CN105188711B - 含有人参皂苷rh4的皮肤外用剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有人参皂苷Rh4的皮肤外用剂组合物。更具体地，涉及一种含有人参皂苷Rh4且通过优异的抗氧化力而能够提供皮肤老化防止效果、皮肤保湿力改善效果、抗炎效果及痤疮等皮肤问题的改善效果、美白效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果及通过血循环改善的脸色改善等的整体皮肤状态的改善效果的组合物，所述组合物除了上述效果外，还能够提供防止头皮屑的效果、毛发生长效果及防止白发效果等的头皮及毛发状态改善效果。

Description

含有人参皂苷RH4的皮肤外用剂组合物
技术领域
本发明涉及一种含有人参皂苷Rh4的皮肤外用剂组合物。更具体地，涉及一种含有人参皂苷Rh4且通过优异的抗氧化力而能够提供皮肤老化防止效果、皮肤保湿力改善效果、抗炎效果及痤疮等皮肤问题的改善效果，美白效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果及通过血循环改善的脸色改善等的整体皮肤状态的改善效果的组合物，所述组合物除了上述效果外，还能够提供防止头皮屑的效果、毛发生长效果及防止白发的效果等的头皮及毛发状态改善效果。
背景技术
皮肤作为人体的第一道防御屏障，具有使得体内器官免受温度及湿度变化和紫外线、公害物质等外部环境的刺激而保护体内器官的功能。随着年龄的增长，皮肤将由于多种内在、外在因素而发生变化。即，从内在方面来说，由于调节新陈代谢的各种激素分泌减少，并且免疫细胞的功能和细胞活性降低，因此人体所需的免疫蛋白及生物体组成蛋白的生物合成减少。从外在方面来说，由于臭氧层的破坏，从太阳光线中到达地表的紫外线含量增加，并随着环境污染的深化，自由基及活性氧增加，不仅使得皮肤的厚度减小、皱纹增加、弹力减小，而且使皮肤气色变暗，皮肤经常发生问题(trouble)，还会增加痣和雀斑及老年斑，并且引起气色变差、肤色变暗等各种变化。
为了防止这些由于皮肤内在及外在因素而发生的皮肤状态变化，并维持健康的皮肤状态，人们一直努力通过将从现有的各种动物、植物、微生物等中获得的生理活性物质添加到化妆品中并进行使用来改善皮肤状态。尤其，已经实现了多个对于利用人参(Panaxginseng C.A Meyer)成分的化妆品的研究开发。人参对皮肤的功效早已被证实，因此一直广泛使用在化妆品组合物中，使用了人参的根或叶的提取物、人参皂苷(ginsenoside)、人参苷元(aglycon)及人参多糖体。然而，由于这种含有人参提取物、榨出物及多糖体等的化妆品含有极微量的该活性物质，因此与其它原料相比，存在其效果不明显的缺点。
发明内容
要解决的技术问题
对此，本发明人发现人参中含有的人参皂苷Rh4不仅能够提供抗老化、皮肤皱纹改善、美白及保湿改善效果，还能够提供痤疮及皮肤问题的改善效果，并能够提供皮肤气色改善效果、皮脂调节及毛孔收缩效果等的皮肤状态的改善效果，并且能够提供防止头皮屑、毛发生长及防止白发等的头皮及毛发状态的改善效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种皮肤外用剂组合物，所述组合物含有人参皂苷Rh4，从而能够改善皮肤的整体状态。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于抗老化的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于美白的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于保湿的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于改善痤疮的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于改善气色及肤色的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于收缩毛孔的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于调节皮脂的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于防止头皮屑的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于毛发生长的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rh4作为有效成分的用于防止白发的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种将人参皂苷Rh4作为天然防腐剂来使用的皮肤外用剂组合物。
有益效果
本发明的组合物含有人参皂苷Rh4且通过优异的抗氧化力而能够提供皮肤老化防止效果、皮肤保湿力改善效果、抗炎效果及痤疮等的皮肤问题的改善效果、美白效果、皮脂调节效果、毛孔收缩效果及通过血循环改善的脸色改善等的整体皮肤状态的改善效果的组合物，所述组合物除了上述效果外，还能够提供防止头皮屑的效果、毛发生长效果及防止白发的效果等的头皮及毛发状态改善效果。
最佳实施方式
根据本发明的皮肤外用剂组合物含有人参皂苷Rh4作为有效成分。
本发明中使用的人参皂苷Rh4具有下述化学式1的结构。
[化学式1]
人参属于五加科(Araliace)人参属，是多年生半阴性宿根草，并且是草本植物。在韩国、中国、日本及美国等世界各地生产，在东亚，主要在东经85-140度、北纬22-49度进行栽培，在北美洲，主要在西经70-97度、北纬34-47度进行栽培。如此地，在世界各地生产的人参在成分上具有差异，在显示出人参的各种生理学、药理学的功效方面最重要的被称为人参皂苷的皂素(saponin)在韩国产人参中包含得最多。目前为止，分离出约34种人参皂苷，根据结合于苷元的糖的种类或结合的糖类的数量或结合位置，其药理功效分别不同。根据结构特性分为二醇类、三醇类及齐墩果烷类(oleanane)。除此之外，还含有作为人参固有的香味成分的人参烯(panacen)、聚乙炔类化合物、多元酚类化合物、黄酮及维生素等。
