3 mg/mL的luminol-Au star@BSA-Ab2溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱保存至干燥，用超纯水清洗电极表面。
实施例4
将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉进行预处理，用超纯水冲洗干净；将6 μL 3mg/mL的CeO2-Au@Pt溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将6 μL 1 μg/mL的HGC溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 μL 1 mg/mL的Ab1溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将3 μL质量分数为1%的BSA滴涂于电极表面，用于封闭Ab1上的非特异性活性位点，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将5 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 µL 5 mg/mL的luminol-Au star@BSA-Ab2溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱保存至干燥，用超纯水清洗电极表面。
实施例5
将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉进行预处理，用超纯水冲洗干净；将6 μL 5mg/mL的CeO2-Au@Pt溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将6 μL 1 μg/mL的HGC溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 μL 1 mg/mL的Ab1溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将3 μL质量分数为1%的BSA滴涂于电极表面，用于封闭Ab1上的非特异性活性位点，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将5 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 µL 7 mg/mL的luminol-Au@BSA-Ab2溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱保存至干燥，用超纯水清洗电极表面。
实施例6
将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.15 V/s；向pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液PBS中加入10 μL 的H2O2作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线。
实施例7
将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.15 V/s；向pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS中加入50 μL 的H2O2作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线。
实施例8
将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.15 V/s；向pH为8.5的磷酸盐缓冲溶液PBS中加入100 μL 的H2O2作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线。
Claims (4)
1.一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将直径为4 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉进行预处理，用超纯水冲洗干净；将6 μL 1-5 mg/mL的CeO2-Au@Pt溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将6 μL 1 μg/mL的七肽HGC溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 μL 1 μg/mL的一抗Ab1溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，用于封闭Ab1上的非特异性活性位点，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将5 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，在4oC冰箱中保存至干燥，用超纯水清洗电极表面；将6 µL 3-7 mg/mL的luminol-Au star@BSA-Ab2溶液滴涂于电极表面，在4oC冰箱保存至干燥，用超纯水清洗电极表面。
2.如权利要求1中所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，其特征在于，所述的CeO2-Au@Pt纳米复合材料，制备步骤如下：
将20 mL 1 mM的氯金酸HAuCl4溶液加热煮沸，随后加入3 mL质量分数为1 %的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌10 min至溶液变为酒红色，得到Au纳米粒子溶液；向制备好的Au纳米粒子溶液中加入25 mL超纯水，加热至100oC，随后加入2.5 mL质量分数为1%的氯铂酸H2PtCl4溶液，然后滴入2 mL 100 mM的抗坏血酸AA溶液，在100oC的温度下继续反应20 min，得到Au@Pt溶液；
取0.5 g硝酸铈Ce(NO3)3·6H2O溶于25 mL乙醇与25 mL超纯水的混合溶液中，随后加入0.1 g六次甲基四胺HMT，70 oC油浴反应2 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到CeO2纳米材料；取0.1 g制备好的CeO2纳米材料，分散在10 mL含有0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的乙醇溶液中，70oC油浴反应1.5 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到了氨基化的二氧化铈纳米材料CeO2-NH2；取50 mg CeO2-NH2分散在上述制好的Au@Pt溶液中，超声溶解后在室温下震荡12 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60oC干燥，得到CeO2-Au@Pt纳米复合材料。
3.如权利要求1中所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，其特征在于，所述的luminol-Au star@BSA-Ab2溶液，制备步骤如下：
取2 mL制备好的Au纳米粒子溶液，依次加入200 mL 0.25 mM H2AuCl4溶液、2 mL 3 mM硝酸银AgNO3溶液，然后快速加入1 mL 0.1 M的AA溶液，得到金纳米星Au star，随后用氢氧化钠NaOH溶液将pH调为7.4；然后向溶液中加入500 mg BSA、40 mg硼氢化钠NaBH4，强力搅拌12 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，冷冻干燥，得到Au star@BSA复合材料；
分别取1 mL 2 mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC溶液和1 mL 2 mg/mL的N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液，然后加入1 mL 2 mg/mL的Au star@BSA溶液混合均匀，在室温下震荡4 h，离心洗涤；然后将所得固体分散在1 mL 0.1 M的luminol溶液中，pH值调为7.4，在室温下继续震荡4 h；离心洗涤后得到沉淀，然后将沉淀分散在1 mL 0.01 M的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS中；随后加入250 μL质量分数为12.5%的戊二醛GA溶液，在室温下震荡1 h；最后加入500 μL二抗Ab2，4oC下震荡12 h，即得到luminol-Au star@BSA-Ab2溶液，在4oC冰箱中保存备用。
4.如权利要求1中所述的一种基于二氧化铈和纳米铂双增强鲁米诺发光的电化学发光传感器的构建方法，所述PCT的检测，步骤如下：
将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为0-0.6 V，扫描速率设置为0.15 V/s；向pH为6.0-8.5的PBS中加入10-100 μL的H2O2作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；最后根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线。
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- 2020-01-07 CN CN202010012011.7A patent/CN110927226A/zh active Pending
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