KR101402565B1 - 피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인삼 또는 홍삼에 함유된 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진세노사이드 Rh4는 UV 노출에 의해 유도된 피부의 섬유아세포의 콜라겐분해효소 활성을 억제함으로써, 피부의 탄력을 향상시키고 주름을 개선하는 효과가 매우 우수하므로, 피부노화 방지, 피부 주름 증가 억제, 탄력성 증가를 위한 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물{Composition For Preventing Skin Aging and Improving Skin Wrinkle}

본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로서, 피부 섬유아세포의 콜라겐분해효소 활성을 억제하여 피부 주름을 개선하고 및 탄력을 향상시키기 위한 피부노화 방지 또는 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부 노화는 내인성 노화(intrinsic aging)와 광노화(photoaging) 두 가지 형태로 구분되는데(EBDoris, Cosmetics ＆ Toiletories., 111, pp31-37, 1996), 내인성 노화는 외부환경과는 무관하게 유전적 요소에 영향을 받아 나이가 들면서 자연스럽게 나타나는 현상으로 인위적인 조절이 어렵지만 광 노화는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로 인위적인 조절이 비교적 용이하다고 할 수 있다. 광노화의 대표적인 인자는 자외선으로, 태양광선에 노출된 피부에서 자외선에 의해 과잉의 활성산소종이 생성되고, 체내의 항산화효소와 비타민 E, C, 글루타치온 및 유비퀴놀 등의 항산화제가 감소함으로 인해 산화와 항산화의 불균형이 야기된다. 이에 따라, 지질 과산화, 단백질 산화, 단백질 분해효소의 활성화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬절단, 멜라닌 생성반응 촉진, DNA 산화 등에 의해 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고 결국에는 피부탄력감소, 주름 및 기미, 주근깨 생성 등의 피부노화가 일어나게 된다(Oikarinen,A., Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 7(1),pp3-4,1990 ; Yamauchi, M., J. Invest. Dermatol., 97,pp938-941, 1991).

한편, MMP(matrix metalloproteinase)는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비된다. 효소 활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화되며 활성화된 MMP는 2-마크로글로불린(macroglobulin)이나 TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinase)와 같은 저해제에 의해 활성이 조절되고 피부의 각질형성세포 (keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast)를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한다(Fisher, G. J. et al., Photochem. Photobiol.69, 154, 1999). 단 한번의 자외선 조사에도 피부 내의 MMP 활성이 증가되어 피부 내의 콜라겐을 현저하게 붕괴시키므로, MMP는 진피층의 콜라겐 붕괴에 결정적인 영향을 미치며 광노화에 매우 중요한 역할을 한다.

인삼(Panax Ginseng)은 한의학뿐만 아니라 민간요법으로 널리 알려져 사용되어온 오가피(Araliaceae)과의 인삼(Panax)속의 한방약제로, 그 상태에 따라 수삼, 백삼 및 홍삼으로 분류된다. 수삼은 수확 후 건조되지 않은 인삼의 뿌리이며, 백삼은 수삼의 잔뿌리를 제거하고 껍질을 벗겨낸 다음, 햇볕에 말린 인삼의 뿌리이다. 홍삼은 인삼의 뿌리를 쪄서 말리는 방법에 의해 제조된다. 인삼의 사포닌은 부신에서 카테콜아민(Cartecholamine)의 분비를 촉진하고 지질의 과산화 과정을 저해함으로써 항산화 활성을 지니며 방사선에 대한 방어효과, 알킬화제에 의한 염색체 이상 및 미세핵 방어효과, 배양세포에서 돌연변이 감소 및 세포변형 감소 효과가 있음이 보고된 바 있다. 그러나, 인삼의 증삼 과정에서 생성된 마이너 진세노사이드의 일종인 Rh4에 관한 약리학적 작용으로는 아직까지 확실하게 밝혀진 바는 없고, 더욱이 피부학적으로 외용 도포 시 피부 노화 방지 또는 주름 개선 효과에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다. 그러므로, 최근 천연재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라, 보다 안전하고 효과적인 천연 유래의 피부 노화 방지용 원료 물질을 개발하기 위하여, 피부 노화 방지 효과에 대하 보고된 바 없는 사포닌계 성분에 대한 개발이 절실히 요구된다.

