CN110927238A - 一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测前列腺特异性抗原（PSA）的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，氮掺杂石墨烯量子点（N‑GQDs）和硫化镉（CdS）量子点双重敏化海胆状二氧化钛（TiO2）作为光活性材料固载到导电玻璃表面，有效地抑制了电子空穴（e‑/h+）的复合，产生了显著的光电流信号，并且为固定PSA抗体提供了丰富的官能团。采用金‑碳纳米管（Au/MWCNTs）纳米复合物作为第二抗体的标记，按照不同的机理产生激子‑等离子体共振（EPI）；在该体系中，在光激发状态下，使Au NPs产生表面等离子体共振（SPR）；伴随着能量共振转移（ET）过程，光电流强度将产生一定程度的降低，增加了传感器的灵敏度。此外Au/MWCNTs具有较大的表面积和生物相容性，增加了第二抗体的负载量，由于空间位阻效应阻碍电子的转移，使得光电流被降低，进一步提升了传感器的灵敏度，实现了对前列腺特异性抗原的特异性检测，为PSA的早期检测提供了新颖可行的检测方法，在临床中具有潜在的应用前景。

Description

一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备 方法及应用
技术领域
本发明设计生物分析化学、纳米材料、免疫分析和光电化学生物传感技术领域，提供了一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用。采用水热法合成了海胆状TiO2，N-GQDs和CdS QDs作为双重敏化剂和抗体捕获材料固定在TiO2表面，使用具有双重抑制的Au/MWCNTs 纳米复合物作为二抗标记物，提供了一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用。
背景技术
前列腺癌已成为全球男性中第二常见的癌症，也是各个国家男性死亡的共同因素。前列腺特异性抗原（PSA）是一种细胞内糖蛋白（34 kDa，激肽释放酶样蛋白酶），被认为是早期诊断和预防前列腺癌的主要肿瘤标志物。由于没有有效的治疗方法可用于前列腺癌的晚期转移阶段，早期发现对于提高前列腺癌患者的生存率具有重要意义。因此，血清PSA浓度的检测对原发性前列腺癌的诊断具有重要意义。
各种传统方法已用于测试PSA，例如酶毛细管电泳、酶联免疫吸附测定、电泳等。近年来，已经开发了一些检测PSA的新方法，包括电化学发光（ECL）免疫传感器，表面等离子体共振（SPR）、荧光标记、电化学免疫传感器和光电化学（PEC）免疫传感器。PEC免疫传感器是一种灵敏，低成本且简单的方法，用于检测和分析生物分子。此外，PEC传感以其快速和灵敏的特性引起了生物学分析领域的广泛兴趣。
在这项研究中，使用N-GQDs和CdS QDs双敏化的海胆状的TiO2和标记第二抗体（Ab2）的Au/MWCNTs纳米复合物的信号抑制剂制备了新型超灵敏PEC免疫传感器。水热法合成了直径为2 μm的海胆状TiO2具有较高的比表面积，负载了更多的N-GQD和CdS QDs用作光敏材料以产生了显著的光电流信号。同时，Au/MWCNTs纳米复合物与CdS QDs 之间产生明显的能量转移现象，从而导致激发-等离子体激元相互作用（EPI）。在CdS QDs-Au NPs系统中，Au NPs可通过促进EPI与光激发的CdS QDs产生SPR。能量转移（ET）过程同时发生，光电流强度会降低。同时，Ab2的自身的空间位阻和大的比表面积增加抗体的固载量，抑制作用产生协同效果。提供了一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，该传感器具有优异的光电化学活性，具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、检测快速、制备过程相对简单等优点，实现了对前列腺的超灵敏分析，为目前有效检测前列腺提供了新方法。
发明内容
本发明提供了一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，实现了前列腺的超灵敏检测。本发明的目的之一是提供一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法。本发明的目的之二是将所制备的夹心型光电化学免疫传感器实现对前列腺特异性抗原的超灵敏检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
（1）制备海胆状二氧化钛；
（2）制备氮掺杂的石墨烯量子点；
（3）制备氨基修饰的硫化镉量子点；
（4）制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料；
（5）制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料孵化前列腺特异性抗原的二抗标记物；
（6）制备夹心型检测前列腺特异性抗原的光电化学免疫传感器的工作曲线。
其中步骤（1）制备海胆状二氧化钛包括：
