TWI629987B

TWI629987B - 含人參皂苷Ｒh４的皮膚外用組成物

Info

Publication number: TWI629987B
Application number: TW103115791A
Authority: TW
Inventors: 金東泫; 柳權烈; 李沃澯; 廉明勳; 曺濬喆
Original assignee: 愛茉莉太平洋股份有限公司
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2018-07-21
Also published as: CN105188711A; CN105188711B; KR102021764B1; WO2014178682A1; HK1212918A1; KR20140131027A; TW201521737A

Abstract

本發明係關於一種含人參皂苷Rh4之外用劑組成物，更詳細而言，是關於一種藉由含有人參皂苷Rh4，透過其優秀的抗氧化力，不僅可提供皮膚抗老化效果、皮膚保濕力改善效果、抗炎效果、痤瘡等之皮膚問題改善效果、美白效果、皮脂調節效果、毛孔收縮效果、透過血液循環改善之氣色改善等之整體的皮膚狀態改善效果，亦可提供抗頭屑效果、促進毛髮生長效果及白髮預防效果等之頭皮及頭髮狀態改善效果之組成物。

Description

含人參皂苷Rh4的皮膚外用組成物

人類之皮膚係一種人體之第一層防護膜，其在溫度及濕度之變化、紫外線、公害物質等外部環境之刺激中起到保護體內之器官之功能，隨著年齡之增長，其經歷各種內外要因之變化。即，在內在要因方面，用以調節新陳代謝之各種荷爾蒙之分泌減少，免疫細胞之功能和細胞之活性降低，從而導致人體所需之免疫蛋白質及人體結構蛋白質之生物合成性減少；在外在要因方面，因臭氧層遭到破壞，太陽光線之到達地表之紫外線之含量增加，並且，隨著環境污染之逐漸加劇，導致自由基及活性氧等增加，從而導致皮膚厚度減少、皺紋增加、彈性下降，亦導致皮膚氣色變得暗沉，經常出現皮膚問題，增加黃褐斑和雀斑以及老年斑，氣色變差膚色變暗等，導致出現各種變化。

為了防止因此種皮膚內在及外在要因所導致之皮膚狀態之變化和為了保持健康之皮膚狀態，藉由將提取自已知之各種動物、植物、微生物等之生物活性物質添加至化妝品後使用，從而嘗試改善皮膚狀態。尤其，已多次進行利用人參(Panax ginseng C.A Meyer)成分之化妝品之研究開發。人參對於皮膚之其效能早就被認定而廣泛地使用於化妝品組成物，人參的根或葉子萃取物、人參皂苷(ginsenoside)、人參糖苷配基(aglycon)及人參多糖體已被使用在化妝品中。但是，這樣的含有人參萃取物、萃取精華、多糖體等化妝品所含的活性物質極微量，從而與其他原料比起來，有如下之缺點：其效果並非顯著地優秀。

對此，本發明人發現了含人參之人參皂苷Rh4不僅可提供抗老化、改善皮膚皺紋、美白、保濕改善效果以及改善痤瘡及皮膚問題之效果，亦可提供皮膚氣色改善之效果、皮脂調節、毛孔收縮效果等之皮膚狀態改善效果，亦可提供抗頭屑、促進毛髮生長及白髮預防等之頭皮及毛髮狀態改善效果，從而完成了本發明。

因而，本發明之目的在於提供一種藉由含人參皂苷Rh4而可改善皮膚之整體狀態之皮膚外用劑組成物。

為了達到上述目的，本發明提供一種作為有效成分包含人參皂苷Rh4之皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種將人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之抗老化用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種將人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之美白用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種將人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之保濕用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種將人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之痤瘡改善用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種將人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之氣色及膚色改善用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種含有人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之毛孔收縮用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種含有人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之皮脂調節用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種含有人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之抗頭屑用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種含有人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之毛髮生長促進用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種含有人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中之白髮預防用皮膚外用劑組成物。

又，本發明提供一種使用人參皂苷Rh4作為天然防腐劑之皮膚外用劑組成物。

本發明之組成物藉由含人參皂苷Rh4，透過其優秀的抗氧化力，不僅可提供皮膚抗老化效果、皮膚保濕力改善效果、抗炎效果、痤瘡等之皮膚問題改善效果、美白效果、皮脂調節效果、毛孔收縮效果、透過血液循環改善之氣色改善等之整體皮膚狀態改善效果，亦可提供抗頭屑效果、促進毛髮生長效果及白髮預防效果等之頭皮及毛髮狀態改善效果。

根據本發明之組成物將人參皂苷Rh4作為有效成分包含其中。

於本發明中所使用之人參皂苷Rh4具有以下化學式1之結構。

[化學式1]

人參屬於五加皮樹科(Araliace)之人參屬，是作為多年生半陰地性宿根草的草本植物。在韓國、中國、日本以及美國等世界各地生產，主要之生產地為東亞洲；東經85-140度，北緯22-49度，北美洲；西經70-97度，北緯34-47度。如此，在世界各地生產之人參，其成分上有差異，其中韓國產人參包含了最多具有表現出人參各種在生理學、藥理學的效能最重要的人參皂苷(Ginsenoside)的皂苷(saponin)。人參皂苷至今約有34種被分離出來，依照結合於糖苷配基(aglycon)的糖之種類或依照所結合的糖類之數或者結合位置，而各有不同的藥力效果。按照結構特徵可區分為人參二醇系、人參三醇系以及齊墩果烷(oleanane)系。另外，含人參固有之香氣成分為人參烯(panacen)、聚乙炔類化合物(polyacetylene)、多酚類化合物(polyphenol)、類黃酮化合物(flavonoid)以及維生素等。

人參自古在韓方上即被認定其功效，而被使用於各種疾患的治療上。人參於韓方效能中已知具有體力增進、新陳代謝改善、壓力解除、糖尿病治療、呼吸器疾患改善、消化器官改善以及抗癌作用，在最近的研究中報導人參具有抗補體活性、抗潰瘍作用、免疫增強、抗癌作用以及降血糖作用。如下的研究已被發表：關於皮膚的效果與消炎作用(Korean J.Dermatol.18(1)：39-42(1980)，Korean J.Dermatol.14(4)：335-339(1976))，抗角化過度(hyperkeratosis)(Korean J.Dermatol.28(4)：434-440(1990))、痤瘡的預防與治療(Korean J.Dermatol.30(1)：27-33(1992),Korean J.Dermatol.28(4)：434-440(1990))，抗氧化效果(Proceedings of the 2nd international ginseng symposium 13-17(1978))，彈性及水和性(Hydration)增加(Fitoterapia 57(1)：15-28(1986),Fitoterapia 57(4)217-222(1986))，傷口治癒(Brit.J.Pharmacol.125：255-262(1998)，Arch.pharm.res.25(1)：71-76(2002))，膠原蛋白分解抑制(Mol.Cells 9(5)：476-483(1999))，美白效果(Journal of the society of cosmetic scientists of korea 27(2)：45-56(2001))等。