본 발명의 목적은 우수한 MMP-1 유전자 발현 억제 효과를 통한 피부 탄력도 개선 효과 및 피부 주름 개선 효과를 갖는 진세노이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 진세노사이드 Rh4는 당업계에 널리 알려진 방법 또는 하기와 같은 본 발명에 따라 추출된 것, 또는 시판중인 것을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rh4는 인삼, 바람직하게는 홍삼으로부터 분리 및 추출된 것으로서, 구체적으로 홍삼을 유기용매로 추출하고, 상기 추출물을 크로마토그래피로 분리 정제하여 수득할 수 있다.

상기 홍삼은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 깨끗하게 세척하고 건조하여 사용한다. 건조된 홍삼은 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 유기용매, 바람직하게는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 헥산, 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 벤젠 및 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 에탄올을 넣고 추출하여 유기용매 추출물을 얻을 수 있다. 추출과정은 수회 반복할 수 있으며, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류추출 또는 가열추출 등 당업계에 알려진 모든 추출 방법을 사용할 수 있다. 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

상기 크로마토그래피를 통해 상기 추출물로부터 진세노사이드 Rh4를 분리하여 수득할 수 있고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 또는 이온교환수지 컬럼 크로마토그래피, 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 수행할 수 있다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 시 이동상으로는 클로로포름, 메탄올, 부탄올 및 에틸아세테이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 용매를 혼합한 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 클로로포름·메탄올 혼합용매, 클로로포름·메탄올·물 혼합용매, 및 부탄올·에틸아세테이트 혼합용매를 순차적으로 사용할 수 있다. 이때 사용되는 상기 클로로포름·메탄올 혼합용매의 부피비는 10:1 내지 1:1, 클로로포름·메탄올·물 혼합용매는 50:10:1 내지 1:1:1, 부탄올·에틸아세테이트 혼합용매는 1:1 내지 1:5인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 크로마토그래피는 단일 진세노이드 Rh4가 정제될 때까지 1회 내지 수회에 걸쳐 수행할 수 있으며, 필요에 따라 농축, 재결정을 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 피부노화 및 주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화에 의한 것이 보다 바람직하며, UV 노출에 의한 광노화인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 피부노화 및 주름은 MMP-1 활성을 기반으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, UV 노출 후 피부의 주요 구성 물질인 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP-1 및 MMP-9의 발현 및 활성 증가로 인하여 피부노화가 촉진된다.

상기 진세노사이드 Rh4는 피부 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 20.0 중량%의 함량으로 함유되는 것이 바람직하고, 0.001 내지 1.0 중량%의 함량으로 함유되는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 진세노사이드 Rh4의 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 MMP-1 억제 및 이를 통한 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과를 얻을 수 없고, 20 중량%를 초과할 경우에는 함량 증가에 따른 뚜렷한 효능 상승효과가 떨어지며 제형이 볼안정하여 적절하게 제형화할 수 없는 문제점이 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 진세노사이드 Rh4 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 상기 진세노사이드 Rh4의 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않고, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 로션, 영양크림, 마사지크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 분무제, 리니먼트제, 파스타아제 또는 카타플라스마제 등의 제형으로 제조될 수 있다. 여기에서, 상기 제형이 연고인 경우에는 진세노사이드 Rh4 이외에 바셀린 50.0 내지 97.0 중량%, 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5.0 중량%를 함유하도록 제조되며, 유연화장수는 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 다가알콜류 1.0 내지 10.0 중량%, 및 폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 등의 계면활성제 0.05 내지 2.0 중량%를 함유하도록 제조된다. 영양화장수 및 영양크림은 스쿠알란, 바셀린, 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5.0 내지 20.0 중량%, 및 세탄올, 스테아릴알콜, 밀납 등의 왁스성분 3.0 내지 15.0 중량%을 함유하고, 에센스는 글리세린, 프로필렌글리콜 등 다가알콜류 5.0 내지 30.0 중량%를 함유한다. 마사지크림은 유효성분 이외에 유동파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일을 30.0 내지 70.0 중량% 함유하여 제조되며, 팩은 폴리비닐알콜을 5.0 내지 20.0 중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5.0 내지 30.0 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조된다.