将0.5 ~ 2 mL的钛酸四丁酯加入到含有20 ~ 40 mL冰乙酸的锥形瓶中，在室温下持续搅拌，10 min后，将乳白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，130 ℃ ~ 150 ℃反应12 h，降至室温，将白色的产物收集，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在60 ℃下减压干燥，得到TiO2；
其中步骤（2）制备氮掺杂的石墨烯量子点包括：
5 ~ 15 mmol尿素与2 ~ 3 mmol柠檬酸溶于12 mL去离子水中，搅拌10 min，将溶液转移到50 mL聚四氟乙烯反应釜中，140 ℃ ~ 180 ℃反应8 h，降至室温，离心、洗涤、60 ℃真空干燥，得到N-GQDs；
其中步骤（3）制备氨基修饰的硫化镉量子点包括：
将100 ~ 150 μL的半胱氨酸滴加到25 mL的0.05 ~ 0.2 mol/L CdCl2水溶液中，溶液中通入氮气，持续30 min，并用1 mol/L NaOH调溶液pH值至11，将2 ~ 3 mL的0.1 mol/LNa2S水溶液注入到溶液中，氮气流中回流4 h，得到氨基化的CdS QDs，4 ℃冰箱里储存待用；
其中步骤（4）制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料包括：
①0.4 ~ 0.8 mL 0.1 mol/L冰水配制的NaBH4加入到不停搅拌的15 ~25 mL 2.50×10-4 mol/L HAuCl4溶液中，冰水中继续搅拌10 min，在常温下搅拌3 h，溶液颜色逐渐变成酒红色，得到金纳米粒子，金胶溶液保存于4 ℃冰箱待用；
②将1 ~ 3 mg MWCNT超声分散在10 mL甲醇中，滴加10 ~ 14 mg EDC和10 ~ 14 mgNHS进行活化，室温下搅拌30 min，加入15 ~ 25 mg β-氨基乙硫醇，继续反应12 h，用大量超纯水冲洗溶液混合物，超声处理将1 ~ 3 mg硫醇化MWCNT分散在1 mL超纯水中；
③将40 ~ 100 mmol / L的Au NPs溶液添加到上述溶液中，孵育2 h以促进金-硫醇键的形成，过滤，并用超纯水冲洗，最后，将所需的Au / MWCNTs重新分配到1 mL超纯水中。
其中步骤（5）制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料孵化前列腺特异性抗原的二抗标记物包括：
①超声波处理下将0.5 ~ 2 mg MWCNT分散在1 mL超纯水中30 min，将上述溶液与0.5~ 2 mL 10 µg·mL-1的Ab2溶液混合，在4 ℃下震荡12 h，加入0.5 ~ 2 mL的EDC（0.01 mol/L）/NHS（0.002 mol/L）活化羧基，4 ℃下恒温震荡孵化10 h；
②加入0.5 ~ 2 mL 0.1 %的BSA溶液封闭非特异性位点，在4 ℃条件下震荡孵化3 h，然后通过连续离心除去未结合的Ab2，最后，获得所需的Au/MWCNTs-Ab2并重新分配在1 mLpH7.4的磷酸盐缓冲液，置于4 ℃冷藏待用。
其中步骤（6）制备夹心型检测前列腺特异性抗原的光电化学免疫传感器的工作曲线包括：
①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg / mL TiO2悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，450 ℃煅烧30 min；
③将3 ~ 5 μL、3 ~ 7 mg / mL N-GQDs溶液滴加至TiO2修饰的电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，制得TiO2 / N-GQDs电极；
④在TiO2 / N-GQDs电极表面滴加3 ~ 5 μL氨基修饰的CdS QDs溶液，室温下晾干，超纯水冲洗，制得TiO2 / N-GQDs / CdS电极；
⑤在修饰电极表面继续滴加3 ~ 5 μL的l-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 /N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
⑥继续滴加3 ~ 5 μL、浓度为10 μg / mL前列腺特异性抗体溶液，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃下孵化1 h；
⑦继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑧继续滴加3 ~ 5 μL、0.0001 ~ 50 ng/mL的前列腺抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