本發明之人參皂苷Rh4可提取自植物，亦可依照本領域公開方法合成而使用，亦可使用商業市面有售之人參皂苷Rh4。又，考慮到本領域之技術水準，而對本領域具通常知識者可以明白的是，上述人參皂苷Rh4在本領域通常實施的置換之添加或置換反應而取得的衍生物當中，表現出皮膚、毛髮改善效果及防腐效果之衍生物也包含在本發明之範疇內。

在本發明使用之人參皂苷Rh4特別可自人參提取物中獲取。此時，所使用之人參之種類不受特殊限制，可使用水參、紅參、白參、太極參、尾參等。又，上述人參提取物包括所有藉由自人參浸出、煎出而獲取之浸出液、藉由對浸出液之部分或全部再次進行濃縮而獲取之濃縮物或者藉由將上述之濃縮物再次進行乾燥而製備之沉體、煎劑、酊劑、流體提取物及含於人參中而發揮主要效果之化學物質，還包括其植物本身，提取物可取自莖、根、葉、花、果等人參之所有部分，不限定為某一特定部分之提取物。又，自人參提取物提取人參皂苷Rh4之方法可使用公開之方法。

具體而言，藉由本領域眾所周知之方法以水或有機溶劑於人參中提取人參提取物後，由此可分離出上述人參皂苷Rh4。本發明使用之有機溶劑可選自包括乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿及該些有機溶劑和水之混合溶劑之組之一種，優選地，使用80%乙醇。此時，優選地，提取溫度為10℃~80℃，可提取3小時~24小時。若超出上述提取溫度及提取時間，則將導致提取效率下降或發生成分之變化。

優選地，因由於本發明之組成物中，上述人參皂苷Rh4之可含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%，優選地0.01~30重量%，更優選地0.1~10重量%。若上述人參皂苷Rh4之含量不足0.001重量%，則上述成分之效能、效果微弱；若上述有效成分之含量超過50重量%，則導致皮膚安全性或劑型上發生問題。

由於人參皂苷Rh4為具有優秀之抗氧化力之成分，因此含人參皂苷Rh4之本發明之組成物提供優秀之抗氧化力，可作為抗老化用皮膚外用劑組成物而使用，其增加皮膚彈性、改善皺紋之效果突出。

本發明之組成物可作為美白用組成物而使用，其可藉由阻礙酪氨酸酶活性並遏制黑色素之生成來提供優秀之美白效果。

本發明之組成物可作為保濕用皮膚外用劑組成物而使用，其可強化皮膚屏障功能、誘導皮膚角質形成細胞之分化。藉此，可有效地用作皮膚外用劑組成物，從而預防或改善因表皮分化之不完全所導致之皮膚乾燥症、接觸性皮膚炎或疥瘡等。

本發明之組成物可作為痤瘡改善用皮膚外用劑組成物而使用，其抗菌效果優秀，尤其對痤瘡致病細菌之抗菌效果突出，又，其提供抗炎效果。

本發明之組成物可作為氣色及膚色改善用皮膚外用劑組成物而使用，其適用於皮膚後，藉由擴張毛細血管和促進血液循環來確保皮膚順利吸收營養成分，從而遏制老化，其氣色及膚色改善效果卓越。

本發明之組成物可作為毛孔收縮、皮脂調節及皮膚問題改善用皮膚外用劑組成物而使用，其適用於皮膚後，藉由遏制因過剩而分泌之皮脂，促進活性氧之消除和膠原蛋白之合成，從而收縮毛孔，其以炎症因子之表現減少而遏制皮膚問題之效果突出。而且，因由優秀的抗氧化力，可預防皮膚刺激之產生

本發明之組成物可作為抗頭屑用皮膚外用劑組成物而使用，其有效排泄於毛髮和頭皮中積累之毒素，淨化頭皮，遏制頭屑細菌之增殖和成長，從而可預防頭皮炎症反應，又，其遏制活性氧之生成及作用之抗氧化效能突出，從而可提供舒緩和增強頭皮、強化固有防禦能力之效果。

本發明之組成物可作為毛髮生長促進用皮膚外用劑組成物而使用，其藉由促進休止期毛髮週期進入成長期毛髮週期來促進毛髮之生長和防止掉髮之效果。

本發明之組成物可作為白髮預防用皮膚外用劑組成物而使用，其藉由顯著地提升黑素細胞(melanocyte)之小眼畸形相關轉錄因子(MITF)表現來可遏制白髮和促進黑髮生長。

又，使用於本發明之皮膚外用劑組成物之人參皂苷Rh4可提供天然防腐劑之效果。

以上述之本發明之皮膚外用劑組成物可作為化妝品組成物而被劑型化，藉由含化妝品學或皮膚科學允許之介質或機制而被劑型化。其作為適合於局部適用之所有劑型，例如，能夠以溶液、凝膠、固體、攪拌無水生成物、將乳狀分散於水狀而獲得之乳液、懸浮液、微乳液、微膠囊、微細顆粒球或離子型(脂質體)(Liposomes)及非離子型之水泡(vesicular)分散劑之形態而提供，或者亦能夠以乳霜、化妝水、乳液、粉體、軟膏、噴霧或遮瑕膏之形態而提供。或者亦能夠以泡沫(Foam)形態或更含有被壓縮之推進劑之氣溶膠組成物之形態而使用。該些組成物可按該領域之通常之方法製備。

尤其，本發明之皮膚外用劑組成物，若作為抗頭屑、促進毛髮生長或白髮預防用途而被使用，則可劑型化為頭皮及毛髮用組成物，劑型不受特殊限定，例如，可劑型化為護髮素、毛髮營養水、柔順劑、護髮膏、洗髮乳、護髮乳、髮乳或頭皮毛髮兩用護理膏等。

又，根據本發明之組成物可含有脂肪物質、有機溶劑、溶解劑、濃縮劑、凝膠劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩定劑、發泡劑(foaming agent)、芳香劑、表面活性劑、水、離子型或非離子型乳化劑、填充劑、金屬離子螯合劑(Chelating agents)、螯合劑、防腐劑、維生素、阻斷劑、濕潤劑、必要油、染料、顏料、親水性或親油性活性劑、脂質水泡(vesicular)或如通常用於化妝品之任意其他成分之於化妝品學或皮膚科學領域中通常使用之輔助劑。上述輔助劑之使用量以於化妝品學或皮膚科學領域中通常使用之量為準。

又，本發明之組成物為增加皮膚改善效果而可含有皮膚吸收促進物質。

以下，將例舉試驗例及劑型例，更具體地說明本發明之結構及效果。然而，該些試驗例及劑型例係為了幫助理解本發明而以示例為目的提供，本發明之範疇及範圍並非限定於下述例。

[參考例1]