본 발명의 진세노사이드 Rh4는 처리 농도에 상관없이 사람 섬유아세포에 대해 세포독성이 없는 안전한 물질로 확인되었다(표 1 참조). 또한, 인삼 사포닌 중 파낙사디올계인 진세노사이드 Rg3, Rh2, Rb1, Rb2, Rc 및 Rd는 UVA에 의해 증가한 MMP-1의 발현을 감소시키는 활성이 없었으나(도 2 참조), 이에 반해 본 발명의 진세노사이드 Rh4는 UVA 노출에 따라 발현이 증가하여 피부노화 및 주름을 유발하는 MMP-1의 발현량을 현저히 감소시키는 것으로 확인됨으로써(표 4 및 도 1 참조), 피부노화 및 피부주름을 효과적으로 억제하고 개선하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rh4는 UV 노출에 따른 피부노화 현상을 억제하고 MMP-1의 발현 및 활성을 억제시키는 효과가 있어, 피부 주름 및 탄력 개선에 기여할 수 있으므로, 상기 진세노사이드 Rh4는 피부노화 방지 또는 주름 개선을 위한 피부 외용제 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 피부노화 및 주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화인 것이 보다 바람직하며, 상기 광노화는 UV 노출로 인한 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 약학적 조성물에 함유되는 상기 진세노사이드 Rh4의 함량은 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 20.0 중량%인 것이 바람직하고, 0.001 내지 1.0 중량%인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 진세노사이드 Rh4의 함량이 0.0001 중량% 미만이면 피부노화 방지 또는 주름 개선 효과를 얻을 수 없고, 20 중량%를 초과하면 필요 이상의 진세노사이드 Rh4를 사용하여 경제적이지 못한 문제점이 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되고, 비경구 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부투여(topical application) 방식으로 적용된다. 상기 비경구는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 병소내 주사 또는 주입기술을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 진세노사이드 Rh4에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제형화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 ㎎/㎏ 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인기준으로 1.0 내지 3.0 ㎖의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rh4는 사람 섬유아세포에서 UV 노출에 의해 유도되는 MMP-1의 발현을 억제하는 세포독성이 없는 안전한 물질이므로, 피부노화 방지 또는 주름 개선을 위한 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

상기 피부노화 및 주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화인 것이 보다 바람직하며, 상기 광노화는 UV 노출로 인한 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 진세노사이드 Rh4의 함량은 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 상기 건강식품 조성물에 함유되는 상기 진세노사이드 Rh4의 함량은 건강식품 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 20.0 중량%인 것이 바람직하고, 0.001 내지 1.0 중량%인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 진세노사이드 Rh4의 함량이 0.0001 중량% 미만이면 피부노화 방지 또는 주름 개선 효과를 얻을 수 없고, 20 중량%를 초과하면 필요 이상의 양을 사용하여 경제적이지 못하며 조성물의 안정성이 낮아지는 문제점이 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 진세노사이드 Rh4는 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 건강식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로는 천연 향미제 타우마틴, 스테비아 추출물 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 건강식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 진세노사이드 Rh4 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 천연 추출액 등이 추가로 포함될 수 있다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 진세노사이드 Rh4를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 진세노사이드 Rh4는 사람 섬유아세포에서 UV 노출에 의해 유도되는 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 세포독성이 없는 안전한 물질이므로, 피부노화 방지 또는 주름 개선을 위한 건강식품 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물은 피부 노화 및 주름의 원인인 콜라겐분해효소를 억제함으로써 독성이 적으며 우수한 탄력 증진 및 주름 개선 효과를 가지므로, 피부노화에 따른 피부 주름 및 탄력을 개선하고 피부 노화 방지 효능이 있는 조성물의 효능물질로서 효과적이다.

