CN111812168A - 一种锰-真黑素纳米粒子猝灭鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器 - Google Patents

一种锰-真黑素纳米粒子猝灭鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种锰‑真黑素纳米粒子猝灭PtCo‑CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器。为了灵敏地检测降钙素原，本发明设计了一种夹心型的猝灭型电化学发光免疫传感器，采用锰‑真黑素纳米粒子作为猝灭剂，降低PtCo‑CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺的电化学发光强度。猝灭机理主要是由于锰‑真黑素纳米粒子抑制电化学反应过程中过氧化氢的电氧化，并且通过能量转移进一步降低发光材料的发光强度，实现电化学发光信号的双重猝灭。根据不同浓度的降钙素原可以结合不同量的二抗标记物锰‑真黑素纳米粒子，使得该传感器电化学发光强度变化不同。

Description

一种锰-真黑素纳米粒子猝灭鲁米诺检测降钙素原的电化学 发光传感器
技术领域
本发明涉及一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素的电化学发光传感器。具体是采用PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯结合鲁米诺作为发光材料，锰-真黑素纳米粒子作为猝灭剂，猝灭鲁米诺的电化学发光行为，制备一种检测降钙素原的猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
降钙素原是一种无激素活性的降钙素前肽物质。在健康人体内含量极少，血液中几乎不能被检测到。而在病理状态下，各组织器官几乎都能分泌降钙素原，其生成过程由细菌毒素和炎症细胞因子的多种因素的调节。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，降钙素原在血浆中的水平升高。因此，在本发明中，以降钙素原为检测对象，设计了一种新颖、灵敏的电化学发光免疫传感器。电化学发光是由电化学氧化还原反应诱导产生的光发射行为，电化学发光技术具有背景信号低、灵敏度高，线性范围宽等优势，因此在生物传感分析领域已经被广泛应用。
为解决鲁米诺在固体材料中电化学发光信号低的问题，在本发明中，采用PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯结合鲁米诺作为发光材料。制备的PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯复合材料，不仅可以催化H2O2的电还原产生更多的活性氧类，而且还可以催化H2O2和鲁米诺的电氧化，进而增强鲁米诺的电化学发光强度。制备的复合材料带有正电的表面电荷，而鲁米诺带有负电，因此可以通过静电吸引结合鲁米诺，避免交联剂的使用，使得发光信号更加的稳定。将发光材料分散到壳聚糖溶液中，可以通过静电吸引以及壳聚糖的包覆作用稳定地将抗体结合在复合材料表面。为了灵敏地检测降钙素原，通过分子内聚合一步制备Mn-真黑素螯合形成的纳米粒子用作猝灭剂降低鲁米诺的电化学发光信号。因此，本发明设计的免疫传感器不仅可以灵敏检测降钙素原，也为其他分析物的检测提供了一种新方法。目前基于Mn-真黑素猝灭鲁米诺电化学发光行为检测降钙素原的方法未见报道。
发明内容
本发明设计了一种猝灭型的电化学发光免疫传感器用于检测降钙素原。
本发明的目的之一是制备PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯直接结合鲁米诺，增强发光体的电化学发光强度和稳定性，提高传感器的灵敏度。
本发明的目的之二是制备Mn-真黑素纳米粒子，猝灭鲁米诺电化学发光行为。其中，猝灭机理如下：Mn-真黑素的紫外吸收峰和鲁米诺的ECL发生峰之间存在光谱重叠，使得Mn-真黑素与鲁米诺之间存在ECL能量转移，从而猝灭鲁米诺的ECL信号；Mn-真黑素抑制了过氧化氢的电氧化，减少超氧根自由基的产量，使得鲁米诺的ECL信号进一步猝灭。
本发明的目的之三是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化Mn-真黑素表面的羧基与二抗表面的氨基反应。基于一抗-抗原-二抗之间的免疫反应，实现免疫传感器的制备，达到对降钙素原检测的目的。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）将氧化铟锡（ITO）切割成1×1.5 cm2的玻璃片，分别用无水乙醇、丙酮和超纯水清洗切割好的玻璃片，烘箱70 ℃干燥；
（2）将6 µL 5～10 mg/mL鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液滴涂到ITO电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6 μL 500 μg/mL一抗溶液于ITO电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3 μL质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6 μL不同浓度的降钙素原滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将6 µL 1～5 mg/mL二抗/Mn-真黑素溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。
2. 本发明所述的一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，所述鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液，制备步骤如下：
（1）PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的制备