用於實驗本發明之組成物之效能之人參皂苷Rh4購買自AMBO研究所。

[試驗例1]活性氧氣種(ROS：reactive oxygen species)產生抑制效果

將從人之表皮組織分離之角質化細胞(keratinocyte)，以每孔5×10⁴個之方式放入24孔板，使其附著24小時。16小時後，將人參皂苷Rh4以1%進行處理。此時，為了比較，對照組不處理人參皂苷Rh4。過2小時，去除掉培養液後，每孔放入100μl之磷酸鹽緩衝液(PBS)。在該角質形成細胞上利用紫外線B(UVB)燈(Model：K5T8,UV B 15 W,Sankyo Dennki社，Japan)照射紫外線30mJ/cm²之後，取出PBS，在每孔添加角質形成細胞培養液200μl。在此處再次處理人參皂苷Rh4，而對在每個一定的時間帶內因紫外線刺激而增加的活性氧氣種的量進行定量。ROS的量參考Tan(Tan et al.,1998,J.Cell Biol.Vol.141,pp1423-1432)的方法而定量，Tan的方法為測定因ROS而氧化之DCF-DA(dichlorofluorescin diacetate)之螢光，相對於只處理賦形劑之對照組之ROS的比例所算出的結果顯示於表1。

自上述表1之結果中可以得知，本發明之人參皂苷Rh4可有效地抑制因紫外線而引發皮膚細胞損傷的已知的ROS的產生，紫外線刺激後，能夠以ROS之量不照射紫外線的情況以上之水準來抑制ROS之產生，從而可知道其抗氧化效能非常優秀。因此，可確認的是，本發明之人參皂苷Rh4藉由抑制氧化並防止老化，而可預防毛孔擴大，並且藉由防止皮膚刺激之產生，而可改善皮膚問題。

[試驗例2]彈性蛋白酶活性抑制效能測性

藉由與表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)之比較而測定人參皂苷Rh4之彈性蛋白酶活性抑制能力。所使用之彈性蛋白酶和基質商業性購買自美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司(貨號E0127)。

藉由下述之試驗方法而對彈性蛋白酶活性抑制作用進行試驗。

於96孔板中，將200μl之人參皂苷Rh4及50μL之20μg/mL彈性蛋白酶˙類型III溶液混合於10mg/L之三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩衝液(pH 8.0)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)250μM作為陽性對照組而使用，作為陰性對照組之非處理組使用蒸餾水。然後，加入100μL之以上述緩衝液調配之0.4514mg/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE，於25℃溫度條件下反應15分鐘。於結束反應後，測定於波長415nm上之吸光度(Synergy2，BioTek(VT，美國))。藉由相同之方法而實施空白試驗進行補正。

彈性蛋白酶活性抑制作用之計算方法如以下公式1所示，其結果顯示於下表2。

[公式1]彈性蛋白酶活性抑制率(%)={1-(C-D)/(A-B)}×100

A：於試驗物質無添加、酶添加中之波長415nm上之吸光度

B：於試驗物質無添加、酶無添加中之波長415nm上之吸光度

C：於試驗物質添加，酶添加中之波長415nm上之吸光度

D：於試驗物質添加、酶無添加中之波長415nm上之吸光度

自上述表2之結果中，可知人參皂苷Rh4之彈性蛋白酶活性抑制程度明顯優於作為彈性蛋白酶活性抑制劑之表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，藉此，可確認本發明之人參皂苷Rh4之彈性蛋白酶活性抑制效果優秀。

[試驗例3]膠原酶(MMP-1)抑制能力

藉由與維生素A酸(Retinoic acid)之比較而測定本發明之人參皂苷Rh4之膠原酶生成抑制能力。

於含有2.5%之胎牛血清之杜爾伯科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Media，DMEM)培養基所處96孔板培養器(96-well microtiter plate)中，加入人體之成纖維細胞，以使達到5,000細胞/孔(well)，於5%二氧化碳、37℃之培養器(incubator)中培養，直到其生長70~80%左右。將人參皂苷Rh4或維生素A酸(Retinoic acid)按10μg/ml之濃度而處理24小時後，提取細胞培養液。

藉由商業應用性膠原酶測量儀器(美國安發瑪西亞生物技術公司，Catalog #：RPN 2610)而測定所提取之細胞培養液之膠原酶生成程度。首先，將所提取之細胞培養液放入96-孔板(96-well plate)，其均勻地塗佈有一次膠原酶抗體，於恆溫槽中實施3小時之抗原-抗體反應。經過3小時後，將結合有生色基團之二次膠原抗體加入96-孔板(96-well plate)，再次反應15分鐘。經過15分鐘後，放入發色誘導物質(3,3'， 5,5'tetramethylbenzidine，sigma)，於室溫中誘發生色15分鐘，再次加入1M硫酸而中止發色反應，反應液之顏色呈黃色，依據反應進行程度，黃色顯示程度各異。

藉由吸光計而於405nm中測定呈黃色之96-孔板(96-well plate)之吸光度，藉由以下公式2而計算膠原酶之合成程度，其結果顯示於表2。此時，將提取自未對組成物進行處理之組中之細胞培養液之反應吸光度作為對照組。

[公式2]膠原酶表現程度(%)=物質處理細胞組之吸光度/對照組之吸光度×100

自上述表3之結果中，可知人參皂苷Rh4之膠原酶表現程度，相比於已知的作為膠原酶表現抑制劑之維生素A酸(Retinoic acid)，亦處於與其膠原酶表現抑制效果相似之程度。

藉由此種結果中可知，本發明之人參皂苷Rh4具有妨害基質金屬蛋白酶(MMP-1)，並且讓皮膚內部之膠原蛋白分解減少，從而具有抗老化之效果。

[劑型例1及比較劑型例1]

依據下表4之組成，藉由通常之方法而製備營養霜(單位：重量%)。

[試驗例4]確認皮膚彈性增強效能

為了確認針對人體之皮膚彈性增加效果，藉由上述劑型例1和比較劑型例1而評價如下。

將30~40歲年齡段之20名健康女性以每組10名之方式分為2組，其分別與劑型例1和比較劑型例1之2個組相對應，將營養霜塗抹於被試者之面部，每天1次連續12週，藉由皮膚彈性測定儀器(Cutometer SEM 575，C+K Electronic Co.，德國)而測定皮膚彈性。其結果顯示於下表5。表5之結果值以Cutometer SEM 575之△R8值記載，而R8值表示皮膚黏彈性(viscoelasticity)之性質。

