CN103003292A

CN103003292A - 化妆品组合物

Info

Publication number: CN103003292A
Application number: CN2011800283344A
Authority: CN
Inventors: 夏洛特·西米尔; 维尔日妮·勒普朗夸; 埃马努埃利·诺布尔斯赛; 帕特里斯·安德; 安纳利斯·洛布斯坦
Original assignee: Jiao lan; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Strasbourg
Current assignee: Jiao lan; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Strasbourg
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-14
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-04-14
Also published as: JP5786019B2; EP2556080B1; KR20140053755A; CN103003292B; WO2011125057A1; US20130157968A1; WO2011125057A4; KR101896722B1; ES2546490T3; FR2958644B1; JP2013527146A; US9012414B2; FR2958644A1; EP2556080A1

Abstract

本发明涉及新的红果酸（2-(4-羟基苄基)苹果酸）衍生物或含有此类衍生物的植物提取物，还涉及含有这些化合物或提取物的化妆品组合物或皮肤病学组合物、以及使用所述组合物的化妆用护理方法。本发明尤其涉及特征在于由下式（I）所示的化合物：

其中：R₁和R₃各自独立地表示氢原子或者饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链，所述烃基链包含芳基、优选苯基，所述芳基优选被含糖、优选单糖或二糖的基团取代，所述链还任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子；R₂表示氢原子或糖、优选单糖或二糖，所述糖任选被取代、特别是被包含饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链残基取代，所述烃基链本身含有芳基、优选苯基，所述烃基链还任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子；但R₁、R₂和R₃不同时为氢原子。

Description

化妆品组合物

技术领域

本发明涉及新的红果酸(eucomic acid)(2-(4-羟基苄基)苹果酸)衍生物、含有这些化合物中至少一种的化妆品组合物或皮肤病学组合物以及使用所述组合物的护理方法(care methods)。

背景技术

现有技术

线粒体凭借它们的呼吸链和氧化磷酸化构成了产生细胞能量的工厂。在皮肤老化、尤其是光诱发的皮肤老化的过程中，观察到线粒体功能的降低。

一般而言，有缺陷的线粒体呼吸链导致细胞内活性氧(ROS)增加，加快了皮肤的老化进程。这种线粒体机能障碍引起细胞能量代谢降低，最终危及细胞能量生产。在化妆品行业里，能够刺激线粒体呼吸链运行、从而活化细胞能量代谢的活性剂要求具有抗老化功能(CoQ10，白藜芦醇)。此外，刺激细胞更新并因此分化的化妆品活性剂有助于维持年轻健康的皮肤。

本发明涉及由红果酸(2-(4-羟基苄基)苹果酸)衍生而来、尤其是从具有此类性能的兰科植物凤蝶兰(Papilionanthe teres)提取物中获得的新化合物。

红果酸是已知的。它最初分离自凤头百合(Eucomis punctata)(百合科)球茎提取物(Heller等，Helvetica Chimica Acta，1984，57(6)，1766-84)，然后在其他植物物种中也被鉴定出，如百脉根(Lotus japonicus)(豆科)、野百合(Crotalaria sessiflora)(豆科)、山楂(Crataegus pinnatifada)(蔷薇科)、或者围柱兰(Encyclia michuacana)(兰科)。

兰科(orchidaceans或orchids)是单子叶植物的一个非常大的科。它是最多样化的植物科，含有两万五千个以上的种，分布遍及八百五十个属。某些兰科植物已经成为化妆品领域中针对护肤应用的研究的对象。

例如，专利申请FR 2 924 348公开了从兰科植物棒叶万带兰(Vandateres)(现在作为叫做凤蝶兰的种被分类在凤蝶兰属)的至少一个部分中获得的提取物、以及所述提取物在化妆品组合物中作为活性剂的用途，所述化妆品组合物含有至少一种在化妆品方面可接受的赋形剂，并意在施用于皮肤以减少或推迟皮肤老化的影响。

因此，从它的活性、尤其是化妆品活性和皮肤病学活性的角度来看，这种凤蝶兰提取物是特别有利的。然而，就本发明人了解，引起这些活性的分子迄今为止还未被分离或发现。

发明内容

本发明的主要目的在于提供能减少或推迟皮肤老化影响、和/或维持或改善皮肤水分和/或促进皮肤愈合的新化合物，所述新化合物可用作化妆品活性剂或皮肤病学活性剂。

本发明的目的还在于提供以可在化妆品组合物或皮肤病学组合物中作为活性剂使用的形式、尤其是以富集这些新化合物中至少一种的植物提取物的形式存在的这些新化合物。

根据另一方面，本发明涉及适合对皮肤局部施用的化妆品组合物或皮肤病学组合物，该组合物含有这些化合物中的至少一种作为化妆品试剂或皮肤病学试剂、或含有植物提取物形式的此类活性剂，所述试剂或活性剂处于化妆品方面或皮肤病学上可接受的辅料中。

本发明的目的还在于解决对兰科植物凤蝶兰提取物的一种或多种活性分子进行分离和表征所构成的技术问题。

最后，本发明的目的在于，以可在工业水平和化妆品水平上使用的、特别简单并且相对便宜的方式对这些技术问题提出解决方案。

具体实施方式

本发明的发明人已经分离并鉴定出由红果酸衍生物而来、尤其是从兰科植物凤蝶兰的提取物中获得的新化合物。下面式(I)的这些新化合物在本申请中被统称为“角质再生素(vandaterosides)”(缩写为“VT”)。

本发明人还证明了本发明的角质再生素对人角质细胞(NHK和HaCaT)线粒体呼吸链运行的影响，所述影响更具体地集中在呼吸链复合物I和呼吸链复合物II以及细胞色素C氧化酶上。同时发明人证明了它们显著刺激线粒体呼吸链的运行和人角化细胞的细胞分化。因此，这些分子扮演了能量代谢调节和细胞氧化应激调节的核心，并因此作为用于对抗皮肤老化的化妆品组合物或皮肤病学组合物中的活性剂有着意想不到的兴趣。上述化合物通过刺激细胞更新和分化，来参与细胞代谢、刺激角质层更新和有助于维持年轻健康的皮肤。

所用的技术需要：首先，测量由NHK复合物I和复合物II进行的XTT(2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑氢氧化物)到可溶性甲的转化；其次，实际测量细胞色素C氧化酶的酶活性，所述细胞色素C氧化酶提取自被修饰的人角质细胞(HaCaT)线粒体。

类似地，本发明人已经通过免疫标记，评价了这些角质再生素对NHK分化表达蛋白(转谷氨酰胺酶、外皮蛋白(involucrin)、桥粒芯糖蛋白I(desmoglein I))产生的作用。这一分化过程参与角质化包膜(cornified envelope)的细胞更新。

本发明的第一个主题指向式(I)化合物，

其中：

R₁和R₃各自独立地表示氢原子或者饱和或不饱和、优选C₁-C₁₂烃基链(hydrocarbon-based chain)，所述烃基链包含芳基、优选苯基，所述芳基优选被含糖、优选含单糖或二糖的基团取代，所述链还任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子；R₂表示氢原子或糖、优选单糖或二糖，所述糖任选被取代、优选通过羟基官能团之一的酯化作用被取代、尤其是被包含饱和或不饱和、优选C₁-C₁₂烃基链的残基所取代，所述烃基链本身含有芳基、优选苯基，所述烃基链还任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子；但R₁、R₂和R₃不同时为氢原子。

所述糖优选为：单糖，例如葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖或阿拉伯糖；或二糖，例如蔗糖或麦芽糖；或它们的衍生物。