将20～40 mg CuFe2O4杂化氧化石墨烯分散在15 mL乙二醇中，加入45 mg L-脯氨酸，超声1 h。然后，在上述溶液中加入100 μL H2PtCl6·6H2O和7 mg CoCl2·6H2O，搅拌混匀。将其转移至100 mL反应釜中，180 ℃反应12 h，离心、洗涤、干燥得到PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯；
（2）鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液的制备
将制备的1 mL 1 mg/mL PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯加入到1 mL含有1～5 mmol/L鲁米诺过夜搅拌，通过静电吸引将鲁米诺结合在复合材料表面，离心分离去除未结合的鲁米诺，得到鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯，并将其分散在质量分数为0.5%的壳聚糖溶液中；
所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2 h制得。
3. 本发明所述的一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，所述二抗/Mn-真黑素溶液，制备步骤如下：
（1）Mn-真黑素纳米粒子的制备
首先通过化学氧化-聚合方法制备Mn-真黑素纳米粒子。将0.118 g DL-3,4-二羟基苯丙氨酸-1-甲基乙基酯分散在60 mL超纯水中，回流加热到50 ℃。之后，加入0.01 g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀。将1.8 mL 100 mM KMnO4溶液快速加入到上述溶液中，持续搅拌6 h，离心、洗涤、冷冻干燥，得到Mn-真黑素纳米粒子；
（2）二抗/Mn-真黑素溶液的制备
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化Mn-真黑素表面的羧基与二抗表面的氨基反应，将抗体固定在Mn-真黑素的表面。将1～6 mg Mn-真黑素分散在1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声30 min。加入500 μL 100 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和500 μL 400 mM N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1 h。然后，500 μL 500 μg/mL二抗溶液加入到上述溶液中，4 ℃搅拌6 h，离心、洗涤去除未结合的抗体。最后，加入100 μL 1% BSA封闭非特异性位点，离心得到二抗/Mn-真黑素，将其分散1 mL在磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）中，保存在4 ℃冰箱中待用。
4. 本发明所述的制备方法制备的一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器，用于降钙素原的检测，步骤如下：
（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为800 V，扫描电压设置为0～0.6 V，扫速设置为0.15 V/s；
（2）使用含1～10 mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，是用1/15 mol/L Na2HPO4和1/15 mol/L KH2PO4配制；
（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）制备的PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯，不仅使鲁米诺在电极表面稳定存在，还可以通过PtCo纳米粒子、CuFe2O4杂化氧化石墨烯对过氧化氢的催化性，使得发光材料的电化学发光强度增加；
（2）制备的二抗标记物Mn-真黑素纳米粒子，不仅可以通过电化学发光能量转移猝灭鲁米诺的电化学发光特性，而且还可以抑制过氧化氢的电氧化，使得产生的超氧根自由基减少，进一步降低鲁米诺的电化学发光特性；
（3）本发明制备的猝灭型电化学发光传感器用于降钙素原的检测，发光物质用量少，响应时间短，可以实现简单、快速和高灵敏检测。本发明对降钙素原检测的线性范围为0.005pg/mL-100 pg/mL，检测限为0.0021 pg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液，制备步骤如下：
（1）PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的制备
将20 mg CuFe2O4杂化氧化石墨烯分散在15 mL乙二醇中，加入45 mg L-脯氨酸，超声1h。然后，在上述溶液中加入100 μL H2PtCl6·6H2O和7 mg CoCl2·6H2O，搅拌混匀。将其转移至100 mL反应釜中，180 ℃反应12 h，离心、洗涤、干燥得到PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯；
（2）鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液的制备
将制备的1 mL 1 mg/mL PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯加入到1 mL含有1 mmol/L鲁米诺过夜搅拌，通过静电吸引将鲁米诺结合在复合材料表面，离心分离去除未结合的鲁米诺，得到鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯，并将其分散在质量分数为0.5%的壳聚糖溶液中；
所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2 h制得。
实施例2鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液，制备步骤如下：
（1）PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的制备