自上述表5之結果中可知，含有本發明之人參皂苷Rh4之劑型例1，其相比於塗抹比較劑型例1之組，其皮膚彈性進一步增加。

因而，可確認含有本發明之人參皂苷Rh4之組成物對於增加皮膚彈性非常有效。

[試驗例5]確認皮膚皺紋改善效能

為了確認藉由本發明之組成物之皺紋改善效果，利用上述劑型例1與比較劑型例1。

為了確認上述劑型例1與比較劑型例1之皺紋改善效果，按如下方式進行評估。將40歲年齡段之20名健康女性以每組10名之方式分為2組，其分別與劑型例1和比較劑型例1之2個組相對應，將營養霜塗抹於被試者之面部，每天1次連續12週，藉由矽膠而提取複製品，藉由皮膚測定儀器(visiometer，SV600，Courage+Khazaka electronic GmbH，德國)而進行測定並實施圖像分析。其結果顯示於下表6。下表6之值表示自塗抹12週後之各個參數(parameter)值中除去塗抹前參數值之平均值。

R1：皺紋等高線之最高值與最低值之差異值R2：將皺紋等高線任意劃分為5格後，其中各R1值之平均值R3：劃分為5個後，其中R1值之最高值R4：於皺紋等高線之基線(baseline)中，除去各自之峰值與谷值之平均值R5：於皺紋等高線之基線(baseline)中，除去各自之皺紋輪廓之之值之平均值

自上述表6之結果中，可知劑型例1之外用劑組成物，其皮膚皺紋改善效果優秀。

[試驗例6]酪氨酸酶抑制效果

酪氨酸酶提取自菌類(Mushroom)，使用由西格瑪(SIGMA)公司製備之酪氨酸酶。首先，將作為基質之酪氨酸溶解於蒸餾水，製備0.3mg/ml之溶液，將其溶液分別以1.0ml之量加入試管中，繼而，向其中加入1.0ml鉀-磷酸緩衝溶液(0.1mol濃度，pH 6.8)及0.7ml蒸餾水。

將以適當的濃度混合而準備之人參皂苷Rh4之0.2ml試料液加入至本發明之乙醇反應液中，於37℃之恆溫槽中反應10分鐘。此時，將0.2ml溶劑替代各試料液而放入之作為對照組，作為陽性對照組而使用抗壞血酸(Ascorbic acid)。於該反應液中，每次分別以0.1ml之量加入2500單元/ml之酪氨酸酶溶液，再次於37℃之恆溫槽中反應10分鐘。將加入有該反應液之試管放入冰水中，快速冷卻並中止反應，藉由光電光譜分析儀而測定於波長475nm上之吸光度(Synergy2，BioTek(VT，美國))，其結果顯示於下表7。各自之酪氨酸酶抑制效果藉由以下公式3而算出。

[公式3]酪氨酸酶抑制率(%)=100-(試驗物質之反應吸光度/對照組之反應吸光度)×100

自上述表7之結果中，根據本發明之人參皂苷Rh4之酪氨酸酶，其抑制率遠遠高於公知之作為酪氨酸酶抑制劑之抗壞血酸，由此可知，其美白效果非常優秀。

[試驗例7]藉由B16/F10黑色素瘤細胞之黑色素生成抑制效果

將分別含人參皂苷Rh4及麴酸(Kojic acid)各0.1重量%之試料作為試驗物質，將其以規定濃度加入B16/F10黑色素瘤細胞(韓國細胞系銀行)之培養液，對其進行3天培養後去除培養液，以磷酸鹽緩衝液(PBS)進行洗滌並以1N氫氧化鈉(NaOH)溶解細胞，於405nm中測定吸光度(Synergy2，BioTek(VT，美國))。將未添加試驗物質之細胞作為對照組，藉由與於對照組中之黑色素含量進行比較而測定各試驗物質之黑色素生成抑制程度。依據公式4計算黑色素生成抑制率，其結果顯示於表8。

[公式4]黑色素生成抑制率(%)=100-(試驗物質之吸光度/對照組之吸光度)×100

自上述表8之結果中，根據本發明之人參皂苷Rh4，其黑色素生成抑制率遠遠高於公知之作為黑色素生成抑制劑之麴酸(Kojic acid)，可知其美白效果非常優秀。

[試驗例8]測定皮膚保濕力增加效果

為了測定人參皂苷Rh4對皮膚保濕力增加所產生之效果，利用上述劑型例1及比較劑型例1並按如下方式進行評估。

將40~50歲年齡段之乾燥皮膚類型之20名成年男女性以每組10名之方式分為2組，其分別與劑型例1和比較劑型例1之2個組相對應，將營養霜塗抹於被試者之面部，每天2次連續12週。於塗抹開始前、塗抹1週後、塗抹2週後、塗抹4週後以及停止塗抹2週後(共6週)時點，於恆溫恆濕條件(24℃，相對濕度40%)下，藉由皮膚水分量測定儀器(Corneometer CM825，C+K Electronic Co.，德國)而測定皮膚水分量。其結果顯示於下表9。表9之結果係表示以於試驗開始前夕測定之皮膚水分量測定值為基準，而於經過規定期間之處置後，其測定值之增加量之百分比。

自上述表9中，若塗抹比較劑型例1，則截止實施塗抹之第4週，其顯示出約30%左右之水分增加率，而於停止塗抹後，其皮膚水分量減少；與此相反，若塗抹含有人參皂苷Rh4之劑型例1，則於停止塗抹後，亦表現出大部分30%以上之皮膚水分增加率。藉此，可知含有人參皂苷Rh4之本發明之組成物，其皮膚保濕力效果優秀。

[試驗例9]測定角質形成細胞分化促進效果

為了瞭解人參皂苷Rh4之角質形成細胞之分化促進效果，依照以下方式，藉由吸光度而測定於角質形成細胞之分化時所生成之CE(Cornified Envelop)量。

首先，將完成一次培養之人體之角質形成細胞放入培養瓶並貼附於底部，該角質形成細胞分離自新生兒之表皮，繼而，將人參皂苷Rh4以5ppm之濃度處理至培養液，將其培養5天，直至細胞生長至底部面積之70~80%左右。此時，將低鈣(0.03mM)處理組和高鈣(1.2mM)處理組分別作為陰性對照組、陽性對照組。繼而，提取已培養之上述細胞，使用磷酸鹽緩衝液(PBS)(Phosphate buffered saline)洗滌後，添加1ml之含2%SDS(sodium dodecyl sulfate)和20mM濃度之DTT(Dithiothreitol)之10mM濃度之三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液(Tris-HCl，pH 7.4)而實施超聲波處理(sonication)、煮沸(boiling)、離心分離，將沈澱物重新懸浮於1ml之磷酸鹽緩衝液(PBS)，於340nm中測定吸光度(Synergy2，BioTek(VT，美國))。另外，部分提取完成超聲波處理後之上述溶液，測定其蛋白質含量，將其作為評估細胞分化程度時之基準。其結果顯示於表10。