本发明的优选化合物尤其为下述式(I)化合物，其中R₁和/或R₃表示被OR₄基团取代、优选在对位取代的苄基，其中基团R₄表示选自如下基团的基团：(i)氢原子或烷基基团，所述烷基基团包含直链或支链的、和/或环状、芳香族或非芳香族的、饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链，所述烃基链任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子，所述烃基链本身未被取代或优选被含糖、优选含单糖或二糖的基团取代；以及(ii)糖的残基、优选单糖或二糖的残基，所述的糖任选被尤其是包含直链或支链、和/或环状的、芳香族或非芳香族的、饱和或不饱和的、取代或未取代的、优选C₁-C₁₂的烃基链的残基取代，所述烃基链本身任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子。

优选地，R₁和R₃相同或不同，并且表示氢原子或优选被吡喃葡萄糖基氧基(glucopyranosyloxy)基团取代的苄基基团(例如4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基基团)；R₂表示吡喃葡萄糖基基团(例如β-D-吡喃葡萄糖基基团)，该基团优选被取代、尤其是通过羟基官能团的酯化作用被饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链取代，所述烃基链本身包含芳基、优选苯基，R₂尤其表示β-D-吡喃葡萄糖基-3-反式肉桂酰酯基团；R₁、R₂和R₃不同时为氢原子。

更为特别优选的化合物为下述化合物，其中R₁和/或R₃相同或不同，并表示被OR₄基团取代的苄基，R₄表示任选取代的吡喃葡萄糖基基团。

在后者化合物中，优选化合物尤其为式(I)中R₁和R₃相同、且各自表示4′-(吡喃葡萄糖基氧基)苄基基团的化合物。

有利地，位于式(I)苹果酸根部分的2位的不对称碳原子以(R)对映异构体构象存在。

用于实现本发明的特别优选的化合物为具有下式的化合物：

尤其是4-(4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基)-(2R)-2-(对羟基苄基)苹果酸酯；

尤其是1，4-双(4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基)-(2R)-2-(对羟基苄基)苹果酸酯；

以及尤其是1，4-双(4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基)-(2R)-2-(2-β-D-吡喃葡萄糖基-3-反式肉桂酰酯)-2-(对羟基苄基)苹果酸酯。

本发明的第二个主题涉及植物提取物，其特征在于所述植物提取物特别地富集如上所述式(I)化合物中的一种或多种。

有利地，所述提取物从兰科植物(尤其是属于凤蝶兰属(Papilionanthe)、万带兰属(Vanda)或围柱兰属(Encyclia)的兰科植物)的至少一个部分中获得。

优选的提取物其特征尤其在于，所述提取物是从兰科植物凤蝶兰(尤其是从所述兰科植物的茎、根或花)中获得，还在于所述提取物包含至少一种式(I)化合物、优选VT1和/或VT2和/或VT3。

术语“特别地富集”或“富集”意在表示：通过旨在有意提高提取物中式(I)化合物、优选VT1和/或VT2和/或VT3化合物含量的步骤而得到的提取物。

尤其有利地，所述富集的提取物通过糖去除步骤或通过分馏法(fractionation)、以及例如通过尺寸排阻色谱法获得。

典型的提取物为其中以一定浓度含有式(I)化合物、优选VT1和/或VT2和/或VT3化合物的干燥提取物，该浓度高于提取后没有进行旨在特别地提高上述化合物浓度的步骤而得到的干燥提取物中的化合物浓度。

相对干燥提取物的总重量，所述富集的提取物优选包含至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％并且更优选至少80wt％的式(I)化合物、优选VT1和/或VT2和/或VT3化合物。

有利地从兰科植物凤蝶兰中制备的、本发明的特定提取物其特征在于，所述提取物包含一种或多种选自VT1和/或VT2的化合物，所述化合物的累计含量(相对干燥提取物的重量)大于40wt％、优选大于60wt％、并且更优选大于80wt％。

同样有利地从兰科植物凤蝶兰中制备出的本发明的另一提取物其特征在于，所述提取物包含VT3化合物，所述化合物的含量(相对干燥提取物的重量)大于8wt％、优选大于15wt％、优选大于25wt％、并且更优选大于40wt％。

有利地，本发明提取物的特征在于，相对于干燥提取物总重量，所述提取物的至少80wt％、优选至少90wt％由VT1、VT2和VT3化合物组成。

优选富集的提取物更尤其是由兰科植物凤蝶兰的茎或根制备。

本发明的第三个主题涉及化妆品组合物或皮肤病学组合物，所述组合物含有至少一种式(I)化合物、和/或含有此类化合物的植物提取物作为化妆品活性剂或皮肤病学活性剂，所述植物提取物有利地为如上所述变体和实施方式中的任何一种。

除了上述提及的化合物或提取物中的至少一种之外，所述化妆品组合物还可包含一种或多种其他的化妆品活性剂或皮肤病学活性剂，所述活性剂为纯化分子或植物提取物的形式，具有与所述化合物的美容效果类似和/或互补的美容效果。

因此，所述组合物尤其可包含一种或多种其他植物提取物(所述植物提取物从整个植物或植物的部分中获得)，或者包含由这些植物提取物制备的溶液，所述提取物通过用本领域技术人员通常使用的方法、更尤其是通过用极性溶剂或极性溶剂混合物提取来有利地获得，所述极性溶剂有利地选自水、C₁-C₄醇或乙二醇。

例如，其他化妆品活性剂或皮肤病学活性剂可选自如下物质：具有抗老化活性的物质；对于皮肤具有褪色活性或美白活性的物质；具有减肥活性的物质；具有保湿活性的物质；具有镇静、舒缓或放松活性的物质；刺激皮肤微循环从而改善肤色光彩、尤其是面部光彩的物质；用于油腻皮肤护理、具有皮脂调节活性的物质；用来清洁或净化皮肤的物质；以及具有自由基清除活性的物质。

所述组合物可有利地包含至少一种兰科植物的提取物，所述兰科植物的提取物例如：属于白拉索卡特兰(Brassocattleya)属的兰科植物提取物，例如兰科植物白拉索兰(Brassocattleya marcella)的提取物；属于围柱兰属的兰科植物的提取物，例如兰科植物围柱兰的提取物；属于卡特兰(Cattleya)属的兰科植物的提取物；属于万带兰属的兰科植物的提取物，例如来自大花万带兰(Vanda coerulea)或狄氏万代兰(Vandadenisoniana)的兰科植物提取物；或属于凤蝶兰属的兰科植物的提取物。

有利地，所述组合物还包含至少一种在化妆品方面或皮肤病学上可接受的赋形剂，所述赋形剂尤其可选自颜料、着色剂、聚合物、表面活性剂、流变剂、香料(fragrances)、电解质、pH调节剂、抗氧化剂和防腐剂、以及它们的混合物。

有利地，所述化妆品组合物或皮肤病学组合物为精华(serum)、化妆水(lotion)、霜剂(cream)或水凝胶、尤其是面膜(mask)的形式，或为棒(stick)或贴剂(patch)的形式。

本发明的第四个主题涉及至少一种式(I)化合物或至少一种含有此类化合物的植物提取物在化妆品组合物或皮肤病学组合物中作为化妆品活性剂或皮肤病学活性剂的用途，所述植物提取物有利地为如上所述变体和实施方式中的任何一种。

有利地，所述化合物或所述提取物是用来实现如下作用的活性剂：对抗皮肤老化，尤其是减少或推迟皮肤老化的影响、重建表皮、紧致肌肤、和/或促进皱纹的减少或再吸收以及表皮的防护性能；和/或维持或改善皮肤保湿和/或促进皮肤愈合。