⑨继续滴加3 ~ 5 μL、Au / MWCNTs纳米复合物标记的前列腺抗原的抗体溶液在电极表面与前列腺抗原特异性结合，室温下孵化1 h，清洗干净，制得一种基于TiO2/N-GQDs/CdS的前列腺抗原的夹心型光电化学传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；
所述的1 - 乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 / N -羟基琥珀酰亚胺含1×10-2 mol/L的1-乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）- 碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺；
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明通过Au/MWCNTs纳米复合物对N-GQDs和CdS双敏化海胆状TiO2的抑制作用，成功构建了夹心型PEC免疫传感器用于PSA检测。TiO2具有三维海胆状结构，通过高比表面积负载N-GQDs和CdS QDs，获得优异的初始光电流。Au/MWCNTs纳米复合物具有良好的导电性和金纳米粒子的EPI效应，可以有效地降低光电流，协同地提高了该传感器的灵敏度。
（2）该免疫传感器对PSA检测灵敏度高，线性范围从0.1 pg/mL到50 ng/mL，检测限低，为6.16 fg·mL-1。制备的免疫传感器稳定性高，重现性好。
（3）本发明为PSA的早期检测提供了一种新颖可行的检测方法，操作简单，检测快捷，可用于实际样品的检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1制备海胆状二氧化钛包括：
实施例1制备海胆状二氧化钛，步骤如下：
将0.5 mL的钛酸四丁酯加入到含有20 mL冰乙酸的锥形瓶中，在室温下持续搅拌，10min后，将乳白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，130 ℃反应12 h，降至室温，将白色的产物收集，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在60 ℃下减压干燥，得到TiO2。
实施例2制备海胆状二氧化钛，步骤如下：
将1 mL的钛酸四丁酯加入到含有30 mL冰乙酸的锥形瓶中，在室温下持续搅拌，10 min后，将乳白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，140 ℃反应12 h，降至室温，将白色的产物收集，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在60 ℃下减压干燥，得到TiO2。
实施例3制备海胆状二氧化钛，步骤如下：
将2 mL的钛酸四丁酯加入到含有40 mL冰乙酸的锥形瓶中，在室温下持续搅拌，10 min后，将乳白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，150 ℃反应12 h，降至室温，将白色的产物收集，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在60 ℃下减压干燥，得到TiO2。
实施例4制备氮掺杂的石墨烯量子点，步骤如下：
5 mmol尿素与2 mmol柠檬酸溶于12 mL去离子水中，搅拌10 min，将溶液转移到50 mL聚四氟乙烯反应釜中，140 ℃反应8 h，将至室温，离心、洗涤、60 ℃真空干燥，得到N-GQDs。
实施例5制备氮掺杂的石墨烯量子点，步骤如下：
10 mmol尿素与2.5 mmol柠檬酸溶于12 mL去离子水中，搅拌10 min，将溶液转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，160 ℃反应8 h，将至室温，离心、洗涤、60 ℃真空干燥，得到N-GQDs。
实施例6制备氮掺杂的石墨烯量子点，步骤如下：
15 mmol尿素与3 mmol柠檬酸溶于12 mL去离子水中，搅拌10 min，将溶液转移到50 mL聚四氟乙烯反应釜中，180 ℃反应8 h，将至室温，离心、洗涤、60 ℃真空干燥，得到N-GQDs。
实施例7制备氨基修饰的硫化镉量子点，步骤如下：
将100 μL的半胱氨酸滴加到25 mL的0.05 mol/L CdCl2水溶液中，在溶液中加入氮气，持续30 min，并用1 mol/L NaOH将上述溶液的pH值调整至11，将2 mL的0.1 mol/L Na2S水溶液注入到溶液中，混合物在氮气流中回流4 h，得到氨基化的CdS QDs，4 ℃冰箱里储存待用。
实施例8制备氨基修饰的硫化镉量子点，步骤如下：
将125 μL的半胱氨酸滴加到25 mL的0.1 mol/L CdCl2水溶液中，在溶液中加入氮气，持续30 min，并用1 mol/L NaOH将上述溶液的pH值调整至11，将2.5 mL的0.1 mol/L Na2S水溶液注入到溶液中，混合物在氮气流中回流4 h，得到氨基化的CdS QDs，4 ℃冰箱里储存待用。
实施例9制备氨基修饰的硫化镉量子点，步骤如下：