自上述表10之結果中，可知若採用人參皂苷Rh4，則角質形成細胞之分化促進效果優秀。

[試驗例10]測定皮膚屏障功能恢復效果

為了測定人參皂苷Rh4對因皮膚受傷所致之受損皮膚屏障功能恢復所產生之效果，而執行以下實驗。藉由膠帶剝離(Tape Stripping)方法而向10名成年男女性之上臂施加皮膚屏障損傷，塗抹劑型例2及比較劑型例2之2個組，其分別藉由下表11之組成而製備，藉由Vapometer(Delfin，芬蘭)而進行測定和比較經表皮失水率(TWEL)之恢復程度，每天1次並連續7天。其中，比較劑型例2作為陰性對照組，其係賦形劑(vehicle)。試驗結果顯示於下表12。表12之結果係以100%為基準而比較屏障受損前和屏障受損後之處理差異。

自上述表12之結果中，若處理未含有人參皂苷Rh4之比較劑型例2，則隨著時間之推移，其經表皮失水率逐漸增加；相反，若處理含有人參皂苷Rh4之劑型例2，則經表皮失水率快速回歸正常程度，屏障損傷得以恢復。

[試驗例11]氣色改善效果

為了評估根據本發明之化妝品組成物之皮膚血液循環促進效果，藉由雷射都普勒血流成像儀(Laser Doppler Perfusion Imager；periscan PIM II，Perimed(stochholm，瑞典))而測定皮膚之血液循環程度。雷射都普勒血流成像儀係普遍公知之用於測定於皮膚中之血液循環之儀器，其係目前被使用之儀器，其不僅可測定於皮膚之毛細血管中之血液之速度和量，亦可測定於小動脈和小靜脈中之流動，屬非常敏感之設備。

於恆溫恆濕室中，使用香皂洗臉後，放鬆30分鐘，藉由雷射都普勒血流成像儀而測定初始值。首先，針對平時手腳發涼之30名女性，藉由雷射都普勒血流成像儀測定其額頭下端部分之初始血流量。繼而，安排被試者於1週期間內使用上述劑型例1及比較劑型例1，比較所測定之血流量和上述初始測定值，其結果(皮膚血流量變化)顯示於下表13。

[表13]

自上述表13之結果中，根據本發明之化妝品組成物，其相比於未含有人參皂苷Rh4之比較劑型例1，其顯著增加皮膚血流量，可知藉由此種血液循環之促進而使得氣色得到改善。總之，該結果表示根據本發明之含有人參皂苷Rh4之化妝品組成物，其可貢獻於有效傳遞皮膚之營養成分、抑制和延遲皮膚老化。

[試驗例12]膚色改善效果

為了瞭解上述劑型例1及比較劑型例1之膚色改善效果，安排30名被試者分別使用(晚1次/日，為期1週)，藉由Facial Stage DM-3(Moritex，日本)設備而評估膚色改善程度。關於膚色改善率，藉由測定皮膚之亮度及色彩測定值而以其變化值作為膚色改善率，其結果顯示於下表14。亮度及色彩變化值越大，表示其膚色改善程度越高。

自上述表14之結果中可知，未含有根據本發明之人參皂苷Rh4之比較劑型例1，其未顯示出顯著之膚色改善效能；相反，含有人參皂苷Rh4並將其作為有效成分之劑型例1，其相比於使用前之膚色，使用後之膚色得到很大改善。

[試驗例13]毛孔收縮效果

1. 藉由促進膠原蛋白生物合成之毛孔收縮效果

藉由與TGF-β之比較而測定根據本發明之人參皂苷Rh4之膠原蛋白生物合成促進效果。首先，將成纖維細胞(fibroblast)以每孔105個之方式播種(seeding)於24孔(well)，對其進行培養直至生長為90%左右。以無血清杜爾伯科改良伊格爾培養基培養基對其進行24小時之培養後，分別以10ng/ml處理溶解於無血清培養基之本發明之人參皂苷Rh4與TGF-β，於二氧化碳培養基中培養24小時。去除該些上層液，藉由膠原蛋白原型(I)ELISA試劑盒(procollagen type(I)；#MK101，TAKARA(Shiga，日本))而查看膠原蛋白原(procollagen)之增減與否。其結果顯示於表15，關於膠原蛋白之合成性能，其以非處理組100為基準顯示。

自上述表15之結果中可知，根據本發明之人參皂苷Rh4，其表現出高於作為陽性對照組之TGF-β之程度之優秀性。因而，可知根據本發明之人參皂苷Rh4可增加毛孔周圍之膠原蛋白生成量，從而縮小放大之毛孔。

2.毛孔收縮效果

為了瞭解劑型例1及比較劑型例1之毛孔收縮效果，按以下方式進行評估。選定毛孔變大之被試者男女共20名，分為2組每組各10名，各組成員在面部塗抹劑型例1及比較劑型例1之營養霜，每天塗抹連續4週。關於毛孔收縮之效果有關判定，藉由實驗前和實驗4週後之照片，由專家進行肉眼評估。其結果顯示於下表15(評估等級：0-未見縮小；5-大幅縮小)。

自上述表16之結果中可知，比較劑型例1不具有毛孔收縮效果，而劑型例1則表現出肉眼可看到之顯著之毛孔收縮效果，藉此可知，根據本發明之人參皂苷Rh4，其縮小毛孔大小之效果優秀。

[試驗例14]皮脂分泌抑制效果

藉由1. 5α-還原酶活性抑制之皮膚過分泌抑制效果

為了確認5α-還原酶(5α-reductase)活性抑制效果，測定於HEK293-5αR2細胞中由[¹⁴C]睾酮轉換為[¹⁴C]二氫睾酮(DHT：dihydrotestosterone)之比率。將p3 x FLAG-CMV-5αR2轉染至HEK293細胞，以每孔/2.5 x 105細胞之方式放入24孔板並進行培養(Park et al.，2003，JDS.Vol.31，pp.191-98)。次日，更換成加入酶基質與抑制劑之新之培養基。作為培養基之基質而使用0.05μCi[14C]睾酮(Amersham Pharmacia biotech，UK)。

為了確認5α-還原酶活性抑制程度，加入人參皂苷Rh4並於37℃、5%二氧化碳培養器中培養2小時。此時，將未加入人參皂苷Rh4之組作為陰性對照組，加入非那斯特萊(finasteride)之組作為陽性對照組。繼而，收取培養基，以800μl乙酸乙酯提取類固醇，分離其上部之有機溶劑層進行乾燥，將剩餘之殘留物再次以50μl乙酸乙酯進行溶解，於矽塑料片矽膠60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254)上，將乙酸乙酯-己烷(1：1)作為溶劑而展開。

於空氣中乾燥塑料試料後，為了測定同位元素之量而使用沐浴系統，將完成乾燥之塑料片和X射線膠片一同放入沐浴箱(bath cassette)，經過1週後測定殘留於膠片之睾酮和二氫睾酮之同位元素量，依據以下公式5及公式6而分別算出轉化率及抑制率，其結果顯示於下表16。