将40 mg CuFe2O4杂化氧化石墨烯分散在15 mL乙二醇中，加入45 mg L-脯氨酸，超声1h。然后，在上述溶液中加入100 μL H2PtCl6·6H2O和7 mg CoCl2·6H2O，搅拌混匀。将其转移至100 mL反应釜中，180 ℃反应12 h，离心、洗涤、干燥得到PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯；
（2）鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液的制备
将制备的1 mL 1 mg/mL PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯加入到1 mL含有5 mmol/L鲁米诺过夜搅拌，通过静电吸引将鲁米诺结合在复合材料表面，离心分离去除未结合的鲁米诺，得到鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯，并将其分散在质量分数为0.5%的壳聚糖溶液中；
所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2 h制得。
实施例3制备二抗/Mn-真黑素溶液，制备步骤如下：
（1）Mn-真黑素纳米粒子的制备
首先通过化学氧化-聚合方法制备Mn-真黑素纳米粒子。将0.118 g DL-3,4-二羟基苯丙氨酸-1-甲基乙基酯分散在60 mL超纯水中，回流加热到50 ℃。之后，加入0.01 g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀。将1.8 mL 100 mM KMnO4溶液快速加入到上述溶液中，持续搅拌6 h，离心、洗涤、冷冻干燥，得到Mn-真黑素纳米粒子；
（2）二抗/Mn-真黑素溶液的制备
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化Mn-真黑素表面的羧基与二抗表面的氨基反应，将抗体固定在Mn-真黑素的表面。将1～6 mg Mn-真黑素分散在1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声30 min。加入500 μL 100 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和500 μL 400 mM N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1 h。然后，500 μL 500 μg/mL二抗溶液加入到上述溶液中，4 ℃搅拌6 h，离心、洗涤去除未结合的抗体。最后，加入100 μL 1% BSA封闭非特异性位点，离心得到二抗/Mn-真黑素，将其分散1 mL在磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）中，保存在4 ℃冰箱中待用。
实施例4制备检测降钙素原的电化学发光传感器
（1）将氧化铟锡（ITO）切割成1×1.5 cm2的玻璃片，分别用无水乙醇、丙酮和超纯水清洗切割好的玻璃片，烘箱70 ℃干燥；
（2）将6 µL 5 mg/mL鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液滴涂到ITO电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6 μL 500 μg/mL一抗溶液于ITO电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3 μL质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6 μL不同浓度的降钙素原滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将6 µL 3 mg/mL二抗/Mn-真黑素溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。
实施例5制备检测降钙素原的电化学发光传感器
（1）将氧化铟锡（ITO）切割成1×1.5 cm2的玻璃片，分别用无水乙醇、丙酮和超纯水清洗切割好的玻璃片，烘箱70 ℃干燥；
（2）将6 µL 10 mg/mL鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液滴涂到ITO电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6 μL 500 μg/mL一抗溶液于ITO电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3 μL质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6 μL不同浓度的降钙素原滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将6 µL 5 mg/mL二抗/Mn-真黑素溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。
实施例6降钙素原的检测方法
（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为800 V，扫描电压设置为0～0.6 V，扫速设置为0.15 V/s；
（2）使用含1 mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其pH=7.4，是用1/15 mol/L Na2HPO4和1/15 mol/L KH2PO4配制；
（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例7降钙素原的检测方法
（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为800 V，扫描电压设置为0～0.6 V，扫速设置为0.15 V/s；
（2）使用含10 mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其pH=8.0，是用1/15 mol/L Na2HPO4和1/15 mol/L KH2PO4配制；