将150 μL的半胱氨酸滴加到25 mL的0.2 mol/L CdCl2水溶液中，在溶液中加入氮气，持续30 min，并用1 mol/L NaOH将上述溶液的pH值调整至11，将3 mL的0.1 mol/L Na2S水溶液注入到溶液中，混合物在氮气流中回流4 h，得到氨基化的CdS QDs，4 ℃冰箱里储存待用。
实施例10制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料，步骤如下：
①0.4 mL 0.1 mol/L冰水配制的NaBH4加入到不停搅拌的15 mL 2.50×10-4 mol/LHAuCl4溶液中，继续在冰水里搅拌10 min，在常温下搅拌3 h，溶液颜色逐渐变成酒红色，得到金纳米粒子，金胶溶液保存于4 ℃冰箱待用；
②将1 mg MWCNT超声分散在10 mL甲醇中，滴加10 mg EDC和10 mg NHS进行活化，室温下搅拌30 min，加入15 mg β-氨基乙硫醇，继续反应12 h，用大量超纯水冲洗溶液混合物，通过超声处理将1 mg硫醇化MWCNT分散在1 mL超纯水中；
③将40 mmol / L的Au NPs溶液添加到上述溶液中，孵育2 h以促进金-硫醇键的形成。随后将溶液过滤，并用超纯水冲洗。最后，将所需的Au / MWCNTs重新分配到1 mL超纯水中。
实施例11制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料，步骤如下：
①0.6 mL 0.1 mol/L冰水配制的NaBH4加入到不停搅拌的20 mL 2.50×10-4 mol/LHAuCl4溶液中，继续在冰水里搅拌10 min，在常温下搅拌3 h，溶液颜色逐渐变成酒红色，得到金纳米粒子，金胶溶液保存于4 ℃冰箱待用；
②将2 mg MWCNT超声分散在10 mL甲醇中，滴加12 mg EDC和12 mg NHS进行活化，室温下搅拌30 min，加入20 mg β-氨基乙硫醇，继续反应12 h，用大量超纯水冲洗溶液混合物，通过超声处理将2 mg硫醇化MWCNT分散在1 mL超纯水中；
③将70 mmol / L的Au NPs溶液添加到上述溶液中，孵育2 h以促进金-硫醇键的形成。随后将溶液过滤，并用超纯水冲洗。最后，将所需的Au / MWCNTs重新分配到1 mL超纯水中。
实施例12制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料，步骤如下：
①0.8 mL 0.1 mol/L冰水配制的NaBH4加入到不停搅拌的25 mL 2.50×10-4 mol/LHAuCl4溶液中，继续在冰水里搅拌10 min，在常温下搅拌3 h，溶液颜色逐渐变成酒红色，得到金纳米粒子，金胶溶液保存于4 ℃冰箱待用；
②将3 mg MWCNT超声分散在10 mL甲醇中，滴加14 mg EDC和14 mg NHS进行活化，室温下搅拌30 min，加入25 mg β-氨基乙硫醇，继续反应12 h，用大量超纯水冲洗溶液混合物，通过超声处理将3 mg硫醇化MWCNT分散在1 mL超纯水中；
③将100 mmol / L的Au NPs溶液添加到上述溶液中，孵育2 h以促进金-硫醇键的形成。随后将溶液过滤，并用超纯水冲洗。最后，将所需的Au / MWCNTs重新分配到1 mL超纯水中。
实施例13制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料孵化前列腺特异性抗原的二抗标记物，步骤如下：
①超声波处理下将0.5 mg MWCNT分散在1 mL超纯水中30 min。将上述溶液与0.5 mL10 µg·mL-1的Ab2溶液混合，在4 ℃下震荡12 h，加入0.5 mL的EDC（0.01 mol/L）/NHS（0.002 mol/L）活化羧基，4 ℃下恒温震荡孵化10 h；
②加入0.5 mL 0.1 %的BSA溶液封闭非特异性位点，在4 ℃条件下震荡孵化3 h，然后通过连续离心除去未结合的Ab2，最后，获得所需的Au/MWCNTs-Ab2并重新分配在1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲液，置于4 ℃冷藏待用。
实施例14制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料孵化前列腺特异性抗原的二抗标记物，步骤如下：
①超声波处理下将1 mg MWCNT分散在1 mL超纯水中30 min。将上述溶液与1 mL 10 µg·mL-1的Ab2溶液混合，在4 ℃下震荡12 h，加入1 mL的EDC（0.01 mol/L）/NHS（0.002 mol/L）活化羧基，4 ℃下恒温震荡孵化10 h；
②加入1 mL 0.1 %的BSA溶液封闭非特异性位点，在4 ℃条件下震荡孵化3 h，然后通过连续离心除去未结合的Ab2，最后，获得所需的Au/MWCNTs-Ab2并重新分配在1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲液，置于4 ℃冷藏待用。
实施例15制备碳纳米管负载金纳米粒子的纳米复合材料孵化前列腺特异性抗原的二抗标记物，步骤如下：