[公式5]轉換率(%)=DHT區域之放射能/總放射能×100

[公式6]抑制率(%)=(對照組之轉換率-試驗物質之轉換率)/對照組之轉換率×100

自上述表17之結果中，可知人參皂苷Rh4有效抑制5α-還原酶之活性，該5α-還原酶將睾酮轉換為二氫睾酮，使其與細胞質內之水溶體蛋白質相結合，進入核內並活化皮脂腺細胞，促進分化，起到於皮脂腺內過分泌皮脂之作用，藉此，可知人參皂苷 Rh4阻斷由睾酮轉換為二氫睾酮，其表現出比用於抑制5α-還原酶之活性之非那斯特萊更加優秀之抑制效果。因而可知，人參皂苷Rh4藉由有效抑制5α-還原酶之活性而抑制皮脂之過分泌。

2.皮脂分泌抑制效果

為了瞭解上述劑型例1及比較劑型例1之皮脂分泌抑制效果，按以下方式進行評估。選定認為皮脂分泌多之男女性被試者共30名，於指定部位塗抹劑型例1及比較劑型例1之營養霜，每天塗抹連續4週。關於皮脂減少之效果有關判定，藉由皮脂量測定儀器(Sebumeter SM810，C+K Electronic Co.，德國)而分別測定經過2週及4週後之平均皮脂減少率(%)，其結果顯示於下表18。

自上述表18之結果中可知，藉由含有本發明之人參皂苷Rh4而將其作為有效成分之劑型例1，相比於未含有其之比較劑型例1，其可有效抑制過量分泌之皮脂。

[劑型例3及比較劑型例3~4]

根據下表19所示之成分及含量(重量%)而製備劑型例3及比較劑型例3~4。具體而言，劑型例3中配合有人參皂苷Rh4，比較劑型例3中完全不含有用於改善痤瘡皮膚之有效成分，比較劑型例4係作為抗菌力有關基準之標準物質，含有多用作痤瘡治療劑之紅黴素(erythromycin)。

劑型例3及比較劑型例3~4之製備方法如下。完全溶解下表19之A之成分，於獨立之溶解槽中完全溶解B之成分，將B添加至A並實施混合溶解化。其中，按照表19所示之配比加入C之成分，均勻混合後過濾而製備本組成物。

[試驗例15]對痤瘡之抗菌力試驗

藉由以劑型例3及比較劑型例3~4之組成而製備之各化妝品組成物，對作為痤瘡病源菌株之痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)(ATCC 6919：培養基-BHI培養基(broth))進行抗菌力試驗。

痤瘡有關抗菌力試驗方法如下所示。

(1)試驗菌液準備

痤瘡丙酸桿菌使用接種於BHI培養基而進行厭氧培養之培養液。

(2)稀釋溶液準備

將0.15ml上述試驗菌液加入15ml之BHI培養基(pH 6.8)或LB培養基(pH 4.5)，均勻混合，作為稀釋溶液使用。

(3)試料準備

將以劑型例3及比較劑型例3~4製備之化妝品組成物原液直接作為試料而使用。

(4)抗菌力試驗

1)向96孔之細胞培養管(96 well plate)1號行，按照起始濃度，放入試料，作為稀釋溶液，以200μl為單位加入總量。

2)均勻混合1號行之混合液後，取100μl並放入2號行，均勻混合，再次提取100μl並放入3號行，實施兩倍稀釋(double dilution)。

3)於32℃中實施24小時及48小時靜置培養後，藉由懸浮程度而判斷菌之增殖與否，將沒有菌增殖之最小濃度作為最低抑制濃度(MIC，Minimum Inhibitory Concentration)值。若混合液不透明而難以判斷菌之增殖與否，則藉由顯微鏡觀察而進行確認。

痤瘡有關抗菌力試驗結果顯示於表20。最低抑制濃度換算成含於劑型之有效成分之濃度而進行標記。

最低抑制濃度之ppm濃度越小，其於痤瘡有關抗菌力方面可作為更有效之物質，劑型例3相比於使用作為公知之痤瘡治療劑之紅黴素之比較劑型例4，其ppm濃度明顯小，藉此可知，含有人參皂苷Rh4之組成物對試驗菌具有顯著優秀之抗菌力。

[試驗例16]脂質合成(Lipogenesis)抑制試驗

將老鼠之成纖維細胞系(fibroblast cell line)之3T3-L1細胞，以1×105細胞/孔之方式，附著於盛放含有10%之胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)之杜爾伯科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified eagle’s medium，GIBCO BRL，Life Technologes公司)培養基之6孔培養板(culture plate)。經過2天後，重新更換成新之杜爾伯科改良伊格爾培養基(含有10%之FBS)培養基，繼續培養2天。繼而，針對完成培養之上述細胞，以含有1μg/ml胰島素(insulin)、0.5mM IBMX及0.25μM地塞米松(dexamethasone)之杜爾伯科改良伊格爾培養基(含有10%之FBS)實施分化誘導，處理人參皂苷Rh4及咖啡因50μM，經過處理2天後，再次更換為包含胰島素之杜爾伯科改良伊格爾培養基，繼續培養5天。經過5天後，再次更換為正常培養基(杜爾伯科改良伊格爾培養基，含有10%之FBS)，一面觀察一面培養，直至上述細胞於形態方面變化為脂肪細胞。

為了評估人參皂苷Rh4之對脂肪細胞內脂肪堆積之抑制效能，藉由上述過程中完成分化之3T3-L1脂肪細胞，實施蘇丹III染色(S4136，sigma-aldrich)。將脂肪細胞於磷酸鹽緩衝液內以4%之多聚甲醛(pH 7.2)於常溫下固定後，以磷酸鹽緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)水洗，再以蘇丹III染色後，拍攝圖片並進行肉眼比較。對照組係僅使用未添加試驗物質或比較物質之培養基，作為其他比較組，則處理咖啡因50μM。關於脂肪堆積抑制程度，藉由將染色程度劃分為+++、++、+、-而賦予等級，此時，越接近+++，其意味著染色程度越高。其結果顯示於下表21。

自上述表21之結果中可知，根據本發明之人參皂苷Rh4，不僅脂肪細胞內堆積之脂肪之量少，而且相比於公知之作為脂質合成抑制物質之咖啡因，其具有更優秀之脂質合成抑制效果。因而，藉由抑制脂質合成而減少皮脂，從而可抑制痤瘡之生成。

[試驗例17]痤瘡改善與皮脂分泌減少以及刺激有無相關試驗

將患有痤瘡之30名被試者以每組10名之方式共分為3組，安排各組被試者分別使用以上述劑型例3及比較劑型例3~4製備之化妝品組成物。痤瘡改善尺度設置為1分至5分，1分為“不是”、3分為“一般”、5分為“非常是”。實驗結果以下表22之10名被試者之平均分數進行標記。