自古以来，人参的功效在中医方面已被认定，并用于多种疾病的治疗中。人参在中医方面的功效已知有增强体力、改善新陈代谢、缓解压力、糖尿病的治疗、呼吸道疾病的改善、消化器官的改善及抗癌作用，并且在最新研究中有报道称人参具有抗补体活性、抗溃疡作用、增强免疫、抗癌作用及降低血糖的作用。对于与皮肤相关的功效，研究发表有消炎作用(Korean J.Dermatol.18(1):39-42(1980),Korean J.Dermatol.14(4):335-339(1976))、防止过度角化(Korean J.Dermatol.28(4):434-440(1990))、预防及治疗痤疮(Korean J.Dermatol.30(1):27-33(1992),Korean J.Dermatol.28(4):434-440(1990))、抗氧化效果(Proceedings of the 2nd international ginseng symposium 13-17(1978))、弹性及水合性的增加(Fitoterapia 57(1):15-28(1986),Fitoterapia 57(4)217-222(1986))、伤口愈合(Brit.J.Pharmacol.125:255-262(1998),Arch.pharm.res.25(1):71-76(2002))、抑制胶原蛋白分解(Mol.Cells 9(5):476-483(1999))及美白效果(Journal of the society of cosmetic scientists of korea 27(2):45-56(2001))等。
本发明的人参皂苷Rh4可以从植物中提取，也可以通过本领域中公知的方法合成并使用，也可以使用商业性销售的人参皂苷Rh4。另外，对所述人参皂苷Rh4进行本领域中常规实施的取代基的合成或取代反应而得到的衍生物中，将显示出皮肤、毛发改善效果及防腐效果的衍生物也包含在本发明的范围中对本领域技术人员来说，从本领域的技术水平方面考虑是明确的。
本发明中使用的人参皂苷Rh4，尤其可以从人参提取物中获得。这时使用的人参的种类不受特别限定，可以使用水参、红参、白参、太极参及尾参等。并且，所述人参提取物不仅包含由人参浸提、煎提而得到的浸出液，还包含对浸出液的部分或整体再进行浓缩而得到的浓缩物，或者对所述浓缩液再次干燥而制备的浸渍体、煎剂(、片剂流动榨取物，以及包含在人参中而发挥主要效果的化学物质，而且还包含植物本身，并且可使用茎、根、叶、花及果实等人参的整个部分的提取物，并不限定于某一特定部分的提取物。另外，从人参提取物中提取人参皂苷Rh4的方法可以使用公知的方法。
具体地，所述人参皂苷Rh4可以通过本领域中已知的方法，使用水或有机溶剂来制备人参提取物后，从中分离而得到。本发明中使用的有机溶剂可以选自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯、氯仿及这些有机溶剂和水的混合溶剂，优选使用80％的乙醇。这时，提取温度优选为10～80℃，并且可以提取3～24小时。如果超出所述提取温度及提取时间的范围，则提取效率会降低，或者会发生成分的变化。
根据本发明的组合物，以组合物总重量计，可以含有0.001至50重量％的人参皂苷Rh4，优选含有0.001至30重量％，更优选含有0.1至10重量％。这是因为如果所述人参皂苷Rh4的含量少于0.001重量％，则由所述成分带来的功效及效果微弱，如果超过50重量％，则会存在皮肤安全性或剂型上的问题。
人参皂苷Rh4为具有优异的抗氧化力的成分，因此含有人参皂苷Rh4的本发明的组合物通过提供优异的抗氧化力而可以用作用于抗老化的皮肤外用剂组合物，其在增强皮肤弹力、改善皱纹方面效果优异。
本发明的组合物可以作为用于美白的组合物来使用，其通过阻碍酪氨酸酶的活性，抑制黑色素的生成，从而能够提供优异的美白效果。
本发明的组合物可以作为用于保湿的皮肤外用剂组合物来使用，其能够强化皮肤屏障功能，并能够诱导皮肤角质形成细胞的分化。因此，可以有效地用作预防或改善因表皮没有完全分化而导致的皮肤干燥症、接触性皮肤炎或牛皮癣等的皮肤外用剂组合物。
本发明的组合物可以作为用于改善痤疮的皮肤外用剂组合物来使用，其抗菌效果优异，尤其对痤疮致病菌的抗菌效果优异，并且提供抗炎效果。
本发明的组合物可以作为用于改善气色及肤色的皮肤外用剂组合物来使用，将其使用于皮肤时，通过扩张毛细血管，并促进血液循环来顺利将营养成分供应到皮肤，并抑制皮肤老化，因此，改善气色及肤色的效果卓越。
本发明的组合物可以作为用于收缩毛孔、调节皮脂及改善皮肤问题的皮肤外用剂组合物来使用，将其使用于皮肤时，抑制过度分泌的皮脂，并通过促进活性氧的消除和胶原蛋白的合成来收缩毛孔，并且由于炎症因子表达的减少，因此，抑制皮肤问题的效果卓越。并且，可以通过优异的抗氧化能力来防御皮肤刺激的生成。
本发明的组合物可以作为用于防止头皮屑的皮肤外用剂组合物来使用，其通过有效排出积累在毛发和头皮上的毒素来净化头皮，并通过抑制头皮屑菌的增殖及生长能够预防头皮炎症反应，并且，由于抑制活性氧的生成及作用的抗氧化功效卓越，因此，能够提供镇定并强化头皮，并且强化固有的防御力的效果。
本发明的组合物可以作为用于毛发生长的皮肤外用剂组合物来使用，其促进从休止期毛发周期到生长期毛发周期的转化，从而能够提供促进毛发的生长，防止脱发的效果。
本发明的组合物可以作为用于防止白发的皮肤外用剂组合物来使用，其通过显著提高在黑素细胞中的转录因子(MITF)的表达来抑制白发，并能够促进黑发的诱发。
另外，本发明的皮肤外用剂组合物中使用的人参皂苷Rh4能够提供作为天然防腐剂的效果。
所述本发明的皮肤外用剂组合物可以剂型化为化妆品组合物，也可以含有化妆品学或皮肤科学上可接受的介质或基材而剂型化。其可以作为适合局部使用的全部剂型来提供，例如，可以提供为溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物在水相中分散油相而获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微细颗粒球或离子型(脂质体)及非离子型的小囊分散剂的形态，或霜、化妆水、洗剂、粉、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形态。并且，可以以泡沫(foam)形态或进一步包含压缩的推进剂的气雾剂组合物的形态使用。这些组合物可以根据本领域常用的方法制备。
尤其，本发明的皮肤外用剂组合物用于防止头皮屑、用于毛发生长或用于防止白发时，可以作为用于头皮及毛发的组合物而剂型化，剂型不受特别限定，例如可以剂型化为生发油、毛发营养化妆水、头皮护理、头发护理、洗发水、护发素、头发洗剂或头皮毛发兼用护理等。
并且，根据本发明的组合物可以包括脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、螯合剂、络合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊或常用于化妆品的任何其它成分等在化妆品学或皮肤科学领域中常用的辅助剂。所述辅助剂以在化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的量导入。
并且，本发明的组合物，为了增加皮肤改善效果，可以含有皮肤吸收促进物质。
以下，将通过试验例及剂型例更具体地说明本发明的结构及效果。然而，这些试验例及剂型例仅是为了帮助理解本发明而作为例示目的来提供的，本发明的范畴及范围并不限定于下述例。
[参考例1]
为了对本发明组合物的功效进行实验而使用的人参皂苷Rh4购自安博(AMBO)研究所。
[试验例1]活性氧簇(ROS：reactive oxygen species)生成抑制效果