（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例8血清中降钙素原的检测
（1）向稀释的血清中加入不同浓度的降钙素原，采用标准加入法测定样品中降钙素原的平均回收率，结果见表1。
表1. 标准加入发检测样品中的降钙素原
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表1检测结果可以看出，样品中降钙素原检测结果的回收率为98.8～105 %，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，结果准确可靠。

Claims (4)

1.一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）将氧化铟锡（ITO）切割成1×1.5 cm2的玻璃片，分别用无水乙醇、丙酮和超纯水清洗切割好的玻璃片，烘箱70 ℃干燥；
（2）将6 µL 5～10 mg/mL鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液滴涂到ITO电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6 μL 500 μg/mL一抗溶液于ITO电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3 μL质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6 μL不同浓度的降钙素原滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）将6 µL 1～5 mg/mL二抗/Mn-真黑素溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，所述鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液，制备步骤如下：
（1）PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的制备
将20～40 mg CuFe2O4杂化氧化石墨烯分散在15 mL乙二醇中，加入45 mg L-脯氨酸，超声1 h；
然后，在上述溶液中加入100 μL H2PtCl6·6H2O和7 mg CoCl2·6H2O，搅拌混匀；
将其转移至100 mL反应釜中，180 ℃反应12 h，离心、洗涤、干燥得到PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯；
（2）鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯的壳聚糖溶液的制备
将制备的1 mL 1 mg/mL PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯加入到1 mL含有1～5 mmol/L鲁米诺过夜搅拌，通过静电吸引将鲁米诺结合在复合材料表面，离心分离去除未结合的鲁米诺，得到鲁米诺-PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯，并将其分散在质量分数为0.5%的壳聚糖溶液中；
所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2 h制得。
3.如权利要求1所述的一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，所述二抗/Mn-真黑素溶液，制备步骤如下：
（1）Mn-真黑素纳米粒子的制备
首先通过化学氧化-聚合方法制备Mn-真黑素纳米粒子；
将0.118 g DL-3,4-二羟基苯丙氨酸-1-甲基乙基酯分散在60 mL超纯水中，回流加热到50 ℃；
之后，加入0.01 g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀；
将1.8 mL 100 mM KMnO4溶液快速加入到上述溶液中，持续搅拌6 h，离心、洗涤、冷冻干燥，得到Mn-真黑素纳米粒子；
（2）二抗/Mn-真黑素溶液的制备
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化Mn-真黑素表面的羧基与二抗表面的氨基反应，将抗体固定在Mn-真黑素的表面；
将1～6 mg Mn-真黑素分散在1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声30 min；
加入500 μL 100 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和500 μL 400 mMN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1 h；
然后，500 μL 500 μg/mL二抗溶液加入到上述溶液中，4 ℃搅拌6 h，离心、洗涤去除未结合的抗体；
最后，加入100 μL 1% BSA封闭非特异性位点，离心得到二抗/Mn-真黑素，将其分散1mL在磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）中，保存在4 ℃冰箱中待用。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种锰-真黑素纳米粒子猝灭PtCo-CuFe2O4杂化氧化石墨烯固载的鲁米诺检测降钙素原的电化学发光传感器，用于降钙素原的检测，步骤如下：
（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为800 V，扫描电压设置为0～0.6 V，扫速设置为0.15 V/s；
（2）使用含1～10 mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；
所述磷酸盐缓冲溶液，其pH=5.0～8.5，是用1/15 mol/L Na2HPO4和1/15 mol/L KH2PO4配制；
（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
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