①超声波处理下将2 mg MWCNT分散在1 mL超纯水中30 min。将上述溶液与2 mL 10 µg·mL-1的Ab2溶液混合，在4 ℃下震荡12 h，加入2 mL的EDC（0.01 mol/L）/NHS（0.002 mol/L）活化羧基，4 ℃下恒温震荡孵化10 h；
②加入2 mL 0.1 %的BSA溶液封闭非特异性位点，在4 ℃条件下震荡孵化3 h，然后通过连续离心除去未结合的Ab2，最后，获得所需的Au/MWCNTs-Ab2并重新分配在1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲液，置于4 ℃冷藏待用。
实施例16制备夹心型检测前列腺特异性抗原的光电化学免疫传感器的工作曲线，步骤如下：
①将2.5 cm 骤如下：原的夹心的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将8 μL、3 mg / mL TiO2悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，450 ℃煅烧30min；
③将3 μL、3 mg / mL N-GQDs溶液滴加至TiO2修饰的电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，制得TiO2 / N-GQDs电极；
④在TiO2 / N-GQDs电极表面滴加3 μL氨基修饰的CdS QDs溶液，室温下晾干，超纯水冲洗；
⑤在修饰电极表面继续滴加3 μL的l-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
⑥继续滴加3 μL、浓度为10 μg/ mL前列腺特异性抗体溶液，反应20 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃下孵化1 h；
⑦继续滴加3 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑧继续滴加3 μL、0.0001 ~ 50 ng/mL的前列腺抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑨继续滴加3 μL、Au / MWCNTs纳米复合物标记的前列腺抗原的抗体溶液在电极表面与前列腺抗原特异性结合，室温下孵化1 h，清洗干净，制得一种基于TiO2/N-GQDs/CdS的前列腺抗原的夹心型光电化学传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；
所述的1 - 乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 / N -羟基琥珀酰亚胺含1×10-2 mol/L的1-乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例17制备夹心型检测前列腺特异性抗原的光电化学免疫传感器的工作曲线，步骤如下：
①将2.5 cm 骤如下：原的夹心的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将10 μL、5 mg / mL TiO2悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，450 ℃煅烧30min；
③将4 μL、5 mg / mL N-GQDs溶液滴加至TiO2修饰的电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，制得TiO2 / N-GQDs电极；
④在TiO2 / N-GQDs电极表面滴加4 μL氨基修饰的CdS QDs溶液，室温下晾干，超纯水冲洗；
⑤在修饰电极表面继续滴加4 μL的l-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
⑥继续滴加4 μL、浓度为10 μg/ mL前列腺特异性抗体溶液，反应30 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃下孵化1 h；
⑦继续滴加4 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑧继续滴加4 μL、0.0001 ~ 50 ng/mL的前列腺抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑨继续滴加4 μL、Au / MWCNTs纳米复合物标记的前列腺抗原的抗体溶液在电极表面与前列腺抗原特异性结合，室温下孵化1 h，清洗干净，制得一种基于TiO2/N-GQDs/CdS的前列腺抗原的夹心型光电化学传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；