将从人的表皮细胞中分离的角质形成细胞(keratinocyte)加入到24孔板中，每孔加入5×104个，并贴附24小时。16小时后，用1％的人参皂苷Rh4进行处理。这时，为了比较，对照组没有用人参皂苷Rh4处理。2小时后去除培养液，然后在各孔中加入100μl的磷酸盐缓冲液(PBS)。利用紫外线B(UVB)灯(型号：K5T8，UVB 15W，三共电器公司(Sankyo Dennki，日本)，对该角质形成细胞照射30mJ/cm2的紫外线后，取出磷酸盐缓冲液，并在各孔中添加200μl的角质形成细胞培养液。并且对其再次用人参皂苷Y处理，按照一定的时间段对因紫外线刺激而增加的活性氧簇的量进行定量。ROS的量是通过参考测定因ROS而氧化的二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA，dichlorofluorescin diacetate)的荧光的Tan的方法来进行定量(Tanet al.,1998,J.Cell Biol.Vol.141,pp1423-1432)的，算出仅用载体(vehicle)处理的对照组的ROS的比例，并将其结果表示在下述表1中。
表1
从上述表1的结果中可以知道，根据本发明的人参皂苷Rh4能够有效抑制已知为因紫外线而对皮肤细胞产生损伤的ROS的生成，并且将紫外线刺激后的ROS的量抑制在没有照射紫外线时的ROS的生成量以上的水平，因此，抗氧化功效非常卓越。因此，确认了根据本发明的人参皂苷Rh4通过抑制氧化并阻止老化，从而能够预防毛孔变大，并且通过防御皮肤刺激的生成，从而能够改善皮肤问题。
[试验例2]弹性蛋白酶活性抑制功效的测定
对于人参皂苷Rh4的弹性蛋白酶活性阻碍能力，与表儿茶素(EGCG)进行比较而测定。使用的弹性蛋白酶和基质是商业性地购自美国西格玛奥德里奇公司(Cat.No.E0127)的弹性蛋白酶。
用下述试验方法对弹性蛋白酶活性阻碍作用进行了试验。
在96孔板中，调制10mg/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCL)缓冲液(pH8.0)，并混合人参皂苷Rh4(200μL)及50μL的20μg/mL弹性蛋白酶-III型溶液。将250μM EGCG作为阳性对照组来使用，并且作为阴性对照组的非处理组使用了蒸馏水。之后，添加100μL的用所述缓冲液调制的0.4514mg/mL的N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺(N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE)，并且在25℃下反应15分钟。反应结束后，测定415nm波长下的吸光度。用相同的方法来实施空白试验而进行校正。
弹性蛋白酶活性阻碍作用的计算方法如下述数学式1所示，将结果表示在下述表2中。
数学式1
弹性蛋白酶活性阻碍率(％)＝1-(C-D)/(A-B)×100
A：在没有添加试验物质，而添加酶时，在415nm波长下的吸光度
B：在没有添加试验物质、酶时，在415nm波长下的吸光度
C：在添加试验物质、酶时，在415nm波长下的吸光度
D：在添加试验物质，而没有添加酶时，在415nm波长下的吸光度
表2
化合物 抑制程度(％)
非处理组 0
EGCG 65
人参皂苷Rh4 77
如上述表2中所示，显示出人参皂苷Rh4对弹性蛋白酶活性抑制程度，比已知为弹性蛋白酶活性抑制剂的EGCG显著优异，因此可以确认本发明的人参皂苷Rh4的弹性蛋白酶活性抑制效果优异。
[试验例3]胶原酶(MMP-1)阻碍能力
对于本发明的人参皂苷Rh4的胶原酶生成阻碍能力，与视黄酸进行比较而测定。
在装有含2.5％的牛胎儿血清的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)培养基的96孔平板培养器(96-well microtiter plate)中，以5,000细胞/孔(well)的量加入人成纤维细胞，并在5％CO2，37℃培养器中进行培养直至长到70～80％程度为止。用10μg/ml浓度的人参皂苷Rh4或视黄酸处理24小时后，采取细胞培养液。
利用商业上可利用的胶原酶测定设备(美国Amersham Phamarcia公司，Catalog#：RPN2610)，测定采取的细胞培养液的胶原酶生成程度。首先，在均匀涂抹有一次胶原酶抗体的96-孔平板(96-well plate)中加入采取的细胞培养液，并在恒温槽中实施抗原-抗体反应3小时。3小时后，将结合有显色团的二次胶原蛋白抗体加入到96-孔平板中，并再次反应15分钟。15分钟后，加入作为显色诱发物质的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，西格玛)，并在室温下诱发显色15分钟，再次加入1M硫酸而停止显色反应，则反应液的颜色呈黄色，根据反应的进行程度，显示出的黄色的程度不同。
利用吸光计，在405nm下测定呈黄色的96-孔平板的吸光度，并且根据下述数学式2计算胶原酶的合成程度，并将其结果表示在下述表3中。这时，将从没有用组合物处理的组中采取的细胞培养液的反应吸光度作为对照组。
数学式2
胶原酶表达程度(％)＝(物质处理细胞组的吸光度)/对照组的吸光度×100
表3
化合物 表达程度(％)
非处理组 100
维甲酸 75
人参皂苷Rh4 73
如上述表3中所示，可以知道人参皂苷Rh4的胶原酶表达程度与已知为胶原酶表达抑制剂的维甲酸相比，其胶原酶表达抑制效果水平相似。
通过上述结果，可以确认本发明的人参皂苷Rh4通过阻碍基质金属蛋白酶(MMP-1)，并且通过减少皮肤内的胶原蛋白分解，从而具有抗老化效果。
[剂型例1及比较剂型例1]
根据下述表4的组成，通过常规的方法来制备营养霜(单位：重量％)。
表4
配料成分 剂型例1 比较剂型例1
精制水 至100 至100
人参皂苷Rh4 0.1 -
植物性氢化油 1.50 1.50
硬脂酸 0.60 0.60
硬脂酸甘油酯 1.00 1.00
硬脂醇 2.00 2.00
聚甘油-10五硬脂酸酯&二十二醇&硬脂酰乳酸钠 1.00 1.00
花生山嵛醇(Arachidyl behenyl alcohol)&花生醇葡糖苷 1.00 1.00
鲸蜡硬脂醇&鲸蜡硬脂基葡糖苷 2.00 2.00
PEG-100硬脂酸酯&甘油油酸酯&丙二醇 1.50 1.50
辛酸/癸酸三甘油酯 11.00 11.00
环聚二甲基硅氧烷 6.00 6.00
防腐剂，香料 适量 适量
三乙醇胺 0.1 0.1
[试验例4]皮肤弹力提高功效确认
为了确认对人的皮肤弹力提高的效果，利用了所述剂型例1和比较剂型例1的剂型，并作出了如下评价。
对于20名30至40岁年龄段的健康女性，以每组10名分为两组，将剂型例1及比较剂型例1两个组的营养霜以每天1次的频率涂抹于脸部12周后，利用皮肤弹力测试仪(Cutometer SEM575，C+K电子有限公司(C+K Electronic Co.)，德国)测定皮肤弹力。其结果表示在下述表5中。表5的结果值用皮肤弹性测量仪(Cutometer SEM 575)的ΔR8值来进行记载，其中R8值表示皮肤粘弹性(viscoelasticity)的性质。
表5
试验产品 皮肤弹力效果