所述发明还涉及至少一种式(I)化合物、或包含此类化合物的植物提取物在化妆品组合物或皮肤病学组合物中作为活性剂的用途，所述植物提取物有利地为如上所述变体和实施方式的任何一种，所述活性剂具有以下作用：刺激线粒体脱氢酶、和/或细胞色素C氧化酶、和/或线粒体呼吸链的表达和/或活性；和/或刺激细胞能量代谢；和/或刺激上皮细胞的分化和更新。

有利地，所述活性剂可以作用于表皮、尤其是上皮细胞、更尤其是角质细胞。

本发明还涉及至少一种包含此类化合物的兰科植物凤蝶兰(尤其是兰科植物凤蝶兰的茎或根)提取物在化妆品组合物或皮肤病学组合物中作为活性剂的用途，所述提取物有利地为如上所述变体和实施方式中的任何一种，所述活性剂用来对抗皮肤老化，尤其是用来减少或推迟皮肤老化的效果、重建表皮、紧致肌肤、和/或促进皱纹的减少或再吸收以及表皮的防护性能，和/或用来维持或改善皮肤保湿和/或促进皮肤愈合；所述活性剂具有如下作用：刺激线粒体脱氢酶、和/或细胞色素C氧化酶、和/或线粒体呼吸链的表达和/或活性；和/或刺激细胞能量代谢；和/或刺激上皮细胞的分化和更新。

有利地，本发明的化合物为用于刺激角质细胞分化蛋白表达的活性剂。

对于上述提及的本发明的各个主题，相对所述组合物的重量，式(I)化合物或含有此类化合物的提取物的浓度为0.0001wt％-1wt％、更尤其为0.001wt％-0.1wt％、更特别是为0.01wt％-0.1wt％，所述式(I)化合物或含有此类化合物的提取物在化妆品组合物或皮肤病学组合物中用作化妆品活性剂或皮肤病学活性剂。

本发明的组合物显示出如下特别期望的效果：对抗皮肤老化，尤其是减少或推迟皮肤老化的影响、重建表皮、紧致肌肤、和/或促进皱纹的减少或再吸收以及表皮的防护性能；和/或维持或改善皮肤保湿和/或促进皮肤愈合。

本发明的主题还为化妆用护理方法或皮肤病学护理方法，所述护理方法的特征在于，该方法包含以有效量将如上所述的化妆品组合物或皮肤病学组合物施用至所涉及的皮肤区域，所施用的量对于下述作用有效：对抗皮肤老化，尤其是用于减少或推迟皮肤老化的影响、重建表皮、紧致肌肤、和/或促进皱纹的减少或再吸收以及表皮的防护性能；和/或维持或改善皮肤保湿；和/或促进皮肤愈合。

有利地，所述的方法包括将所述组合物施用至显示出老化迹象(例如存在皱纹或细线)的面部、颈部或身体、尤其是手部的皮肤区域。

本发明还涉及制备本发明的式(I)化合物、或本发明的富集的提取物的方法，所述方法包括：对含有此类化合物的植物(优选兰科植物、尤其是兰科植物凤蝶兰)的至少一个部分进行提取的步骤；以及至少一个富集步骤，该步骤对提取步骤中得到的提取物就一种或多种式(I)化合物、优选VT1和/或VT2和/或VT3化合物方面进行富集。

优选地，在提取步骤之前，这一方法包括对整个植物或植物的至少一个部分(优选茎、叶或根)进行研磨的步骤，以及然后对该植物或所述植物的部分进行提取的步骤。

有利地，在研磨前将所述植物或植物的部分进行干燥或冷冻。

优选地，使用至少一种极性溶剂进行提取。在所述极性溶剂中，可使用的是单一溶剂或溶剂混合物。所使用的极性溶剂优选为：水；醇，优选C₁-C₄醇，尤其是甲醇、乙醇或丙醇；多元醇，尤其是乙二醇、以及例如甘油、丙二醇或丁二醇。

在所述溶剂混合物中，优选使用的是水-醇混合物、优选乙醇/水混合物、更特别是比例为约90/10v/v的乙醇/水混合物。

优选可在处于回流的极性溶剂中、并且优选在索氏提取器中进行提取。可以通过使用一系列极性递增的溶剂使索氏提取优化，例如先是烷烃类溶剂(例如戊烷、己烷、环戊烷、环己烷、庚烷等)、再是卤代烷烃类溶剂(例如二氯甲烷)、然后是醇类溶剂(例如乙醇或甲醇)。

然后，可将提取物浓缩以除去溶剂或溶剂混合物。因此，可以得到干燥的化合物，该化合物可被溶解或分散在化妆品方面或皮肤病学上可接受的赋形剂中，所述赋形剂最终用于本发明的组合物中。

本发明的方法有利地包含在一种或多种如上所述的式(I)化合物方面，对在上述提取步骤中获得的提取物进行富集的步骤。该方法包含尤其是通过去除糖或通过分馏法、以及例如通过尺寸排阻色谱法进行富集的步骤。

另外，在存在极性溶剂的情况下放入提取物后，尤其是在存在活性炭的情况下，可将所述提取物部分或完全地脱色。

可将所提取的馏分用本领域技术人员已知的任何方法进行纯化，例如色谱法、尤其是凝胶柱色谱法和/或高效液相色谱法(HPLC)。

参考制备提取物的实施例以及证明提取物性能的测试的实施例、并参考使用此类提取物的化妆品组合物的实施例，根据下列解释性的描述，本发明的其他目的、特性和优点将变得显而易见；上述内容仅通过说明的方式而提供，因此不以任何方式限定本发明的保护范围。

在实施例中，除非另有陈述，所有的百分比以重量计，温度为摄氏度，压力为大气压力。

附图说明

在图中：

图1表示本发明的VT1、VT2和VT3化合物以及红果酸的半展开结构式(semi-structural formulae)。

图2表示本发明VT1、VT2和VT3化合物的质谱。

图3表示本发明VT1、VT2和VT3化合物的¹H NMR谱。

图4表示本发明VT1、VT2和VT3化合物的¹³C NMR谱(DEPT135)。

图5表示通过对含有本发明VT1、VT2和VT3化合物的实施例1.2的提取物(溶于5mg/mL MeOH)进行HPLC和UV检测而得到的曲线。

图6表示本发明VT1、VT2和VT3化合物对线粒体脱氢酶的活化作用；处理时间48h。阴性对照DMSO(0.1％；v/v)。从3次实验计算出平均值±SD(标准偏差)。

图7表示本发明VT1、VT2和VT3化合物对细胞色素C氧化酶表达的活性；处理HaCaT细胞：3h。阴性对照：未处理的细胞(DMSO(0.1％；v/v))，阳性对照：白藜芦醇(11.41μg/mL)。在三次独立实验的基础上得到平均值±SD(标准偏差)。

图8表示本发明VT1、VT2和VT3化合物对线粒体生物合成的活性；处理HaCaT细胞：48h。阴性对照：未处理的细胞(DMSO(0.1％；v/v))，阳性对照：白藜芦醇(11.41μg/mL)。在三次独立实验的基础上得到平均值±SD(标准偏差)。