도 1은 본 발명의 진세노사이드 Rh4 처리에 따른 MMP-1 mRNA의 발현량 변화를 나타내는 도면이다.
도 2는 파낙사디올계 진세노사이드 처리에 따른 MMP-1 mRNA의 발현량 변화를 나타내는 도면이다(KGC-PDC: 파낙사디올 복합체(complex)).

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 진세노사이드 Rh4 의 분리 및 정제

6년근 홍삼 1 ㎏을 건조하여 세절한 후 실온에서 에탄올 2.5 ℓ를 사용하여 3일 동안 냉침을 2회 반복한 후 필터링을 통해 잔사를 제거하고 감압농축하여 엑스제 120 g을 얻었다. 이 중 100 g을 350 g의 실리카겔 컬럼에 CHCl₃-MeOH(5:1)을 이동상으로 이용하여 4가지의 분획층을 얻었다. 이 중 3번째 분획층을 125 g의 실리카겔 컬럼에 CHCl₃-MeOH-H₂O(20:3:1)을 이동상으로 이용하여 분리하였다. 그 후 75 g의 실리카겔 컬럼에 BuOH-EtOAc(1:3)을 이동상으로 이용하여 담마란계 글리코시드를 분리하였고 그런 다음 정제하여 20 ㎎의 진세노사이드 Rh4를 얻었다.

< 실험예 1> 진세노사이드 Rh4 의 세포독성 측정

상기 <실시예 1>에서 분리 및 정제한 진세노사이드 Rh4의 세포독성을 알아보기 위해, MTT 환원법(3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide reduction method)을 수행하였다. 사람 섬유아세포(ATCC 2076)를 소혈청 10%를 함유한 IMDM(Iscove's modified Dulbeco's medium; Gibco, USA)을 사용하여 1 × 10⁵ 세포수의 밀도로 24 웰 플레이트에 분주하였다. 1일 후 새로운 배지(IMDM, 소혈청 0%)로 갈아주면서 진세노사이드 Rh4를 농도별로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, PBS로 세척하고 MTT(2.5 ㎎/㎖)를 IMDM 배지에 10배 희석시켜 그 희석액을 1㎖ 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 버리고 DMSO 0.5 ㎖를 첨가하여 상온에서 10분 동안 녹인 다음, 완전히 녹인 후 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이러한 실험은 3회 반복 시험하여 세포독성을 측정하였다.

그 결과, 진세노사이드 Rh4를 섬유아세포에 농도별로 처리한 결과, 모든 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인됨으로써, 세포 독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다(표 1).

추출물	농도(㎍/㎖)	세포생존도(%)
대조군	0	100.0±0.00
실시예 1의 진세노사이드 Rh4	0.5	100.0±0.96
	1.0	101.3±1.99
	2.5	101.8±2.33
	5.0	102.5±2.85

< 실험예 2> 진세노사이드 Rh4 의 콜라겐분해효소 억제 효과

피부 내의 콜라겐 붕괴를 촉진하는 콜란겐분해효소인 MMP-1(Matrix Metallo Proteinase-1)은 UVA에 의해 발현이 촉진되며 이에 따라 피부 섬유의 분해를 촉진하여 피부 노화 및 주름을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 진세노사이드 Rh4의 MMP-1 유전자 발현 저해 효과를 보기 위해, RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 실시하였다. 사람 섬유아세포를 60 ㎜ 세포 배양 접시에 1×10⁶의 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. UVA 6J을 조사한 후 진세노사이드 Rh4를 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 세포에 트리졸(Trizol, invitrogen, 미국) 1 ㎖을 첨가하여 제조사에 지시에 따라 RNA를 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR은 RT-PCR 키트(All-in-one RTPCR Kit, SuperBio, Korea)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 하기의 표 2 및 표 3과 같았으며, 제조사의 지시에 따라 실험을 수행하였다. MMP-1 발현량은 액틴(Actin) 유전자에 대해 보정을 하여 나타내었고, 활성 비교를 위해 대조군으로 EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)를 사용하였다. 실험 결과는 5회 실험에 의한 평균값으로서 나타냈다.