痤瘡消失時期係以所讀取之痤瘡消失之相應日數為基準，痤瘡再發有無係以一個月之後之結果為基準。皮脂分泌減少尺度設置為1分至5分，1分為“不是”、3分為“一般”、5分為“非常是”。實驗結果以下表22之10名被試者之平均分數進行標記。皮膚刺激之有無以(表現出刺激反應之人數)/(被試者總人數)表示。

自上述表22之結果中可知，劑型例3相比於比較劑型例3，其痤瘡未再發，整體上，其對痤瘡改善方面具有優秀之效果。另外，於含有抗菌力標準物質之比較劑型例4中，雖然表現出痤瘡改善效果，然而於使用過程中，其表現出強皮膚刺激性，其不適合長期使用，而根據本發明之組成物，則無刺激性，表現出可長期使用性。

[試驗例18]IL-8生成抑制效果

於實驗開始一天前，將皮膚角化上皮細胞(Normal human skin keratinocyte，NHEK，購買處：Lonza)按照5x104細胞/孔分散於96孔板後，於37℃、5%之二氧化碳培養器(incubator)中培養24小時。經過24小時後，以硫酸鹽緩衝液(PBS)洗滌2次細胞，更換為無血清KBM(無血清角質細胞培養基，serum free keratinocyte basement media)。向各個孔，按照下述表23之濃度處理人參皂苷Rh4，反應30分鐘後，分別處理PGSA(10μg/ml)、PGSA(50μg/ml)、PGSA(50μg/ml)+LPS(1μg/ml)。其中，PGSA(peptidoglycan from S.aureus)係提取自葡萄球菌之肽聚糖(peptidoglycan)，其係革蘭氏陽性(+)菌之細胞壁之主要組成成分，細菌之細胞膜成分可引發炎症。又，內毒素(LPS，lypopolysaccaride)係革蘭氏陰性(-)細菌之細胞膜主要組成成分，其係引發炎症之主要原因。

於37℃、5%之二氧化碳(CO2)培養器中培養24小時後，提取其培養液，針對白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)實施酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，其結果顯示於表23。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)使用製造公司(BD science)之實驗方法。

自上述表23之結果中可知，人參皂苷Rh4可明顯減少和抑制因PGSA和LPS而增加之IL-8之分泌。因而，本發明之皮膚外用劑組成物，藉由顯著減少因PGSA和LPS而增加之IL-8之分泌，從而可提供優秀之抗炎症效果。

[試驗例19]止癢評估

於實驗開始一天前，將角質形成細胞(細胞系名稱：HaCaT來源：ATCC)以4x104細胞/孔分散於96孔板，於37℃、5%二氧化碳培養器(incubator)中培養24小時。經過24小時後，使用漢克平衡鹽液(Hanks’Balanced Salt solution)緩衝液清洗(washing)2次96孔板後，將反應緩衝液(2μM Fluo-4-AM，20% pluronic acid，2.5mM probenecid)細胞。於37℃、5%之二氧化碳培養器中反應30分鐘，再於常溫下反應30分鐘後，使用漢克平衡鹽液緩衝液清洗2次，分別以如下述表24之濃度(%)之人參皂苷Rh4處理細胞。

反應10分鐘後，處理2U/ml胰蛋白酶(Trypsin)或5μM PAR-2活性肽(SLIGKV)，測定細胞內Ca2+濃度變化80秒鐘。關於細胞內Ca2+濃度變化測定，使用多功能酶標儀3(FlexStation3：Molecular Device，美國)。處理完人參皂苷Rh4和2U/ml胰蛋白酶(Trypsin)或5μM PAR-2活性肽(SLIGKV)後，測定Flex80秒鐘，求出所獲得之最小值與最大值之差值，將其與2U/ml胰蛋白酶或5μM PAR-2活性肽(SLIGKV)處理時之最小值與最大值之差進行比較，將鈣離子之細胞內流入相關抑制率(%)顯示於下表23。

自上述表24之結果中可知，因胰蛋白酶或PAR-2活性肽(SLIGKV)之鈣離子流入細胞內之量，隨著人參皂苷Rh4之處理而減少，藉由提高人參皂苷Rh4之濃度，可顯著減少鈣離子之流入。

因而，含有本發明之人參皂苷Rh4之皮膚外用劑組成物，其藉由有效抑制引發瘙癢之PAR-2活性，可提供優秀之止癢效果。

[劑型例4及比較劑型例5]

以下表25之組成製備洗髮乳。具體而言，將表面活性劑和雙硬脂酸乙二醇酯(ethylene glycol distearate)添加至純淨水，加熱至80℃並均勻溶解後，攪拌並逐步降溫至40℃，向上述混合物中加入根據本發明之有效成分和防腐劑、黏度調節劑、香料、毛髮調理劑後，攪拌並冷卻至室溫，完成製備。

[試驗例20]抗頭屑效果試驗

選定頭屑較多之19~35歲之男性24名，以每組12名之方式共分成2組，安排各組分別使用劑型例4及比較劑型例5之洗髮乳，連續使用1個月後，測定其頭屑減少率。

在開始試驗之前，使用一般洗髮乳洗髮，採集洗髮後2天內堆積之頭屑，測量其頭屑之重量，再分別使用劑型例4及比較劑型例5之洗髮乳每隔兩天洗髮1次，採集完成試驗後2天內堆積之頭屑，測量其頭屑之重量，兩者進行比較。此時，藉由真空吸入裝置自頭皮直接採集堆積之頭屑，依據以下公式7而求出頭屑減少率，其結果顯示於下表26。

[公式7]頭屑減少率(%)={試驗開始前頭屑重量(mg)-一個月後頭屑重量(mg)}/試驗開始前頭屑重量(mg)×100

自上述表26之結果中可知，含有人參皂苷Rh4之劑型例4表現出優秀之抗頭屑效果。

[試驗例21]頭皮瘙癢症防止效果試驗

選定具有較嚴重之頭皮瘙癢症之25歲~45歲之男女性共24名，每組以10名共分成2組，安排使用各劑型例4及比較劑型例5之洗髮乳，每3天1次連續使用2週，藉由以下評估基準而評估頭皮瘙癢症防止效果，其結果顯示於表27。

[評估標準]

非常優秀-5分

優秀-4分

一般-3分

不合格-2分

非常不合格-1分

[表27]