图9表示用本发明VT1、VT2和VT3化合物处理对转谷氨酰胺酶表达的影响；

图10表示在存在本发明VT1、VT2或VT3化合物的情况下，转谷氨酰胺酶表达的照片(电子显微镜拍摄)；

图11表示用本发明VT1、VT2或VT3化合物处理对外皮蛋白表达的影响；

图12表示用本发明VT1、VT2或VT3化合物处理对桥粒芯糖蛋白1表达的影响；

图13表示在存在本发明VT1、VT2或VT3化合物的情况下，桥粒芯糖蛋白1表达的照片(电子显微镜拍摄)。

实施例

实施例1：凤蝶兰提取物

将兰科植物凤蝶兰的各个部分进行分析，从而对角质再生素在该植物的这些部分中各自的存在情况进行检测，并对其含量进行测定。

在提取步骤前，对100g干燥植物材料(PM)进行研磨，所述植物材料由兰科植物凤蝶兰的茎(实施例1.1和实施例1.2)、根(实施例1.3)或叶(实施例1.4)组成。

实施例1.1.凤蝶兰茎的水-醇提取物

在回流(30min，80℃)下制备干燥PM的总水-醇提取物(90/10v/v乙醇(EtOH)/水，PM/溶剂的比：1/15)。以12.8％重量收率(提取物重量/干燥PM重量)得到这一总提取物。

实施例1.2.凤蝶兰茎的甲醇提取物

比实施例1.1的提取方式更专用的索氏提取(Soxtec Avanti 2055装置)可以通过连续使用极性递增的如下3种溶剂将干燥PM完全提取：环己烷(45min，180℃)、二氯甲烷(循环1：45min，180℃，然后是循环2：30min，180℃)和甲醇(MeOH)(45min，180℃，进行2个循环)。

以6.9％重量收率(提取物的重量/干燥PM的重量)获得这一集中有角质再生素的甲醇提取物。

实施例1.3.凤蝶兰根的水-醇提取物

按照如下条件制备总水-醇提取物：90/10EtOH/水，PM/溶剂的比为1/15。在回流(30分钟，80℃)下制备提取物。得到根提取物的重量收率为14.8％。

实施例1.4.凤蝶兰叶的水-醇提取物

按照如下条件制备总水-醇提取物：90/10EtOH/水，研磨过的干燥PM/溶剂的比为1/15。在回流下(30分钟，80℃)制备提取物。得到的叶提取物的重量收率为15.0％。

将这些提取物(实施例1.1-实施例1.4)根据实施例2中描述的条件(分馏，分离)进行分析以确定3种式(I)化合物的存在，这3种化合物在分离和结构解析后分别被称为VT1、VT2和VT3。根据实施例2.1的方法，通过RP-HPLC用外部校准(external calibration)对上述化合物在各提取物和馏分中各自的浓度进行测定，所述外部校准为：制备每个分离出的化合物VT1、VT2和VT3的连续稀释溶剂，从而测定校准曲线。

结果显示在下表1中(另请参见图5)：

表1

	VT1	VT2	VT3
				凤蝶兰茎的水-醇提取物	6.7±1.7	14.1±0.6	2.6±0.2
凤蝶兰茎的甲醇提取物	9.4±0.4	19.3±1.2	3.4±0.7
				凤蝶兰叶的水-醇提取物	8.1±0.6	13.4±0.9	2.9±0.0
凤蝶兰根的水-醇提取物	1.6±0.4	24.8±2.5	2.0±0.0

表1：各种凤蝶兰提取物中角质再生素VT1、VT2和VT3的浓度(％w/w平均值±SD，三次进样)

结论

从这些分析中显示：

-角质再生素VT1、VT2和VT3存在于凤蝶兰植物的所有部分(茎、叶和根)；

-凤蝶兰根提取物集中了含量等于茎或叶的水-醇提取物中所测定含量1.8倍的VT2。

实施例2：特别地富集有角质再生素的提取物

选择根据上述实施例1得到的提取物进行尺寸分馏步骤，该步骤旨在在式(I)化合物方面对这些提取物加以特别地富集，所述式(I)化合物在分离和结构鉴定后称为VT1、VT2和VT3。

实施例2.1.通过凝胶柱色谱法的分馏

使用极性溶剂梯度(从100％水渐变为100％甲醇，流速为1mL/min)在Sephadex LH 20凝胶(LH20-100-Sigma)柱(28×180mm)上，将根据实施例1.2.得到的甲醇提取物的进行分馏。

将1克(g)该甲醇提取物在水/甲醇混合物(50/50v/v)中稀释，然后放置在30g Sephadex凝胶上。极性分子根据它们的尺寸以及它们在洗脱剂中的溶解度得以分开。

得到了20个10mL馏分，并根据它们相似的分布图将其组合，最终得到十个馏分，所述分布图是通过薄层色谱法得到的(洗脱剂：乙酸乙酯∶乙酸∶甲酸∶水(100∶11∶11∶26v/v/v/v)，支持物：60F₂₅₄硅胶(0.25mm，MERCK)，展开剂：香草醛(Merck)-H₂SO₄(97％Fluka)5％)。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析的目的在于，在10个初始馏分中，对集中有存在于总提取物中的式(I)化合物的馏分进行鉴定。

使用具有Nucleodur C₁₈ec柱(5μm，250mm×4.6mm i.d.)的色谱仪(Varian)进行RP-HPLC分析，该色谱仪装备有泵(Prostar 230)和二极管阵列检测器(Prostar 330)。MeOH-(水+0.1％甲酸(HCO₂H))混合物被用作洗脱溶剂，该洗脱溶剂以1mL/min的流速在13.5分钟的过程中按照线性梯度从20％MeOH开始升至47％MeOH，然后在47％MeOH保持10分钟，最后在10分钟的过程中从47％MeOH升至100％MeOH。将馏分在波长200nm-400nm间可视化(visualized)。

收集到重量为178mg的馏分A和重量为39.5mg的馏分B。

实施例2.2.式(I)化合物的分离：

将实施例2.1中选择的2个馏分A和B用来纯化本发明的化合物，并用来对实施例2.1中每个馏分进行定量。

使用Gilson色谱仪通过半制备HPLC对来自所选2个馏分各自的式(I)化合物(VT1、VT2和VT3)进行分离，该色谱仪装备有梯度泵(Gilson322)、UV检测器(Gilson UV-VIS 151)和Nucleodur C18ec柱(5μm，250mm×21mm i.d.)。将每个馏分在MeOH中制成30mg/mL，然后进行过滤(Minisart RC15过滤器，0.45μm)。洗脱条件需要如下条件下的MeOH-(水+0.1％HCO₂H)混合物：以14mL/min的流速，在13.5分钟的过程中从20％MeOH变为47％MeOH，在47％MeOH保持10分钟，然后在5分钟的过程中回到20％。在205nm下进行检测。

通过半制备HPLC纯化馏分A后，收集到重量为64mg的VT1化合物和重量为112mg的VT2化合物。

根据相同的方法纯化馏分B后，收集到重量为20mg的VT3化合物。

在馏分A和B的每一种及馏分(A+B)中，VT1、VT2和VT3化合物各自的含量和累积(VT1+VT2+VT3)含量显示在下表2中。

表2

	VT1	VT2	VT3	VT1+VT2+VT3
					馏分(A+B)中％VT				90.00
馏分A中％VT	35.00	63.00	-	98.00
					馏分B中％VT	-	-	51.00	51.00

结论

因为馏分A和馏分B各自都有50wt％以上由式(I)化合物组成，所以馏分A和馏分B均构成了特别富集有式(I)化合物的提取物，这构成了本发明的主题。

还可以将这2个馏分组合成单一馏分(A+B)，这也构成了本发明的特别富集的提取物的实例。这一组合可以得到含有所鉴定出的全部3种化合物(VT1、VT2和VT3)的提取物，该整体在所述干燥提取物中占90wt％的含量。

因此，这些提取物的每一种都可在化妆品组合物或皮肤病学组合物中用作化妆品活性剂或皮肤病学活性剂。

实施例3：式(I)化合物的结构解析

对提取自兰科植物凤蝶兰PM(实施例1.2)、然后通过尺寸分馏和RP-HPLC进行分离的式(I)化合物进行结构解析需要汇集许多光谱技术。

·材料

质谱法(MS)