MMP-1 프라이머

센스 프라이머	5'-TGGGAGCAAACACATCTGA-3' (서열번호 1)
안티센스 프라이머	5'-ATCACTTCTCCCCGAATCGT-3' (서열번호 2)
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 1분간 25 사이클로 중합반응

액틴 프라이머

센스 프라이머	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3' (서열번호 3)
안티센스 프라이머	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3' (서열번호 4)
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분간 25 사이클로 중합반응

그 결과, 진세노사이드 Rh4 1.0, 2.5 및 5.0 ㎍/㎖의 농도에서 각각 82%, 68% 및 55%의 MMP-1 유전자 발현율을 나타냈다(표 4 및 도 1). 따라서, 진세노사이드 Rh4는 농도의존적으로 MMP-1의 발현량을 감소시킴으로써 MMP-1 유전자 발현 감소를 통한 피부 노화 방지 및 주름개선 효능을 가지는 것을 알 수 있었다.

농도(㎍/㎖)	농도(㎍/㎖)	MMP-1 (%)
대조군(무처리군)	0	57.68
UVA 6 J/㎠	0	100
UVA 6J + EGCG	2.5	58.32
UVA 6J + 진세노사이드 Rh4	1.0	82.74
	2.5	68.96
	5.0	55.69

< 비교예 1> 파낙사디올계 진세노사이드의 콜라겐분해효소 억제 효과

파낙사디올계 사포닌인 진세노사이드 Rg3, Rh2, Rb1, Rb2, Rc 및 Rd와 본 발명의 진세노사이드 Rh4의 MMP 억제 작용을 통한 피부 노화 방지 및 주름 개선 효과를 비교하기 위해, 상기 <실시예 2>에서 실시한 방법에 따라 파낙사디올계 진세노사이드의 콜라겐분해효소 억제 정도를 측정하였다.

그 결과, UVA만 처리한 것과 비교하여 파낙사디올계 진세노사이드의 처리에 의해 MMP-1 mRNA의 발현량 억제 효과가 나타나지 않았다. UVA만 처리한 것과 비교하여 파낙사디올계 진세노사이드의 처리시 MMP-1의 발현은 다소 감소하는 경향을 나타냈으나 본 발명의 진세노사이드 Rh4의 효과 보다 현저히 낮았으며, 오히려 UVA만 처리하였을 때보다 파낙사디올계 진세노사이드의 처리에 따라 MMP-1 발현량이 증가하는 것으로 나타났다(도 2). 따라서, 상기 파낙사디올계 진세노사이드는 피부 노화 및 주름에 효과가 없는 것으로 확인되었다.

< 제조예 1> 화장료의 제조

<1-1> 유연 화장수의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 유연 화장수는 하기 [표 5]와 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
진세노사이드 Rh4	10.00
1,3-부틸렌글리콜	1.00
디소듐이디티에이	0.05
알란토인	0.10
디포타슘글리시리제이트	0.05
시트릭애씨드	0.01
소듐시트레이트	0.02
글리세레스-26	1.00
알부틴	2.00
하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
에탄올	30.00
보존제	미량
착색제	미량
착향제	미량
정제수	잔량