剂型例1 0.38
比较剂型例1 0.10
如上述表5中所示，含有本发明的人参皂苷Rh4的剂型例1，与涂抹比较剂型例1的组相比，其皮肤弹性提高得更多。
因此，可以确认含有本发明的人参皂苷Rh4的组合物对皮肤弹力提高非常有效。
[试验例5]皮肤皱纹改善功效的确认
为了确认本发明的组合物对人的皱纹改善效果，利用了所述剂型例1及比较剂型例1。
为了确认所述比较例1和比较剂型例1的皱纹改善效果，作出了如下评价。对于20名40岁年龄段的健康女性，以每组10名分为两组，将剂型例1及比较剂型例1两个组的营养霜以每天1次的频率涂抹于脸部12周后，利用硅取出复型(replica)，用皮肤测试仪(visiometer，SV600，Courage+Khazaka electronic GmbH，德国)测定皱纹的状态，并进行图像分析。其结果表示下述表6中。下述表6的结果表示涂抹12周后的各参数(parameter)中减去涂抹前的参数值后的平均值。
表6
使用8周后的临床结果 R1 R2 R3 R4 R5
剂型例1 0.14 0.13 0.09 0.02 0.01
比较剂型例1 0.27 0.26 0.21 0.03 0.03
R1：皱纹等高线的最高值和最低值的差值
R2：将皱纹等高线任意分成5格后，其中R1值的平均值
R3：分成5个后R1值中的最高值
R4：在皱纹等高线的基底线(baseline)中减去各角的峰和谷的值后的平均值
R5：在皱纹等高线的基底线中减去各角的皱纹轮廓的值的差值
如上述表6中所示，可以知道剂型例1的外用剂组合物对改善皮肤皱纹的效果非常优异。
[试验例6]酪氨酸酶阻碍效果
酪氨酸酶是从蘑菇类(Mushroom)中提取的，使用了西格玛公司的酪氨酸酶。首先，将作为基质的酪氨酸溶解于蒸馏水中，并制成0.3mg/ml的溶液，并且将该溶液以每管10ml的量加入到试管中后，在其中添加1.0ml的钾-磷酸盐缓冲溶液(0.1mol浓度，pH6.8)及0.7ml的蒸馏水。
将本发明的人参皂苷Rh4，以适当的浓度与乙醇溶液混合而制备0.2ml的试料液，将上述试料液加入到反应液中，然后在37℃恒温槽中反应10分钟。这时，以只加入0.2ml溶剂来代替各试料液的加入，并作为对照组，并且将抗坏血酸作为阳性对照组来使用。在该反应液中分别加入0.1ml的2500单元/ml的酪氨酸酶溶液，并再次在37℃恒温槽中反应10分钟。将装有该反应液的试管放入冰水中使其急速冷却，从而停止反应，并用光电分光分析仪，测定475nm波长下的吸光度，并将其结果表示在下述表7中。用下述数学式3来算出各酪氨酸酶阻碍效果。
数学式3
酪氨酸酶阻碍率(％)＝100-(试验物质的反应吸光度/对照组的反应吸光度×100)
表7
试验物质 酪氨酸酶阻碍率(％)
对照组(没有添加) 0
抗坏血酸 52
人参皂苷Rh4 63
从上述表7的结果中可以知道，根据本发明的人参皂苷Rh4对酪氨酸酶的抑制率比作为公知的酪氨酸酶抑制剂的抗坏血酸高很多，因此美白效果非常优异。
[试验例7]利用B16/F10黑色素瘤细胞的黑色素生成抑制效果
将分别以0.1重量％的量含有人参皂苷Rh4及曲酸的试料作为试验物质，并以一定浓度添加到B16/F10黑色素瘤细胞(韩国细胞系银行)的培养液中，并培养3天后，去除培养液，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，并用1N NaOH溶解细胞后，在405nm下测定吸光度。将没有添加试验物质的细胞作为对照组，并与对照组中的黑色素含量进行比较，并测定各试验物质对阻碍黑色素生成的程度。根据数学式4计算黑色素生成抑制率，并将其结果表示在表8中。
数学式4
黑色素生成抑制率(％)＝100-(试验物质的吸光度/对照组的吸光度×100)
表8
试验物质 黑色素生成抑制率(％)
对照组(没有添加) 0
曲酸 53
人参皂苷Rh4 68
从上述表8的结果中可以知道，根据本发明的人参皂苷Rh4对黑色素生成的抑制率比作为公知的黑色素生成抑制剂的曲酸高很多，因此美白效果非常优异。
[试验例8]皮肤保湿力增加效果测定
为了测定人参皂苷Rh4对皮肤保湿力增加产生的效果，利用了所述剂型例1及比较剂型例1，并作出了如下评价。
对于20名40至50岁年龄段的分类为干燥皮肤的成年男女，以每组10名分为两组，将剂型例1及比较剂型例1两个组的营养霜以每天2次的频率涂抹于脸部4周。涂抹开始前、涂抹1周后、2周后、4周后时，以及在停止涂抹经过2周(共经过6周)之后，在恒温、恒湿条件(24℃，相对湿度40％)下，使用皮肤水分测试仪(Corneometer CM825，C+K电子有限公司(C+K Electronic Co.)，德国)测定皮肤水分量。其结果表示在下述表9中。表9的结果是以试验开始之前测定的皮肤水分测试仪的值作为基准，将处理一段时间之后的测定值的增加部分以百分率表示的结果。
表9
从所述表9的结果中可以确认，涂抹比较剂型例1时，直到经过涂抹的4周为止，显示出约30％的水分增加率，但停止涂抹后皮肤水分量减少，相反，涂抹含有人参皂苷Rh4的剂型例1时，停止涂抹后也显示出30％以上的皮肤水分增加率。由此可以知道含有人参皂苷Rh4的本发明的组合物的皮肤保湿力效果优异。
[试验例9]角质形成细胞分化促进效果测定
如下所示，为了了解人参皂苷Rh4对角质形成细胞分化的促进效果，利用吸光度来测定角质形成细胞分化时生成的角化包膜(Cornified Envelope，CE)量。
首先，将从婴儿的表皮分离后并进行一次培养的人的角质形成细胞放入培养用烧瓶中，使其附着于底部后，在培养液中用5ppm的浓度人参皂苷Rh4处理之后，培养5日直到细胞长到底部面积的70～80％为止。此时，将低钙(0.03mM)处理组和高钙(1.2mM)处理组分别作为阴性对照组和阳性对照组。然后获取上述培养的细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤之后，加入1ml的含有2％十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)和20mM浓度的二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)的10mM浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl，pH7.4)，并进行超声处理(sonication)、煮沸(boiling)、离心分离，再将沉淀物放入1ml PBS中，进行悬浮，并测定在340nm下的吸光度。另外，取出一部分所述超声处理后的溶液，测定蛋白质含量，将其作为评价细胞分化程度的基准。并将其结果表示在下述表10中。
表10
试验物质 在角质形成细胞中的分化能力(％)
低钙(0.03mM)溶液(阴性对照组) 100
高钙(1.2mM)溶液(阳性对照组) 210
人参皂苷Rh4 285
如上述表10所示，可以确认用人参皂苷Rh4处理时，角质形成细胞的分化促进效果优异。
[试验例10]皮肤屏障功能恢复效果测定