将角质再生素在Agilent 1200RRLC上用高效液相色谱法进行分析，所述Agilent 1200RRLC装备有Supelco Discovery C₁₈柱(25cm×2.1mmi.d.×5μm)、并与装备有ESI源的Agilent 6520Accurate Mass QTOF质谱仪相连。

洗脱条件需要如下条件下的乙腈(ACN)-(水+0.01％HCO₂H)混合物：以0.6mL/min的流速，在30分钟的过程中从2％ACN变为50％ACN，然后在5分钟的过程中变成95％ACN，在95％ACN保持5分钟，然后在5分钟的过程中变回到2％ACN。

此外，在具有ESI正离子源的Bruker microToF-Q光谱仪上获得ESIMS高分辨率质谱。使用10^-4M处于异丙醇/水混合物(50/50v/v)中的甲酸锂溶液进行校准。

核磁共振(NMR)

NMR分析在Bruker 400MHz Avance III光谱仪上进行。为了对所分离出的分子进行完整的结构解析，必须得到¹D(¹H和¹³C)和²D(Cosy、HSQC和HMBC)谱。将这些谱在NMR Notebook软件上进行分析。

将最小量的10mg纯化分子稀释到600μl氘代DMSO中(DMSO D₆，C₂D₆OS；99.9％D，Sigma)。由此获得的最小浓度在16mg/ml左右。

紫外(UV)光谱测定法：

角质再生素的UV谱特性使用Shimazu UV-2401PC装置获得。将分子VT1以5×10^-5M、VT2和VT3以2.5×10^-5M溶于MeOH中。根据比尔-朗伯定律测定摩尔消光系数ξ(mol^-1·L·cm^-1)：

A＝ξ×c×1

A＝分子在波长λ下的吸光度

C＝分子的浓度(以mol/L计)

1＝光程的长度(以cm计)

偏振测定法

在Perkin Elmer 341旋光仪上对角质再生素不对称碳原子的偏振光比旋光度[α]进行测定。将分子以1mg/mL在甲醇中保持溶液状态，然后放入旋光仪的测量池中，从而在20℃下、于589nm处对偏振光的旋转角度进行测量。由此，根据Biot’s定律对每个分子的[α]^20°进行测定：

α＝[α]^T°×1×c

a＝观察到的旋转角度(以度计)

1＝比色皿的光径(以dm计)

c＝溶液的浓度(以g/mL计)

[α]^T°＝规定温度T下测量出的给定波长的比旋光度(以g^-1·mL·dm^-1表示)

结构解析结果

所获得的VT1、VT2和VT3化合物各自的NMR谱数据显示在下表3中：

表3

表3：所获得的VT1、VT2和VT3化合物各自的NMR谱(¹H：400MHz，¹³C：100 MHz，DMSO D₆，δ以ppm计，J以Hz计)

下面对使用各种分析方法获得的各个化合物的结果进行详细介绍。

·VT1

外观：黄色树脂状

溶解度：溶于MeOH和DMSO，水溶性低

NMR：¹H NMR和¹³C NMR数据(DMSO D₆，400MHz和100MHz)

→图3-图4和表3。

MS：HR-ESI-MS离子[(M+NH₄)]⁺，m/z＝526.19236(分子式C₂₄H₂₈O₁₂的计算值：508.15808Δ：-0.89ppm)→图2和表4

表4

峰列表

分子式计算结果

分子式

Best

质量

Tgt质量

Diff(ppm)

离子种类

得分

C24H28O12

TRUE

508.15853

508.15808

-0.89

C24H32NO12

95.88

UV：最大吸收位于203(logξ4.2)nm、225(logξ4.0)nm和278(logξ3.2)nm处。→图5

[α]_MeOH ^20°＝-50g^-1·mL·dm^-1

酸水解

在将分子酸水解(80℃下进行3h，2.0M HCl存在的情况下)后，将水相用水饱和的正丁醇洗涤三次，然后蒸发至干。向干燥残余物中加入吡啶和1-(三甲基硅烷基)咪唑(Sigma)的混合物(1∶4，v/v)，然后在60℃下加热1小时进行衍生作用。然后，将1-2μl的反应混合物用500μl分析CH₂Cl₂进行稀释，再使用气相色谱仪(Trace GS Ultra型)进行分析，所述气相色谱仪装备有TR-5MS SQC毛细管柱(15m×0.25mm×0.25μm)，并与质谱(Thermo Scientific DSQII)相连。通过70eV下的电子碰撞进行检测。使用的条件如下：40℃下保持1分钟，然后以10℃/min的梯度升至250℃，并维持250℃下的稳定期(氦气流速1ml/min，进样温度250℃，传输线温度285℃)。检测在分析2分钟后进行，质量测量间隔的范围为0-500。

通过与经过同样衍生处理的D-葡萄糖对照(Merck)的保留时间(Tr＝15.60分钟)和质谱进行比较，对酸水解结束时释放的糖进行鉴定。对于所分析的3种角质再生素而言，水解后所鉴定的糖为D-葡萄糖。

·VT2

外观：无定形白色粉末

溶解度：在水中以约10mM形成凝胶。VT2溶于MeOH和DMSO，水溶性低。

NMR：¹H NMR和¹³C NMR数据(DMSO D₆，400MHz和100MHz)

→图3-图4和表3。

MS：HR-ESI-MS离子[(M+NH₄)]⁺，m/z＝794.28867(分子式C₃₇H₄₄O₁₈的计算值：776.25276Δ：-0.01ppm)。→图2和表5

表5

峰列表

分子式计算结果

分子式

Best

质量

Tgt质量

Diff(ppm)

离子种类

得分

C37H44O18

TRUE

776.25277

776.25276

-0.01

C37H44NaO18

98.6

UV：最大吸收位于203(logξ4.50)nm、225(logξ4.5)nm和278(logξ3.5)nm处。→图5

[α]_MeOH ^20°＝-56g^-1·mL·dm^-1

酸水解：参见VT1

·VT3

外观：黄色树脂状

溶解度：该化合物溶于MeOH和DMSO，水溶性低。

NMR：¹H NMR和¹³C NMR数据(DMSO D₆，400MHz和100MHz)

→图3-图4和表3。

MS：HR-ESI-MS离子[(M+NH₄)]⁺，m/z＝1086.38484(分子式C₅₂H₆₀O₂₄的计算值：1068.34745Δ：-1.89ppm)。→图2和表6

表6

峰列表

公子式计算结果

分子式

Best

质量

Tgt质量

Diff(ppm)

离子种类

得分

C52H60O24

TRUE

1068.34948

1068.34745

-1.89

C52H60NaO24

96.2

UV：观察到的最大吸收位于223(logξ4.5)nm和276(logξ3.5)nm处→图5

[α]_MeOH ^20°＝-37g^-1·mL·dm^-1

酸水解：参见VT1

实施例4：本发明化合物的生物活性

处理

在DMSO(Sigma)中，制备此前所分离的3种化合物VT1、VT2和VT3各自的原液(stock solution)。

然后将上述原液直接在培养基中稀释，用于对细胞(正常人角质细胞NHK或HaCaT细胞系)进行处理。

·对角质细胞上的线粒体脱氢酶的刺激

在补充有5％胎牛血清(FCS，Invitrogen)的补充(Invitrogen)角质形成细胞无血清培养基(KSFM，Invitrogen)中，将从37岁白种人女性的眼睑中分离的正常人角质细胞(NHK)培养3代。