自上述表27之結果中可知，含有人參皂苷Rh4之劑型例4於防止頭皮瘙癢方面表現出更優秀之效果。

[試驗例22]毛囊毛乳頭細胞增殖效果

構成頭髮之角蛋白蛋白質由毛根部角蛋白形成細胞(keratinocyte)生成，此角蛋白形成細胞從毛乳頭細胞分化。為了評估本組成物之毛乳頭細胞之活性，在本發明中使用DP6(rat immortalized dermal papilla cell)細胞株(Wendy Filsell,Journal of Cell Science 107,1761-1772(1994))。本毛乳頭細胞株為將雄性PVG大鼠鬍鬚的毛根以顯微解剖(microdissection)方法進行分離而培養的細胞株，在含10% FBS(Fetal bovine serum)之DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium，Gibco BRL,Gaithersburg,MD,USA)中，保持於5%二氧化碳、37℃之培養器中培養24小時。將DP6放入96孔板，於37℃之培養器中培養24小時後，將本人參皂苷Y分別以5ppm,10ppm及20ppm之濃度處理。藥物處理經過24小時後，使用WST-1試劑盒(羅氏)而測定細胞增殖能力。其結果顯示於下表24。

自上述表28之結果中可知，處理人參皂苷Y的情況，毛乳頭細胞之增殖會增加，此濃度依存上有顯著性差異地增加可被確認。

[試驗例23]鉀離子通道活性增加效果評估

作為脫髮治療劑之米諾地爾(Minoxidil)被認為係潛在之粒線體鉀離子通道開放劑(K_ATP channel opener)，其係用於雄激素性脫髮之代表性藥物。為了評估此種米諾地爾之機制，使用如下試驗方法，即，於構成頭皮之真皮之成纖維細胞中處理用於堵塞粒線體鉀離子通道之甲苯磺丁脲(SIGMA AlDRICH，T0891)而抑制細胞增殖，再次打開鉀離子通道並恢復細胞增殖。

為了評估本組成物之作為粒線體鉀離子通道開放劑之功能，於本發明中使用成纖維細胞株之NIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell line)細胞株。本細胞株係將分離自NIH瑞士小鼠胚胎(Swiss mouse embryo)之成纖維細胞株以3T3協議進行天然永生之細胞株。上述細胞株於含10%之FBS之杜爾伯科改良伊格爾培養基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，美國)中，於保持5%二氧化碳、37℃之培養器中培養24小時。將NIH3T3放入96孔板，於37℃培養器中培養24小時後處理2.5mM甲苯磺丁脲，經過10分鐘後，將作為陽性對照組之10μM米諾地爾和人參皂苷Rh4分別以2.5ppm、5ppm及10ppm之濃度處理，藥物處理經過48小時後，使用WST-1試劑盒(羅氏)而測定細胞增殖能力。其結果顯示於下表29。

於上述表29之結果中可知，若處理人參皂苷Rh4，則恢復成纖維細胞之增殖，隨著所處理之人參皂苷Rh4之濃度增加，其細胞增殖能力亦增加，若以10ppm處理人參皂苷Rh4，則細胞增殖恢復程度達到處理米諾地爾之情況之程度。

[試驗例24]人參皂苷Rh4之黑色素生成促進效果試驗

向RPMI培養基添加5%之胎牛血清、100IU之青黴素G及0.2μM之TPA，將黑色素細胞(melan-a)向24孔板(24-well microtiter plate)按照50,000細胞/孔進行分散。次日，向分散之細胞以最終濃度10ppm或50ppm處理作為試驗物質之人參皂苷Rh4，作為陰性對照組處理0.1%之DMSO、作為陽性對照組處理100μM IBMX後，於37℃之溫度下培養3天。完成培養後，使用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗孔，按照每次100μl之量放入1N氫氧化鈉(NaOH)，溶解細胞內之黑色素。關於溶解之黑色素之吸光度，藉由平板培養測定儀器(microplate reader)於405nm中進行測定(Synergy2，BioTek(VT，美國))。人參皂苷Rh4之黑色素生成促進效果與對照組進行比較之結果顯示於下表30。

自上述表30之結果中可知，人參皂苷Rh4促進黑素細胞之黑色素合成，增加黑色素生成量，從而表現出優秀之黑色素生成促進效果。

[試驗例25]於人參皂苷Rh4之黑素細胞中之小眼畸形相關轉錄因子(MITF)及酪氨酸酶(tyrosinase)表現促進效果

藉由501mel之細胞株而向6孔板(6-well microtiter plate)按照500,000細胞/孔而進行分散，針對各孔，作為陰性對照組處理DMSO 0.1%、作為陽性對照組處理IBMX 100μM、以及作為試驗組以10ppm處理人參皂苷Rh4，於37℃溫度下培養24小時、48小時、72小時後獲取蛋白質。對於如此獲取之蛋白質，藉由小眼畸形相關轉錄因子(MITF)及酪氨酸酶抗體而實施免疫印跡。蛋白質提取和免疫印跡通常使用本領域技術人員採用之標準方法。完成免疫印跡後，其結果以陰性對照組之100為準進行比較，其結果顯示於下表31。

自上述表31之結果中可知，人參皂苷Rh4可提高黑素細胞中之小眼畸形相關轉錄因子(MITF)和酪氨酸酶蛋白質表現。

[試驗例26]人參皂苷Rh4之抗菌力評估

為了評估人參皂苷Rh4之抗菌力而實施抗菌實驗。具體方法如下所述。

用於試驗之金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株於胰酪腖大豆培養基(Tryptic Soy Broth)中進行培養，白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲黴菌(Aspergillus niger)菌株於沙保氏葡萄糖培養液(Sabouraud Dextrose Broth)中進行培養。將培養液1/100(白色念珠菌菌株為1/10)稀釋至各培養基之稀釋液作為試驗菌液而使用。黑曲黴菌將以按照2×108cfu/ml而製備之孢子懸浮液作為試驗菌液而使用。

向各15ml培養基添加0.15ml之上述試驗菌液，均勻混合並作為稀釋溶液而使用。

向96孔板(96 well plate)1號行中各放入試料16μl，各放入稀釋溶液184μl。向剩餘之孔，各放入稀釋溶液100μl。均勻混合1號行之混合液後，提取100μl並放入2號行，均勻混合後，再次提取100μl並放入3號行，藉由此方式而實施2倍稀釋。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)於32℃之恆溫槽中進行培養，白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲黴菌(Aspergillus niger)於25℃之恆溫槽中進行培養。

48小時後，藉由顯微鏡確認菌增殖與否和懸浮度，確定最低抑制濃度(MIC)值並將其結果顯示於下表32。

自上述表32之結果中可知，人參皂苷Rh4對各種菌株表現出抗菌力，藉此可預測，人參皂苷Rh4可於組成物內作為天然防腐劑或抗菌劑而發揮作用。

Claims

一種使用人參皂苷Rh4來製備美白用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備促進皮膚角質形成細胞分化用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備改善痤瘡用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備抑制脂質生成用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備氣色及膚色改善用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備皮膚毛孔收縮用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備皮脂分泌調節用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備抗頭屑用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備毛髮生長促進用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備白髮預防用組成物的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。
一種使用人參皂苷Rh4來製備化妝品用之天然防腐劑的用途，其中人參皂苷Rh4為其中唯一有效成分，且其含量為組成物總重量之0.001重量%~50重量%。