为了测定人参皂苷Rh4对由于皮肤损伤而受损的皮肤屏障功能恢复产生的效果，实施了下述实验。对于10名成人男女的上臂，用胶带剥离(Tape Stripping)的方法，损伤皮肤屏障，分别涂抹按照下述表11的组成制备的剂型例2及比较剂型例2两个组，用Vapometer(海豚(Delfin)，芬兰)，每天测定1次经皮水分损失量(TWEL)的恢复程度，测定七天，并进行了比较。这里的比较剂型例2为阴性对照组的载体(vehicle)。将其实验结果示于下述表12中。表12的结果是将屏障损伤前和屏障损伤后的处理前的差异作为100％基准进行比较的结果。
表11
配料成分 剂型例2 比较剂型例2
精制水 69 70
丙二醇 30 30
人参皂苷Rh4 1 -
表12
从上述表12中可知，可以确认当使用不含有人参皂苷Rh4的比较剂型例2处理时，随着时间的推移，经皮水分损失量逐渐增加，相反，当使用含有人参皂苷Rh4的剂型例2处理时，经皮水分损失量以很快的速度恢复正常，且屏障损伤得到恢复。
[试验例11]气色改善效果
为了评价根据本发明的化妆品组合物的促进皮肤血液循环的效果，利用激光多普勒血流成像仪(Laser Doppler Perfusion Imager，LDPI)，测定皮肤中血液循环程度。已知LDPI是测定皮肤中的血液循环的仪器，并且其为目前广泛使用的仪器，是一种不仅可以测定皮肤毛细血管中的血液的速度及量，而且可以测出小动脉和小静脉中的流动的非常灵敏的仪器。
在恒温恒湿室里，用香皂洗脸之后，适应30分钟，并利用LDPI测定了初期值。首先，用LDPI对平时手脚冰凉的30名女性的额头下方的初期血流量进行了测定。然后，使试验对象使用1周所述剂型例1及比较剂型例1之后测定血流量，然后将测定的血流量和所述初期测定值进行比较，并将其结果(皮肤血流量变化)表示在下述表13中。
表13化妆品使用前后LDPI结果-皮肤血流量
试验物质 使用一周后的皮肤血流量变化率(％)
剂型例1 11
比较剂型例1 5
从上述表13的结果中可以确认，根据本发明的化妆品组合物与不含有人参皂苷Rh4的比较剂型例1相比，使得皮肤血流量显著增加，并通过这种血液循环促进而使气色得到改善。这最终表明根据本发明的含有人参皂苷Rh4的化妆品组合物能够对有效传递皮肤营养成分，抑制并延缓皮肤老化做出贡献。
[试验例12]肤色改善效果
为了了解所述剂型例1及比较剂型例1的肤色改善效果，使30名测试对象分别使用(晚1次/日，共涂抹1周)之后，利用Facial Stage DM-3(茉莉特(Moritex)，日本)仪器，评价肤色改善程度。采用皮肤的明度及色彩变化值，以及皮肤的明度及色彩测定值对肤色改善率进行了判断，并将其结果表示在下述表14中。明度及色彩变化值越高表示肤色得到改善。
表14
从表14的结果中可以确认，不含有本发明的人参皂苷Rh4的比较剂型例1，未显示出显著的肤色改善功效，相反，使用含有人参皂苷Rh4作为有效成分的剂型例1，与使用前相比，使用后的肤色得到很大改善。
[试验例13]毛孔收缩效果
1.通过促进胶原蛋白合成的收缩毛孔的效果
将根据本发明的人参皂苷Rh4对胶原蛋白的合成的促进效果与TGF-β进行比较并进行了测定。首先，将成纤维细胞以每孔105个细胞接种于24孔(well)中，并进行培养直至长到90％左右为止。将其用无血清细胞培养基(DMEM)培养24小时之后，分别使用10ng/ml的溶于无血清培养基中的本发明的人参皂苷Rh4和TGF-β进行处理，并在CO2培养器中培养24小时。取出它们的上清液，并利用原骨胶原型(I)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(原骨胶原型(I)(procollagen type(I))，观察原骨胶原(procollagen)的增减与否，并将其结果示于下述表15中。对于胶原蛋白的合成能力，将非处理组设为100而进行了对比。
表15
试验物质 胶原蛋白合成能力(％)
非处理组 100
TGF-β 183.5
人参皂苷Rh4 196.1
从上述表15的结果中可以确认，本发明的人参皂苷Rh4与阳性对照组TGF-β相比，显示出更高水平的优异的胶原蛋白合成能力。因此，可以确认本发明的人参皂苷Rh4通过增加毛孔周边的胶原蛋白生成量来收缩变宽的毛孔。
2.毛孔收缩效果
为了了解剂型例1及比较剂型例1的毛孔收缩效果，进行如下评价。选出20名毛孔大小宽的男女测试对象，按每组10名分成两组，并按照组别在脸上每天涂抹剂型例1及比较剂型例1的营养霜，共涂抹4周。毛孔收缩效果的判定按照以下方式实施。拍摄实验前和4周后的照片，并让专家通过肉眼进行评价。其结果表示在下述表16中(评价等级：0-完全没有收缩；5-收缩很多)。
表16
试验物质 评价等级
剂型例1 4
比较剂型例1 0
从上述表16的结果中可知，比较剂型例1没有收缩毛孔的效果，然而剂型例1示出能够用肉眼确认的毛孔收缩效果，从而可知本发明的人参皂苷Rh4对收缩毛孔大小的效果优异。
[试验例14]皮脂分泌抑制效果
1.通过抑制5α-还原酶活性的抑制皮肤分泌过多的效果
为了确认5α-还原酶活性抑制效果，在HEK293-5αR2细胞中测定了[14C]睾酮转化成[14C]二氢睾酮(DHT：dihydrotestosterone)的比率。在HEK293细胞上转染p3x FLAG-CMV-5αR2之后，并按每孔2.5×105个细胞的量接种于24孔板中，并进行培养(Park et al.，2003，JDS.Vol.31，pp.191-98)。第二天换成添加有酶底物和抑制剂的新培养基。将0.05μCi[14C]睾酮(试剂盒(Amersham Pharmacia biotech，英国)用作培养基底物。
为了确认5α-还原酶活性抑制程度，加入人参皂苷Rh4，并在37℃，5％CO2培养器中培养2小时。此时，将没有加入人参皂苷Rh4的用作阴性对照组，将加入非那雄胺(finasteride)的用作阳性对照组。之后回收培养基，并用800μl乙酸乙酯提取类固醇之后，分离上部的有机溶剂层，并晾干之后，对剩余的残留物，再用50μl乙酸乙酯溶解，并在硅塑料薄膜硅胶60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254)上，使用乙酸乙酯-己烷(1:1)作为溶剂来展开。
将塑料试料在空气中干燥之后，为了测定同位素的量而使用了淋浴系统将干燥的塑料薄板和x射线薄膜一同加入到浴盒中，1周后测定留在薄膜上的睾酮和二氢睾酮的同位素量，然后根据下述数学式5及6，分别算出转化率及阻碍率，并将其结果表示在下述表17中。
数学式5
转化率(％)＝DHT区域中的放射能/总放射能×100
数学式6
抑制率(％)＝[对照组的转化率-试验物质的转化率]/对照组的转化率×100
表17
试验物质 转化率(％) 阻碍率(％)
阴性对照组 48.0 -
阳性对照组 27.6 42.5
人参皂苷Rh4 14.9 61.3
从上述表17的结果中可以确认，人参皂苷Rh4可以有效地抑制5α-还原酶的活性，从而阻断睾酮转化为二氢睾酮，并且显示出了与已知的抑制5α-还原酶活性的非那雄胺相比更加优异的抑制效果。所述5α-还原酶使睾酮转化为二氢睾酮，从而与细胞质内的受体蛋白结合而进入核内，从而活性化皮脂腺细胞并促进分化，从而使皮脂腺内的皮脂过度分泌。因此，确认了人参皂苷Rh4通过有效抑制5α-还原酶的活性来抑制皮脂的过多分泌。