将NHK以1×10⁴细胞/孔的比例接种至96孔板(Greiner Bio One)中，然后在37℃、5％CO₂下孵育24h。然后，在UV_B照射(60mJ/cm²Vilbert-Lourmat照射器)后或不进行照射的情况下，用在DMSO(sigma)中连续稀释的VT1、VT2和VT3化合物(6.25-0.78μg/mL)对这些细胞进行处理，DMSO终浓度为0.1％v/v。在37℃、5％CO₂下对板进行孵育。将含有0.1％v/v DMSO的未处理细胞作为阴性对照。处理48h后，除去上清液，并在每个孔中放入XTT溶液(细胞增殖试剂盒II，RocheDiagnostic)，从而测定线粒体脱氢酶的总体活性。通过由细胞机制将XTT四唑盐转化成可溶性甲

来对这一活性进行评价，所述细胞机制需要糖酵解NAD(P)H脱氢酶(复合物I)和琥珀酸脱氢酶(复合物II)的酶活性，所述糖酵解NAD(P)H脱氢酶和琥珀酸脱氢酶是线粒体呼吸链的构成成分。有颜色的甲

的量(通过读取450nm下的光密度进行测定)首先与线粒体脱氢酶的酶活性直接相关，其次与代谢活性细胞的量直接相关(Roehm等J.Immunol.Methods，1991；142：257-265)。孵育3小时后，XTT被脱氢酶还原成可溶性甲

用荧光分光计(SpectraFluor Plus，Tecan)在450nm下对96孔板进行读取。通过BCA技术(二喹啉甲酸分析(Uptima Interchim试剂盒))测定每个孔中的总蛋白。

所得结果用450nm下的光密度(OD)的平均值来表示，并相对于细胞蛋白总浓度(用μg/mL表示)来进行标准化，这样可以只测量脱氢酶的活性并消除细胞增殖对测量得到的OD的影响。

将分子的每个浓度所得的平均结果(Rm)与阴性对照所得的结果(Rc)进行比较：

Rm/Rc＞1表明刺激线粒体脱氢酶活性。

·对修饰的人角质细胞(HaCaT)上的细胞色素C氧化酶的刺激

本研究的目标是评价本发明主题化合物刺激线粒体呼吸链性能水平的潜力。该分析在基因修饰的人角质细胞(HaCaT)上进行。

用w/o HEPES(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Roswell ParkMemorial Institute)将HaCaT细胞在6孔板中培养直至汇合，所述RPMI1640培养基补充有10％胎牛血清(FCS，Invitrogen)和青霉素/链霉素混合物。然后在含有4.5g/L葡萄糖、0.1％BSA(牛血清白蛋白AM2618，Invitrogen)的DMEM(Dulbecco’s改良伊格尔培养基，Invitrogen)中，用在DMSO(终浓度0.1％v/v)中连续稀释的角质再生素(6.25-0.78μg/mL)对上述板进行处理。将50μM(即11.41μg/mL)的白藜芦醇(Sigma)用作阳性对照。将含有0.1％v/v DMSO的未经处理的细胞作为阴性对照。处理3h后，将细胞进行裂解(20mM HEPES，0.1％Triton，1mM EDTA)，并通过Bradford技术(B6916 Sigma)对总细胞蛋白进行测定。然后，将每个样品的总蛋白浓度调整至2mg/mL。

将细胞裂解液在有分析缓冲液(Sigma)存在的情况下进行孵育，从而在不添加底物的情况下测定酶动力学，记录Vo。将被DTT(二硫苏糖醇，Sigma)还原的细胞色素C(来自于马心C-7752Sigma)加入到50M所述缓冲液中，从而测量酶反应的速率。在550nm处，使用分光光度计(Beckman DU 640)根据厂商(Sigma)的说明对还原的细胞色素C的消失监测90秒。所得结果由酶动力学曲线进行计算并用细胞色素C氧化酶活性(U/μg蛋白)来表示。

计算酶活性的方程如下：

-细胞色素C的酶活性(以U/mL计)＝A_COX＝(DA/min)/21.84

其中：

-DA/min＝A/min(v)-A/min(v0)

-21.84(mM)＝550nm处亚铁细胞色素的ε(摩尔消光系数)

-A＝550nm处的吸光度

-A/min(v)＝时间为“v”分钟时在550nm处的吸光度，该时间对应于添加底物后测量的时间。

-A/min(v0)＝时间为“v0”分钟时在550nm处的吸光度(起始时，即添加底物之前)。

结果由角质再生素存在下测量的酶活性(A_COX样品)与对照酶活性(A_COX对照)的比来表示：即(A_COX样品)/(A_COX对照)。

计算出的(A_COX样品)/(A_COX对照)比值大于1表明样品存在的情况下对细胞色素C氧化酶活性的刺激作用。

·对修饰的人角质细胞(HaCaT)上线粒体生物合成的测量

对于显示出对细胞色素C的活性具有刺激作用的VT1和VT2，进行线粒体生物合成的测量。

目的是验证测量到的酶活性增加究竟是与最初存在的线粒体呼吸链的基础刺激(basal stimulation)相关联，还是与细胞内线粒体的数目增加(这表明刺激线粒体生物合成)相关联。

将HaCaT细胞在6孔板中进行培养，然后进行上述处理。处理48h后，用由10mM Tris碱、1mM EDTA、0.3M醋酸钠和1％SDS(1mL/孔)组成的缓冲液，并在55℃下过夜孵育来对所述细胞进行裂解。用酚溶液(1/1的比例)从细胞裂解液中对线粒体DNA进行萃取。将4000rpm的离心(5分钟)进行2个周期。然后将CHCl₃/异戊醇(24∶1，v/v)的溶液加入到上层水相中，并在沉降分离后进行回收。然后将所得混合物进行离心(5分钟，4000rpm，4℃)。

通过向上清液中加入无水乙醇/3M醋酸钠混合物(2.5/1.10^e，v/v)引起总DNA的析出。在离心(30分钟，12000rpm，4℃)后，将沉淀用70°v/v EtOH进行洗涤，然后干燥并放置于去离子水中。使用光谱仪(Thermo Scientific Nanodrop)对DNA进行测定。将DNA溶液调整至10ng/μl的浓度。

用qPCR对3种不同基因的表达进行测量。这一技术可以通过荧光标记来测量聚合的DNA的量。所选择的基因为2个线粒体基因16S和COX2(分别对应于用于表达线粒体核糖体和细胞色素C氧化酶的基因)、以及位于细胞核(基因组DNA)的基因UCP-2。测量这一基因的表达作为对照。

所用的引物如下：

16S DNA：正义(5′-TGG-ACA-ACC-AGC-TAT-CAC-CA-3′)和反义(5′-ACT-TTG-CAA-GGA-GAG-CCA-AA-3′)；

COX-2DNA：正义(5′-AGG-CGA-CCT-GCG-ACT-CCT-TGA-3′)和反义(5′-TTA-GCT-TTA-CAG-TGG-GCT-CTA-GAG-GC-3′)；

UCP-2DNA：正义(5′-CCT-AGC-GCT-GCC-TCA-TAA-AC-3′)和反义(5′-CCT-ATG-GGT-CTG-TGC-CTG-TT-3′)。

qPCR实验在96孔板中进行。对于每个引物，按照连续稀释制备对应于所有样品DNA混合物的一系列DNA。将细胞DNA样品与MIX-PCRSYBR Green(Applied Biosystems)的混合物进行混合，向其中加入去离子水。在60℃的杂交温度下进行45轮PCR循环(StepOnePlusThermocycler，Applied Biosystems)。