<1-2> 영양 크림의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유한 영양크림은 하기 [표 6]의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
진세노사이드 Rh4	10.0
1,3-부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	1.0
D-판테놀	0.1
식물 추출물	3.2
마그네슘알루미늄실리케이트	0.3
PEG-40 스테아레이트	1.2
스테아릭애씨드	2.0
폴리소르베이트 60	1.5
친유형글리세릴스테아레이트	2.0
소르비탄세스퀴올리에이트	1.5
세테아릴알코올	3.0
미네랄오일	4.0
스쿠알란	3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	2.8
식물성 오일	1.8
디메치콘	0.4
디포타슘글리시리제이트	미량
알란토인	미량
소듐 히아루로네이트	미량
토코페릴아세테이트	적량
트리에탄올아민	적량
보존제	적량
착향제	적량
정제수	잔량

<1-3> 로션의 제조

원료	함량( 중량부 )
세토스테아릴알코올	1.6
스테아린산	1.4
친유형모노스테아린산글리세린	1.8
피이지-100 스테아레이트	2.6
세스퀴올레인산소르비탈	0.6
스쿠알렌	4.8
마카다이아오일	2
호호바오일	2
초산토코페롤	0.4
메칠폴리실록산	0.2
에칠파라벤	0.1
초산토코페롤	0.4
메칠폴리실록산	0.2
에칠파라벤	0.1
프로필파라벤	0.1
1,3-부칠렌글리콜	4
메칠파라벤	0.1
산탄검	0.1
글리세린	4
d-판데놀	0.15
알란토인	0.1
진세노사이드 Rh4	3.5
카르보머(2% aq. Sol)	4
트리에탄올아민	0.15
에탄올	3
pt 41891	0.1
p-H20	48.3

< 제조예 2> 약학적 조성물의 제조

<2-1> 피부 외용 연고의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유한 피부 외용 연고를 하기 [표 8]의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량( 중량부 )
정제수	100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
진세노사이드 Rh4	20
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코상이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0

<2-2> 피부 외용 패취제의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유한 피부 외용 패취를 하기 [표 9]의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
진세노사이드 Rh4	10.0
헥실렌글리콜	20.0
디에틸아민	0.7
폴리아크릴산	1.0
아황산나트륨	0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.0=9)	1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르	1.0
점성의 파라핀 오일	2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(cetiol LC)	2.5
폴리에틸렌글리콜 400	3.0
탈이온수	70

<2-3> 산제의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<2-4> 정제의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<2-5> 캡슐제의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<2-6> 환의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<2-7> 과립의 제조

본 발명의 진세노사이드 Rh4 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

1. 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 진세노이드 Rh4는 인삼 또는 홍삼을 유기용매로 추출하고, 상기 추출물을 크로마토그래피로 분리하여 수득하는 것인 피부 외용제 조성물.
   
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 헥산, 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 벤젠 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 피부 외용제 조성물.
   
4. 청구항 2에 있어서,
   상기 크로마토그래피는 클로로포름, 메탄올, 부탄올 및 에틸아세테이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 용매를 혼합한 용매를 이동상으로 사용하는 것인 피부 외용제 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 피부노화는 광노화인 것인 피부 외용제 조성물.
   
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 광노화는 UV 노출로 인한 광노화인 것인 피부 외용제 조성물.
   
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 진세노사이드 Rh4는 피부 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 20.0 중량%의 함량으로 함유되는 것인 피부 외용제 조성물.
   
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 피부 외용제 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 분무제, 리니먼트제, 파스타아제 및 카타플라스마제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것인 피부 외용제 조성물.
   
9. 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물.
   
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 피부노화는 광노화인 것인 약학적 조성물.
    
11. 청구항 10에 있어서,
    상기 광노화는 UV 노출로 인한 광노화인 것인 약학적 조성물.
    
12. 청구항 9에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rh4는 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 20.0 중량%의 함량으로 함유되는 것인 약학적 조성물.
    
13. 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 건강식품 조성물.
    
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 피부노화는 광노화인 것인 건강식품 조성물.
    
15. 청구항 14에 있어서,
    상기 광노화는 UV 노출로 인한 광노화인 것인 건강식품 조성물.
    
16. 청구항 13에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rh4는 건강식품 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 20.0 중량%의 함량으로 함유되는 것인 건강식품 조성물.

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