2.皮脂分泌抑制效果
为了了解所述剂型例1及比较剂型例1的皮脂分泌抑制效果，进行了如下评价。选出30名认为皮脂分泌多的男女测试对象，在指定部位每天涂抹剂型例1及比较剂型例1的营养霜，共涂抹4周。对于皮脂减少效果的判定，通过使用皮脂量测试仪(Sebumeter SM810，C+K电子有限公司(C+K Electronic Co.)，德国)分别测定经过2周及4周后的平均皮脂减少率(％)，并将其结果表示在下述表18中。
表18
从上述表18的结果中可知，本发明的含有人参皂苷Rh4作为有效成分的剂型例1与不含其的比较剂型例1相比，能有效地抑制过多分泌的皮脂。
[剂型例3及比较剂型例3～4]
根据下述表19中显示的成分及含量(重量％)来制备剂型例3及比较剂型例3～4，具体说明如下。剂型例3为混合人参皂苷Rh4的物质，比较剂型例3为完全没有包改善含痤疮皮肤的有效成分的物质，比较例4作为对于抗菌力的基准的标准物质，该物质含有多作为痤疮治疗剂使用的红霉素(erythromycin)。
剂型例3及比较剂型例3～4的制备方法如下。将下述表19的A项的成分完全溶解，并在其它的溶解槽中，完全溶解B项的成分，之后将B项添加到A项中，使其混合可溶化。并且在其中，以根据表19中记载的混合比例，添加C项的成分，并混合均匀后，进行过滤，从而制备本组合物。
表19
[试验例15]对痤疮菌的抗菌力试验
使用根据所述剂型例3及比较剂型例3～4的组成制备的各化妆品组合物，对作为痤疮致病菌株的痤疮丙酸杆菌(ATCC6919：培养基-脑心浸液肉汤培养基(BHI broth)))进行抗菌力试验。
对痤疮菌的抗菌力试验方法如下。
(1)试验菌液的准备
使用将痤疮丙酸杆菌接种于脑心浸液肉汤培养基中进行厌氧培养的培养液作为试验菌液。
(2)稀释溶液的准备
在15ml的脑心浸液肉汤培养基(pH6.8)或LB肉汤培养基(pH4.5)中添加0.15ml的所述试验菌液，并将混合好的混合液作为稀释溶液来使用。
(3)试料的准备
将从剂型例3及比较剂型例3～4中制备的化妆品组合物原液，直接作为样品来使用。
(4)抗菌力试验
1)在96孔的细胞培养管(96 well plate)1号排中加入试料，使得与起始浓度匹配，并加入总量为200μl的稀释溶液。
2)将1号排的混合液混合均匀后，取出100μl的混合液而加入到2号排中，并混合均匀后，再次取出100μl的混合液而加入到3号排中。通过这种方式进行二倍稀释(doubledilution)。
3)在32℃下静置培养24小时及48小时后，用悬浮程度判断菌的是否进行增值，并将没有菌的增殖的最小浓度定为最小抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)值。如果混合液不透明而难以判断菌是否进行增值，则通过显微镜观察来确认。
对痤疮菌的抗菌力试验结果表示在下述表20中。对于最小抑制浓度，换算成剂型中含有的有效成分的浓度而标记。
表20
项目 pH 痤疮丙酸杆菌
剂型例3 5.7 >30ppm
比较剂型例3 5.7 最高浓度(没有抗菌力)
比较剂型例4 5.7 >100ppm
在最小抑制浓度中，ppm浓度越小，可以认为该物质对痤疮菌的抗菌力有效，使用剂型例3时，与使用为公知的痤疮治疗剂的红霉素的比较剂型例4相比，显示出的ppm浓度显著低，从而可以确认含有人参皂苷Rh4的组合物，对试验菌具有更优异的抗菌力。
[试验例16]脂质合成(Lipogenesis)抑制试验
将作为小鼠的成纤维细胞系(fibroblast cell line)的3T3-L1细胞，以1×105细胞/孔贴附于盛有含10％的牛胎儿血清(fetal Bovine Serum，FBS)的DMEM(Dulbecco′smodified eagle′s medium，GI BCO BRL，生活技术公司)培养基的6孔培养板(cultureplate)中。经过2天后，重新更换新的DMEM(含有10％的FBS)培养基，并培养2天。然后，用含有1μg/ml胰岛素(insulin)、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)及0.25μm地塞米松(dexamethasone)的DMEM(含有10％的FBS)，重新对所述培养的细胞进行分化诱导，并用50μM的人参皂苷Rh4及咖啡因处理，然后，经过2天后，重新更换成包含胰岛素的DMEM，并培养5天。5天后，重新更换成正常培养基(DMEM，含有10％的FBS)，并对所述细胞进行培养至所述细胞从形态上变化成脂肪细胞。
为了评价人参皂苷Rh4对抑制脂肪细胞内脂肪积累的功效，利用所述完成分化的3T3-L1脂肪细胞，实施苏丹三染色(S4136，西格玛奥德里奇)。在常温下，在磷酸盐缓冲液中，用4％多聚甲醛(pH7.2)固定脂肪细胞后，用磷酸盐缓冲液进行水洗，然后，用苏丹三进行染色后拍摄照片，并通过肉眼进行比较。将没有添加试验物质或比较物质而仅使用培养基的组作为对照组来使用，对于其它比较组，用50μM的咖啡因处理。脂肪积累抑制程度是通过将染色的程度分成+++、++、+、-，从而赋予等级，此时，越接近+++，表示染色程度越大。其结果表示在下述表21中。
表21
样品 抑制率％
对照组 +++
比较组 +
人参皂苷Rh4 -
如上述表21中所示，可以确认本发明中使用的人参皂苷Rh4，不仅脂肪细胞内积累的脂肪量少，而且与作为公知的脂质合成抑制物质的咖啡因相比，还具有优异的脂质合成抑制效果。因此，通过抑制脂质合成来减少皮脂，从而能够抑制痤疮的发生。
[试验例17]痤疮改善和皮脂分泌减少及刺激的有无的试验
将30名患有痤疮的人作为试验对象，以每组10名分为三组，并对对应于各组的试验对象使用用所述剂型例3及比较剂型例3～4来制备的化妆品组合物1个月。对于痤疮改善标准，设成1分至5分，并标记1分为“没有”，3分为“普通”，5分为“非常好”。对于实验结果，以10名的平均分数标记在下述表22中。
对于痤疮消灭时期，以辨认出消灭的天数作为基准，对于痤疮复发，以1个月后有无复发作为基准。对于皮脂分泌的减少，设成1分至5分，并标记成1分为“没有”，3分为“普通”，5分为“非常好”。对于实验结果，以10名的平均分数标记在下述表22中。用(显示出刺激反应的人数)/(总试验人数)判断皮肤刺激的有无。
表22
如上述表22中所示，可以知道剂型例3与比较剂型例3相比，痤疮没有复发，并且整体上对痤疮改善具有优异的效果。另外，使用含有抗菌力标准物质的比较剂型例4时，虽然显示出痤疮改善效果，但是使用所述物质，对皮肤的刺激强，因此不适合长期使用，然而，根据本发明的组合物却没有刺激，因此显示出适合长时间使用。
[试验例18]白细胞介素-8(IL-8)生成抑制效果