45轮循环后对荧光进行测量，并通过DNA范围对所得DNA的量进行测定。

所得结果用16S DNA和COX2(Q_COX2)DNA的量表示，该结果根据UCP-2基因组DNA(Q_UCP-2)的量计算，被定义为(Q_COX2)/(Q_UCP-2)。

计算出的(Q_COX2)/(Q_UCP-2)比值大于1表明线粒体DNA的量增加，并且反映出细胞内线粒体的数目增加。

结果

处理48h后的述XTT测量显示出，所测试的化合物显著刺激角质细胞的线粒体呼吸功能。然而，没有观察到显著的剂量效应。

此外，在对角质细胞进行UV_B照射后，没有观察到对脱氢酶的显著刺激。

VT1和VT2化合物是最有效地刺激角质细胞线粒体脱氢酶活性的化合物。

尤其是，VT2化合物以最低的测试浓度0.78μg/mL(即1μM)显著地刺激脱氢酶的活性(相对于阴性对照为+39％)(图6)。

所测试的3种化合物以比白藜芦醇(阳性对照)更低的浓度水平使细胞色素C氧化酶活化，其中VT2化合物为最好的细胞色素C氧化酶活性剂。浓度1.56μg/mL(2μM)的VT2以与浓度11.41μg/mL(50μM)的白藜芦醇相当的活性水平刺激细胞色素C氧化酶活性(图7)。

只观察到VT1化合物的剂量效应。

对于VT1和VT2进行线粒体生物合成测量，从而确定所测定的酶活性增加究竟是与最初存在的线粒体呼吸链的基础刺激相关联，还是与细胞内线粒体的数目增加相关联。

结果表明：在所测试的浓度下，除6.25μg/mL VT1外，2种化合物都没有引起线粒体生物合成的活化，因此也没有引起细胞内的线粒体数目的增加。

因此，得到的结果表明线粒体细胞色素C氧化酶或脱氢酶的酶活性增加，从而反映出这些酶活性的基础刺激，而非细胞内线粒体数目增加。

VT1和VT2显示出对线粒体活化的最佳潜力，所述线粒体活化是通过对脱氢酶复合物I和复合物II的酶活性的刺激作用、以及经由对线粒体呼吸链的细胞色素C氧化酶的刺激作用而进行。

因此，通过对角质细胞线粒体呼吸链的复合物I和复合物II的刺激作用、以及对细胞色素C氧化酶活性的刺激作用，VT1以及尤其是VT2化合物各自都显示出对角质细胞线粒体呼吸链的显著活性。这证实了它们通过皮肤细胞的线粒体呼吸功能来使皮肤细胞的能量代谢活化。

这一活性证明，将本发明化合物(尤其是VT1和/或VT2)用作化妆品活性剂或皮肤病学活性剂、尤其是用于成熟皮肤的化妆品处理或皮肤病学处理的活性剂是合理的，所述处理例如对抗皮肤老化、和/或维持或改善皮肤保湿和/或皮肤愈合。

·对正常人角质细胞(NHK)分化的刺激

桥粒芯糖蛋白为钙粘素(跨膜蛋白)，通过形成桥粒使上皮细胞(例如角质细胞)彼此相连。正如兜甲蛋白(loricrin)一样，外皮蛋白是由到达终末分化阶段的角质层的构成性角质细胞(constituent keratinocytes)所表达的蛋白。这些角质细胞被称为角化细胞(corneocytes)。作为Ca2+依赖酶的转谷氨酰胺酶实现这些蛋白间共价点的形成。因此，这3种蛋白构成了角质细胞的早期分化(桥粒芯糖蛋白I)和后期分化(外皮蛋白和转谷氨酰胺酶)的标志。在皮肤老化期间，观察到角质细胞更新、角质细胞活性以及角质细胞向角化细胞转变的减慢。观察到表皮萎缩。皮肤失水，然后表皮的保护功能和愈合功能减慢。接下来，皮肤呈现无生气且干燥的外观。

方法

在处于T75烧瓶中的完全KSFM培养基中，将NHK培养3代。在汇合前阶段，将NHK进行胰酶消化，然后以20000细胞/孔的比例接种至8孔Lab-Tek II培养体系(Nalge Nunc International)，每个处理条件设4个孔。在80％汇合时，将细胞用活性剂的各种组成(VT1、VT2、VT3，每种12μg/mL)处理5天，直至到达汇合后阶段。将3％的

clair(锦葵提取物，Silab)作为阳性对照。

免疫标记

将细胞用PBS(PBS Tablets，Invitrogen GIBCO)进行清洗，然后用福尔马林(甲醛溶液，10％，中性缓冲，Sigma)固定10分钟。

用PBS清洗后，将培养室装满0.1％Triton溶液(Triton X-100，Sigma)10分钟以使膜透化(permeabilized)，再用PBS清洗两次。然后，在室温下将细胞用PBS/1％BSA(BSA，Sigma)覆盖30分钟。通过在吸水纸上倾斜载玻片将PBS/BSA溶液从载玻片除去。

然后，在室温下将细胞用一抗溶液覆盖60分钟：

-1/200稀释的抗-转谷氨酰胺酶(小鼠单克隆，Harbor Bio产品)；

-1/100稀释的抗-桥粒芯糖蛋白1(小鼠单克隆-Zymed)；

-1/200稀释的抗-外皮蛋白(小鼠单克隆-Neomarkers)。

用PBS清洗后，再将细胞用1/200稀释的二抗溶液(Alexa fluor 488，山羊抗小鼠IgG(Molecular probes))覆盖。将载玻片在室温下避光孵育60分钟。在PBS中将载玻片清洗3次。

封固(Mounting)

将载玻片的培养室取下，并在细胞上滴几滴封固剂(荧光封固剂，DAKO)，然后盖上盖玻片(24×60mm，Knittel Glaeser)。

共聚焦显微镜照片的采集

用带有Alexa fluor 488滤镜的视频显微镜(Nikon TE 2000)拍摄图像。

对于每种条件，用×20物镜于绿色荧光(标志的表达)中拍摄4张照片。所研究的每个标志的采集参数(曝光时间、增益)相同。

使用Leica QWin图像分析软件对照片进行分析。建立程序以便对这些分化标志的表达进行定量。

结果

所得结果显示出：与阴性对照相比，本发明的化合物显著地刺激角质细胞分化蛋白表达。

在所测试的化合物中，VT1和VT2最有效(图8-图13)。此外，VT2以高于在3％下使用的阳性对照的水平来刺激外皮蛋白的表达。

这表明角质再生素(尤其是VT1和VT2)刺激表皮上层的构成性角质细胞的更新。

角质再生素促进角化层(stratum corneum)的更新，从而给予皮肤更年轻的外观。这一现象有助于维持表皮的保护功能和修复功能，同时维持或改善皮肤保湿。

Claims

1.一种式（I）化合物，

其中：

R₁和R₃各自独立地表示氢原子或者饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链，所述烃基链包含芳基、优选苯基，所述芳基优选被含糖、优选含单糖或二糖的基团取代，所述链还任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子；R₂表示氢原子或糖、优选单糖或二糖，所述糖任选被取代、特别是被包含饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链残基取代，所述烃基链本身含有芳基、优选苯基，所述烃基链还任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子；但R₁、R₂和R₃不同时为氢原子。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₁和/或R₃表示被OR₄基团取代、优选在对位取代的苄基，其中基团R₄表示选自如下基团的基团：（i）氢原子或烷基基团，所述烷基基团包含直链或支链、和/或环状的、芳香族或非芳香族的、饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链，所述烃基链任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子，所述烃基链本身未被取代或优选被含糖、优选含单糖或二糖的基团取代；以及（ii）糖的残基、优选单糖或二糖的残基，所述的糖任选被尤其是包含直链或支链、和/或环状的、芳香族或非芳香族的、饱和或不饱和的、取代或未被取代的、优选C₁-C₁₂的烃基链残基取代，所述烃基链本身任选包含一个或多个优选选自O、S和N的杂原子。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R₁和R₃相同或不同，并且表示氢原子或优选被吡喃葡萄糖基氧基基团取代的苄基基团、例如4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基基团；R₂表示吡喃葡萄糖基基团、例如β-D-吡喃葡萄糖基基团，该基团优选被取代、尤其是通过羟基官能团的酯化作用被饱和或不饱和的、优选C₁-C₁₂的烃基链取代，所述烃基链本身包含芳基、优选苯基，R₂尤其表示β-D-吡喃葡萄糖基-3-反式肉桂酰酯基团；R₁、R₂和R₃不同时为氢原子。