所述的1 - 乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 / N -羟基琥珀酰亚胺含1×10-2 mol/L的1-乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例18制备夹心型检测前列腺特异性抗原的光电化学免疫传感器的工作曲线，步骤如下：
①将2.5 cm 骤如下：原的夹心的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
②将12 μL、7 mg / mL TiO2悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，450 ℃煅烧30min；
③将5 μL、7 mg / mL N-GQDs溶液滴加至TiO2修饰的电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，制得TiO2 / N-GQDs电极；
④在TiO2 / N-GQDs电极表面滴加5 μL氨基修饰的CdS QDs溶液，室温下晾干，超纯水冲洗；
⑤在修饰电极表面继续滴加5 μL的l-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
⑥继续滴加5 μL、浓度为10 μg/ mL前列腺特异性抗体溶液，反应40min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃下孵化1 h；
⑦继续滴加5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑧继续滴加5 μL、0.0001 ~ 50 ng/mL的前列腺抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑨继续滴加5 μL、Au / MWCNTs纳米复合物标记的前列腺抗原的抗体溶液在电极表面与前列腺抗原特异性结合，室温下孵化1 h，清洗干净，制得一种基于TiO2/N-GQDs/CdS的前列腺抗原的夹心型光电化学传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；
所述的1 - 乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 / N -羟基琥珀酰亚胺含1×10-2 mol/L的1-乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例19如权利要求l所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于前列腺抗原的检测，检测步骤如下：
①使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；
②采用i-t法对不同浓度的标品前列腺特异性抗原进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50 s，激发光源的为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；
将待测血清稀释50倍之后代替 ② 中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中前列腺特异性抗原的含量。

Claims (4)

1.一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：
（1）将2.5 cm的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酣、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；
（2）将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg / mL TiO2悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，450℃煅烧30分钟；
（3）将3 ~ 5 μL、3 ~ 7 mg / mL N-GQDs溶液滴加至TiO2修饰的电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，制得TiO2 / N-GQDs电极；
（4）在TiO2 / N-GQDs电极表面滴加3 ~ 5 μL氨基修饰的CdS QDs溶液，室温下晾干，超纯水冲洗，制得TiO2 / N-GQDs / CdS电极；
（5）在修饰电极表面继续滴加3 ~ 5 μL的l-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
（6）继续滴加3 ~ 5 μL、浓度为10 μg/ mL前列腺特异性抗体溶液，反应20 ~ 40min后用超纯水冲洗电极表面，4℃下孵化1 h；