进行实验的一天前，将皮肤角化上皮细胞(Normal human skin keratinocyte，NHEK，购入处：Lonza)，以5×104细胞/孔，接种于96孔板中，然后在37℃，5％CO2培养箱(incubator)中培养24小时。24小时后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞2次，并更换成无血清角化细胞基底培养基(serum free keratinocyte basement media(KBM))。在各孔中，用下述表23的浓度的人参皂苷Rh4进行处理，并反应30分钟后，分别用金黄色葡萄球菌肽聚糖(10μg/ml)、金黄色葡萄球菌肽聚糖(50μg/ml)及金黄色葡萄球菌肽聚糖(50μg/ml)+脂多糖(1μg/ml)处理。其中，金黄色葡萄球菌肽聚糖(PGSA：peptidoglycan from S.aureus)作为从葡萄球菌中提取的肽聚糖(peptidoglycan)，是革兰氏阳性(+)菌的细胞壁的主要组成成分，并且已知细菌的细胞膜成分会诱发炎症。另外，脂多糖(LPS：lypopolysaccaride)为革兰氏阴性(-)菌的细胞膜的主要组成成分，并且已知脂多糖是炎症诱发的主要原因。
在37℃，5％CO2培养箱中培养24小时后，取出培养液对白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，并将其结果表示在下述表23中。对于ELISA，利用了制备公司(BD科学)的实验方法。
表23
分类 白细胞介素-8的分泌(pg/ml)
无处理对照组(Control) 935.12
PGSA(10μg/ml) 4812.60
PGSA(50μg/ml) 5895.08
PGSA(50μg/ml)+LPS(1μg/ml) 6814.91
人参皂苷Rh4(5ppm) (1398.33)
人参皂苷Rh4(25ppm) (1212.41)
人参皂苷Rh4(50ppm) (1010.37)
从上述表23中可以确认，人参皂苷Rh4能够显著减少及抑制因PGSA和脂多糖LPS而增加的白细胞介素-8的分泌。因此，可以知道本发明的皮肤外用剂组合物能够显著减少因PGSA和LPS而增加的白细胞介素-8的分泌，从而能够提供优异的抗炎症效果。
[试验例19]瘙痒缓解评价
进行实验的一天前，将角质形成细胞(细胞系名称：HaCaT，购入处：ATCC)，以4×104细胞/孔，接种于96孔板中，然后在37℃，5％CO2培养箱(incubator)中培养24小时。24小时后，用汉克斯的平衡盐溶液(Hanks′Balanced Salt solution，HBSS)缓冲液清洗(washing)96孔板2次后，将反应缓冲液(2μM Fluo-4-AM、20％普流尼克酸(pluronicacid)、2.5mM丙磺舒(probenecid))放入到细胞中。在37℃，5％CO2培养箱中反应30分钟，并在常温下反应30分钟后，用HBSS缓冲液清洗2次，并用与下述表24相同浓度(％)的人参皂苷Rh4来处理细胞。
反应10分钟后，用2U/ml的胰蛋白酶(trypsin)或5μM的PAR-2活性肽(SLIGKV)进行处理，并测定细胞内Ca2+浓度变化80秒。对于细胞内Ca2+浓度变化的测定，利用了酶标仪3(FlexStation3：分子器件(Molecular Device)，美国)。用人参皂苷Rh4和2U/ml的胰蛋白酶(trypsin)或5μM的PAR-2活性肽(SLIGKV)处理之后，测定80秒的弯曲(flex)，并求出得到的值的最小值和最大值的差值之后，将该值与用2U/ml胰蛋白酶或5μM的PAR-2活性肽(SLIGKV)处理时的最小值和最大值的差值进行比较，对钙离子涌入细胞内的抑制率(％)表示在下述表24中。
表24
从上述表24中可以知道，因胰蛋白酶或PAR-2活性肽(SLIGKV)引起的钙离子向细胞内的涌入，随着人参皂苷Rh4的处理而减少，并且可以确认随着提高人参皂苷Rh4的浓度，钙离子向细胞内的涌入显著减少。
因此，含有本发明的人参皂苷Rh4的皮肤外用剂组合物，通过有效抑制诱发瘙痒的PAR-2活性，从而能够提供优异的抗瘙痒效果。
[剂型例4及比较剂型例5]
用下述表25的组成来制备洗发水。具体地，将表面活性剂和乙二醇二硬脂酸酯添加到精制水中，并加热至80℃而使得其匀溶解后，在搅拌下渐渐冷却至40℃，并且，在所述混合物中加入根据本发明的有效成分和防腐剂、粘度调节剂、香料及毛发调节剂并混合后，在搅拌下冷却至常温，从而制备洗发水。
表25
成分 剂型例4 比较剂型例5
十二烷基硫酸铵 10 10
聚氧乙烯十二烷基硫酸铵 5 5
椰油酰胺丙基甜菜碱 2 2
乙二醇二硬脂酸酯 1.5 1.5
椰油酰基单乙醇酰胺 0.8 0.8
人参皂苷Rh4 5.0 -
聚季铵盐-10 0.2 0.2
蓝色1号 0.0002 0.0002
黄色4号 0.0001 0.0001
对羟基苯甲酸甲酯 0.1 0.1
香料 0.8 0.8
柠檬酸 0.1 0.1
聚二甲基硅氧烷 1.0 1.0
水 至100 至100
表26
[试验例20]头皮屑减少效果试验
选定24名头皮屑较多的19至35岁的男性，以每组12名分为两组，并用以下方式分别使用剂型例4及比较剂型例5的洗发水1个月后，测定头皮屑减少率。
试验开始前，通常用常规的洗发水清洗头发，然后采集洗发后累积两天的头皮屑，并将采集的头皮屑的重量与分别用剂型例4及比较剂型例5的洗发水隔两天洗一次头发而试验结束后累积两天的头皮屑的重量进行比较而评价。此时，将累积的头皮屑用真空吸入装置直接从头皮采集，并且依据下述数学式7求出头皮屑减少率，并将其结果表示在下述表26中。
数学式7
头皮屑减少率(％)＝(试验开始前的头皮屑重量(mg)-一个月后的头皮屑重量(mg))/试验开始前的头皮屑重量(mg)×100
从上述表26中可以知道，含有人参皂苷Rh4的剂型例4显示出优异的头皮屑防止效果。
[试验例21]头皮瘙痒症防止效果的试验
选定24名比较严重感觉到头皮瘙痒的25岁至45岁的男女，以每组12名分为两组，并以三天一次的频率使用各剂型例4及比较剂型例5的洗发水两周后，通过下述评价基准对头皮瘙痒症防止效果进行了评价，并将其结果表示在下述表27中。
[评价基准]
非常优异-5分
优异-4分
一般-3分
不良-2分
非常不良-1分
表27
分类 剂型例4 比较剂型例5
头皮瘙痒症的去除效果 4.2 2.3
从上述表27中可以知道，含有人参皂苷Rh4的剂型例4对头皮瘙痒症的防止显示出更优异的效果。
[试验例22]毛囊毛乳头细胞的增殖效果
组成毛发的角质蛋白从毛根部的角质形成细胞(keratinocyte)生成，该角质形成细胞是从毛乳头细胞分化而成的。为了评价本组合物的毛乳头细胞的活性，本发明使用了大鼠永生化毛乳头(rat immortalized dermal papilla cell，DP6)细胞系(WendyFilsell，Journal of Cell Science 107，1761-1772(1994))。该毛乳头细胞系为用显微解剖(microdissection)方法，从雄性PVG大鼠胡须的毛根中分离并培养的细胞系，并且在含有10％牛胎儿血清(Fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle'smedium,Gibco BRL，盖瑟斯堡，MD，美国)中，在维持5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。将DP6接种于96孔板中，并在37℃的培养箱中培养24小时后，分别用5ppm、10ppm及20ppm的浓度的人参皂苷Rh4处理。药物处理后经过24小时后，使用WST-1试剂盒(瑞士罗氏)测定细胞增殖能力。并将其结果表示在下述表28中。