4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其特征在于，R₁和/或R₃相同或不同，并表示被OR₄基团取代的苄基，R₄表示被任选取代的吡喃葡萄糖基基团。

5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R₁和R₃相同，且各自表示4′-(吡喃葡萄糖基氧基)苄基基团。

6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其特征在于，位于式（I）苹果酸根部分的2位的不对称碳原子以R对映异构体构象存在。

7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物由下式所示：

8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，VT1为4-(4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基)-(2R)-2-(对羟基苄基)苹果酸酯。

9.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物由下式所示：

10.如权利要求9所述的化合物，其特征在于，VT2为1,4-双(4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基)-(2R)-2-(对羟基苄基)苹果酸酯。

11.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物由下式所示：

12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，VT3为1,4-双(4-β-D-吡喃葡萄糖基氧基苄基)-(2R)-2-(2-β-D-吡喃葡萄糖基-3-反式肉桂酰酯)-2-(对羟基苄基)苹果酸酯。

13.一种植物提取物，其特征在于，所述植物提取物特别地富集有权利要求1-12中任一项所定义的式（I）化合物中的一种或多种。

14.如权利要求14所述的提取物，其特征在于，所述提取物从兰科植物的至少一个部分中获得，所述兰科植物尤其是属于凤蝶兰属（Papilionanthe）、万带兰属（Vanda）或围柱兰属（Encyclia）的兰科植物。

15.如权利要求13-14中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物从兰科植物凤蝶兰、尤其是从所述兰科植物的茎、根、花或叶中获得，并且所述提取物包含权利要求7-12中任一项所述的至少一种式（I）化合物。

16.如权利要求15所述的提取物，其特征在于，所述提取物通过去除糖或通过分馏法进行富集。

17.如权利要求15或16所述的提取物，其特征在于，相对于干燥提取物的总重量，所述提取物含有至少40wt%的式（I）化合物。

18.如权利要求15-17中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物含有一种或多种选自VT1和/或VT2的化合物，所述化合物的累计含量相对于干燥提取物的重量大于40wt%、优选大于60wt%、并且更优选大于80wt%。

19.如权利要求15-18中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物含有VT3化合物，所述化合物的含量相对于干燥提取物的重量大于8wt%、优选大于15wt%。

20.如权利要求15-19中任一项所述的提取物，其特征在于，相对于干燥提取物总重量，所述提取物的至少80wt%、优选至少90wt%由VT1、VT2和VT3化合物组成。

21.如权利要求13-20中任一项所述的提取物，其特征在于，由兰科植物凤蝶兰的茎或根制备所述提取物。

22.一种化妆品组合物或皮肤病学组合物，所述化妆品组合物或皮肤病学组合物含有至少一种如权利要求1-12中任一项所定义的式（I）化合物、和/或至少一种如权利要求13-21中任一项所述的植物提取物作为化妆品活性剂或皮肤病学活性剂。

23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有一种或多种其他化妆品活性剂或皮肤病学活性剂，所述其他化妆品活性剂或皮肤病学活性剂选自例如如下物质：具有抗老化活性的物质；对于皮肤具有褪色活性或美白活性的物质；具有减肥活性的物质；具有保湿活性的物质；具有镇静、舒缓或放松活性的物质；刺激皮肤微循环从而改善肤色光彩、尤其是面部光彩的物质；用于油腻皮肤护理、具有皮脂调节活性的物质；用来清洁或净化皮肤的物质；以及具有自由基清除活性的物质；

所述组合物还含有至少一种在化妆品方面或皮肤病学上可接受的赋形剂，所述赋形剂尤其可选自颜料、着色剂、聚合物、表面活性剂、流变剂、香料、电解质、pH调节剂、抗氧化剂和防腐剂、以及它们的混合物。

24.如权利要求22或23所述的组合物，其特征在于，所述组合物有利地为精华、化妆水、霜剂或水凝胶、尤其是面膜状形式，或为棒或贴剂的形式。

25.至少一种如权利要求1-12中任一项所定义的式（I）化合物和/或至少一种如权利要求13-21中任一项所定义的植物提取物在化妆品组合物或皮肤病学组合物中作为化妆品活性剂或皮肤病学活性剂的用途，所述活性剂用来实现如下作用：对抗皮肤老化，尤其是减少或推迟皮肤老化的影响、重建表皮、紧致肌肤、和/或促进皱纹的减少或再吸收以及表皮的防护性能；和/或维持或改善皮肤保湿和/或帮助皮肤愈合。

26.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述活性剂刺激线粒体脱氢酶、和/或细胞色素C氧化酶、和/或线粒体呼吸链的表达和/或活性；和/或刺激细胞能量代谢；和/或刺激上皮细胞的分化和更新。

27.如权利要求25或26所述的用途，其特征在于，所述活性剂作用于表皮水平、尤其是上皮细胞水平、更尤其是角质细胞水平。

28.如权利要求25-27中任一项所述的用途，其特征在于，在化妆品组合物或皮肤病学组合物中，相对于所述组合物的重量，作为化妆品活性剂或皮肤病学活性剂的所述化合物或所述提取物的浓度为0.0001wt%-1wt%、更尤其为0.001wt%-0.1wt%、更优选为0.01wt%-0.1wt%。

29.一种化妆用护理方法或皮肤病学护理方法，其特征在于，所述护理方法包含以有效量将权利要求22-24中任一项所定义的化妆品组合物或皮肤病学组合物施用至所涉及的皮肤区域，所施用的量对于下述作用有效：对抗皮肤老化，尤其是减少或推迟皮肤老化的影响、重建表皮、紧致肌肤、促进皱纹的减少或再吸收以及表皮的防护性能；和/或维持或改善皮肤保湿和/或促进皮肤愈合。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述组合物施用至显示出老化迹象的面部、颈部或身体、尤其是手部的皮肤区域，所述老化迹象例如存在皱纹或细纹。

31.一种制备如权利要求1-12中任一项所定义的式（I）化合物或如权利要求13-21中任一项所定义的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括：对含有此类化合物的植物、尤其是兰科植物凤蝶兰的至少一个部分进行提取的步骤；以及至少一个对提取步骤中得到的提取物在一种或多种式（I）化合物方面进行富集的步骤。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述提取使用至少一种极性溶剂或极性溶剂混合物进行，所述极性溶剂优选为：水；C₁-C₄醇，尤其是甲醇、乙醇或丙醇；多元醇，尤其是乙二醇、以及例如甘油、丙二醇或丁二醇；水-醇混合物，优选乙醇/水混合物、更尤其是比例为约90/10v/v的乙醇/水混合物。

33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述富集步骤通过去除糖或通过分馏法、尤其通过尺寸排阻色谱法进行。