（7）继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（8）继续滴加3 ~ 5 μL、0.0001 ~ 50 ng/mL的前列腺抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（9）继续滴加3 ~ 5 μL、Au / MWCNTs纳米复合物标记的前列腺抗原的抗体溶液在电极表面与前列腺抗原特异性结合，室温下孵化1 h，清洗干净，制得一种基于TiO2/N-GQDs/CdS的前列腺抗原的夹心型光电化学传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；
所述的1 - 乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 / N -羟基琥珀酰亚胺含1 ×10-2 mol/L的1-乙基- 3 - (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和2 × 10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。
2.如权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，所述TiO2/N-GQDs/CdS电极的制备，其特征在于，步骤如下：
（1）将0.5 ~ 2 mL的钛酸四丁酯加入到含有20 ~ 40 mL冰乙酸的锥形瓶中，室温下持续搅拌10 min，将乳白色悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，130 ℃ ~ 150 ℃反应12h，降至室温，将白色的产物收集，用超纯水和无水乙醇洗涤数次， 60 ℃下减压干燥，得到TiO2；
（2）5 ~ 15 mmol尿素与2 ~ 3 mmol柠檬酸溶于12 mL去离子水中，搅拌10 min，将溶液转移到50 mL聚四氟乙烯反应釜中，140 ℃ ~ 180 ℃反应8 h，降至室温，离心、洗涤、60 ℃真空干燥，得到N-GQDs；
（3）将100 ~ 150 μL的半胱氨酸滴加到25 mL的0.05 ~ 0.2 mol/L CdCl2水溶液中，溶液中通入氮气，持续30 min，并用1 mol/L NaOH调溶液pH值至11，将2 ~ 3 mL的0.1 mol/LNa2S水溶液注入到溶液中，氮气流中回流4 h，得到氨基化的CdS QDs，4℃冰箱里储存待用；
（4）将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg / mL TiO2悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，450℃煅烧30 min，自然冷却至室温，将3 ~ 5 温燥、3 ~ 7 mg / mL N-GQDs溶液滴加至TiO2修饰的电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，在电极表面继续滴加3 ~ 5 滴氨基修饰的CdS QDs溶液，室温下晾干，超纯水冲洗，制得TiO2/N-GQDs/CdS电极。
3.如权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，所述Au / MWCNTs的制备，其特征在于，步骤如下：
（1）0.4 ~ 0.8 mL 0.1 mol/L冰水配制的NaBH4加入到不停搅拌的15 ~25 mL 2.50×10-4 mol/L HAuCl4溶液中，冰水中继续搅拌10 min，在常温下搅拌3 h，溶液颜色逐渐变成酒红色，得到金纳米粒子，金胶溶液保存于4℃冰箱待用；
（2）将1 ~ 3 mg MWCNT超声分散在10 mL甲醇中，滴加10 ~ 14 mg EDC和10 ~ 14 mgNHS进行活化，室温下搅拌30 min，加入15 ~ 25 mg β-氨基乙硫醇，继续反应12 h，用大量超纯水冲洗溶液混合物，超声处理将1 ~ 3 mg硫醇化MWCNT分散在1 mL超纯水中；
（3）将40 ~ 100 mmol / L的Au NPs溶液添加到上述溶液中，孵育2 h以促进金-硫醇键的形成，过滤，并用超纯水冲洗，将所需的Au / MWCNTs重新分配到1 mL超纯水中，制得Au /MWCNTs。
4.如权利要求l所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于前列腺抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；
（2）采用i-t法对不同浓度的标品前列腺特异性抗原进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50 s，激发光源为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；
（3）将待测血清稀释50倍之后代替（2）中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中前列腺特异性抗原的含量。
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