表28
分类 细胞增殖能力(％)
无处理对照组(Control) 100
人参皂苷Rh4(5ppm) 131
人参皂苷Rh4(10ppm) 139
人参皂苷Rh4(20ppm) 148
如上述表28中所示，可以确认，用人参皂苷Rh4处理时，毛乳头细胞的增殖增加，其依赖于浓度而显著增加。
[试验例23]钾离子通道活性增加效果评价
作为脱发治疗剂的米诺地尔已知为潜在的线粒体钾离子通道开放剂(KATPchannel opener)，是在雄激素性脱发的治疗中使用的代表性药物。为了评价这种米诺地尔的机制，使用了下述试验法。所述试验法为使用组成头皮真皮的成纤维细胞中的阻止KATP通道的甲苯磺丁脲(SIGMA AIDRICH，T0891)进行处理，从而抑制细胞的增殖，并且再次打开钾离子通道而恢复细胞增殖。
为了评价作为本组合物的KATP通道开放剂的功能，本发明使用了作为成纤维细胞系的小鼠胚胎成纤维细胞系(Mouse embryonic fibroblast cell line，NIH3T3：)。本细胞系为用3T3方案(protocol)，对从NIH瑞士小鼠胚胎(Swiss mouse embryo)中分离的成纤维细胞系进行自然永生化而得到的细胞系。所述细胞系，在含有10％FBS的DMEM(Gibco BRL，盖瑟斯堡，MD，美国)中，在维持5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。将NIH3T3接种于96孔板中，并在37℃的培养箱中培养24小时后，用2.5mM的甲苯磺丁脲进行处理，并且10分钟后，分别用2.5ppm、5ppm及10ppm的浓度的作为阳性对照组的10μM的米诺地尔和人参皂苷Rh4进行处理，并且药物处理后经过48小时后，使用WST-1试剂盒(Roche)测定细胞增殖能力。结果表示在下述表29中。
表29
分类 细胞增殖能力(％)
无处理对照组(Control) 100
米诺地尔 132
人参皂苷Rh4(2.5ppm) 111
人参皂苷Rh4(5ppm) 129
人参皂苷Rh4(10ppm) 136
从上述表29中可以知道，用人参皂苷Rh4处理时，成纤维细胞的增殖得到恢复，并且细胞增殖能力依赖于处理的人参皂苷Rh4的浓度而增加，并且可以确认用10ppm人参皂苷Rh4处理时，细胞增殖恢复到用米诺地尔处理时的水平。
[试验例24]人参皂苷Rh4的黑色素生成促进效果试验
在无血清细胞冻存培养基(RPMI培养基)中添加5％的牛胎儿血清、100IU的青霉素G及0.2μM的对苯二甲酸(TPA)的培养基中，将黑色素细胞，以50,000细胞/孔，接种于24孔板(24-well microtiter plate)中。第二天，对接种的细胞，用10ppm或50ppm的最终浓度的作为试验物质的人参皂苷Rh4处理。将用0.1％的DMSO处理后在37℃温度下培养三天而得到的作为阴性对照组使用，用100μM的IBMX处理后在37℃温度下培养三天而得到的作为阳性对照组使用。培养后，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗孔板，并在每孔中加入100μl的1N NaOH后，溶解细胞中的黑色素。利用酶标仪(microplate reader)，在405nm下测定被溶解的黑色素的吸光度。将人参皂苷Rh4的黑色素生成促进效果与对照组进行比较的结果表示在下述表30中。
表30
试料 黑色素合成量(％)
DMSO(0.1％) 100
IBMX(100μM) 120
人参皂苷Rh4(10ppm) 109
人参皂苷Rh4(50ppm) 123
从上述表30中可以知道，人参皂苷Rh4促进黑素细胞的黑色素合成，从而增加黑色素的生成，因此能够显示出优异的黑色素生成促进效果。
[试验例25]人参皂苷Rh4在黑素细胞中的促进转录因子(MITF)及酪氨酸酶表达的效果
利用501mel细胞系，以500,000细胞/孔，接种于6孔板中，并且在各孔中，用0.1％的二甲基亚砜(DMSO)处理的作为阴性对照组，用100μM的异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理的作为阳性对照组，以及用10ppm的人生皂苷Rh4处理的作为实验组，并在37℃温度下培养24小时、48小时及72小时后，得到蛋白质。对于如此获得的蛋白质，利用MITF及酪氨酸酶进行蛋白印迹(Western Blot)法试验。蛋白质提取和蛋白印迹是通过本领域技术人员通常使用的标准方法来实施。实施蛋白印迹后，将其结果中的阴性对照组设为100，并与该值进行比较而表示在下述表31中。
表31
如上述表31中所示，可以确认人参皂苷Rh4在黑素细胞中提高MITF和酪氨酸酶蛋白质的表达。
[试验例26]人参皂苷Rh4的抗菌力评价
为了评价人参皂苷Rh4的抗菌力，实施了抗菌实验。具体的试验方法如下所述。
实验中使用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是在胰蛋白酶大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth)中培养；白色念珠菌(Candida albicans)及黑曲霉(Aspergillus niger)是在沙氏葡萄糖肉汤培养基(Sabouraud Dextrose Broth)中培养。在各培养基中，将对培养液进行1/100(白色念珠菌菌株是以1/10)稀释而得到的稀释液作为试验菌株来使用。
将在15ml的各培养基中添加0.15ml的试验菌液而混合好的混合液作为稀释溶液来使用。
在96孔板1号排中，以每孔16μl的量加入试料，并且分别加入184μl的稀释溶液。在其它的孔中分别加入100μl的稀释溶液。将1号排的混合液混合均匀后，取出100μl的混合液加入到2号排中，并混合均匀后，再次取出100μl的混合液加入到3号排中。通过这种方式进行了二倍稀释。
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌是在32℃的恒温槽中培养；白色念珠菌及黑曲霉是在25℃的恒温槽中培养。
48小时后，用悬浮率和显微镜来确认菌的增值与否，从而决定最小抑制浓度(MIC)值，并将其结果表示在下述表32中。
表32
如上述表32中所示，可以确认人参皂苷Rh4对多种菌株显示出抗菌力，并且通过这些可以预测人参皂苷Rh4能够在组合物内作为天然防腐剂或抗菌剂而起作用。

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1.含有人参皂苷Rh4作为唯一有效成分的皮肤外用剂组合物在制备用于改善痤疮的化妆品组合物中的用途。
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