CN114324695B - 一种分析维生素k1的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种分析维生素K1的方法、试剂盒及其应用，属于化合物检测技术领域。本发明制备一种基于共价有机框架材料的磁性吸附材料用于富集维生素K1，并利用高效液相色谱串联质谱检测待测样品(如血清)中的维生素K1含量，该方法具有良好的检测灵敏度、准确性和稳定性，同时，本发明磁性吸附材料可回收重复使用，从而有效降低了使用成本，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种分析维生素K1的方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于化合物检测技术领域，具体涉及一种分析维生素K1的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

维生素K1，一种多环芳香酮，在天然绿色植物中广泛存在。维生素K1是体内凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ前体活化的必须物质，在临床上应用于凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症的防治以及梗阻性黄疸、胆瘘、慢性腹泻等所致出血，香豆素类、水杨酸钠等所致的低凝血酶原血症。维生素K1不同于其它的维生素，它是一种脂溶性的维生素，经肠道吸收以后，会产生一定的抗出血、生血作用，因此维生素K1又叫做止血维生素、凝血维生素。除此之外，维生素K1可以帮助葡萄糖磷酸化，从而提升身体对糖和钙质的吸收利用，起到预防骨质疏松的功效。因此，检测体内维生素含量对身体健康有重要借鉴意义。因此，维生素K1含量的检测可评估患者体内的营养状况，对维生素K1缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。

当前，高效液相色谱串联质谱检测血清中维生素K1含量的样品前处理方法多采用液液萃取和固液萃取方法，需经稀释、萃取、蒸发、氮气吹干、净化等步骤，过程繁琐，而且液液萃取难以实现高通量和自动化；固液萃取虽然能实现高通量，但其中样品萃取过程主要依靠SLE板来完成，耗材成本高，不利于临床的推广和使用。因此迫切需要一种具有操作简单、效率高、回收率高、成本低、人工工作量小等优点的维生素K1样品前处理方法，克服现有方法的不足，从而使高效液相色谱串联质谱检测血清中维生素K1的方法具备更高的灵敏度，保证检测结果的准确性和稳定性。

磁固相萃取是近年来发展起来的一种基于磁性或磁化材料作为吸附剂、外部磁铁作为快速分离的辅助、以及少量溶剂作为洗脱溶液的新型固相萃取技术。这种技术避免了传统固相萃取繁琐的过柱操作，解决了柱内易高压、填料易堵塞等问题，且引入的外部磁场大大简化了处理步骤，无需离心和沉淀。具有萃取时间短、回收率高、富集倍数高和溶剂消耗少等优点。磁性吸附材料是磁固相萃取的核心部分，其性能决定了萃取过程的灵敏度和选择性。共价有机框架材料(COFs)是一类新兴的以共价键连接而成的多孔晶体有机聚合物，具有结晶度及结构稳定性好、密度低、比表面积高、结构可设计等特点，在样品前处理领域具有广阔的应用前景。然而，目前基于共价有机材料对维生素K1进行磁固相萃取进而进行分析检测鲜有报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种分析维生素K1的方法、试剂盒及其应用。本发明制备一种基于共价有机框架材料的磁性吸附材料(COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl)用于富集维生素K1，并利用高效液相色谱串联质谱检测待测样品(如血清)中的维生素K1含量，该方法具有良好的检测灵敏度、准确性和稳定性，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种分析维生素K1的方法，所述方法包括：

基于HPLC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行维生素K1的检测；

其中，所述前处理方法中包括采用磁性吸附材料对待测样品中的维生素K1进行富集；所述磁性吸附材料基于共价有机框架材料制备得到，命名为COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl。

本发明的第二个方面，提供分析维生素K1的试剂盒，所述试剂盒包括：上述磁性吸附材料，所述磁性吸附材料基于共价有机框架材料制备得到，命名为COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl；需要说明的是，本发明的磁性吸附材料可回收重复使用，使用甲醇和水使用后即可恢复活性，用于下一次实验，从而延长磁性吸附材料使用寿命，降低使用成本。

所述试剂盒还包括维生素K1标准品；以及，

同位素标记的维生素K1-d₄作为同位素内标原料。

本发明的第三个方面，提供上述方法和/或试剂盒在维生素K1含量检测中的应用。

与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：

上述技术方案开发了一种基于磁性吸附剂(COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl)富集血清中维生素K1，并结合HPLC-MS/MS分析血清中维生素K1的含量的方法及试剂盒，经过试验证明，采用本发明的检测方法能够对血清中的维生素K1进行高灵敏、高准确性和稳定性的检测，同时，本发明磁性吸附材料可回收重复使用，从而有效降低了使用成本，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中维生素K1的色谱图；

图2为本发明实施例中维生素K1的标准曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前基于共价有机材料对维生素K1进行磁固相萃取进而进行分析检测鲜有报道。

有鉴于此，本发明经研发成功制备得到一种基于共价有机框架材料的磁性吸附材料(COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl)，其能够有效富集维生素K1，从而有利于后续高效液相色谱串联质谱的检测，同时该磁性吸附材料还具有良好的可回收性。

具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种分析维生素K1的方法，所述方法包括：

基于HPLC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行维生素K1的检测；

其中，所述前处理方法中包括采用磁性吸附材料对待测样品中的维生素K1进行富集；所述磁性吸附材料基于共价有机框架材料制备得到，命名为COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl。

本发明的又一具体实施方式中，所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。

所述COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl，其制备方法包括：

S1、基于溶剂热法合成COOH-Fe₃O₄：将FeCl₃、乙酸铵和柠檬酸钠置于醇液中分散均匀，采用溶剂热反应，经洗涤、分离、干燥后即得。

S2、基于室温合成法制备磁性吸附材料：将步骤S1制得的COOH-Fe₃O₄分散于含1，3，5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB)的乙腈溶液中，搅拌得COOH-Fe₃O₄@TAPB；将得到的COOH-Fe₃O₄@TAPB分散到含乙酸与2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛的乙腈溶液中，搅拌得COOH-Fe₃O₄@COFs，向所述COOH-Fe₃O₄@COFs加入DMF，分散均匀后，加入2-苯基苯硫酚，在避光环境下，通入惰性气体(如N₂)密封后采用紫外光源辐照，经离心、洗涤、干燥后即得。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S1中，

所述FeCl₃、乙酸铵和柠檬酸钠的质量比为0.5～2.0:1.5～5:0.1～1.0，优选为0.974:2.150:0.290；其中，所述FeCl₃为六水合三氯化铁。

所述醇液为乙二醇。

溶剂热反应条件为：在180～220℃反应10-20h，优选为在200℃反应16h。

所述洗涤具体为采用水(如去离子水)和乙醇交替洗涤，洗涤次数为2-3次；此时产物含有Fe₃O₄已具有磁性，因此可通过外部磁力将其分离；进一步的，在50-80℃条件下(真空)干燥10-20h，优选为60℃(真空)干燥12h。制备得到的COOH-Fe₃O₄为纳米粒子。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，

COOH-Fe₃O₄与TAPB的质量比为1:2-4，进一步优选1:2.82；

所述乙酸和2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛的体积质量比为0.1-1mL：100-150mg，优选为0.2mL：112mg。

所述紫外光源具体为波长365nm的紫外光，辐照时间控制为1-3h，优选为2h。反应液经离心后，产物用水洗涤3-4次，在50-80℃条件下(真空)干燥10-20h，优选为60℃(真空)干燥12h，即得。

采用上述制备方法获得的磁性吸附材料能够高效富集维生素K1，相较于现有其他磁性材料，其提取回收率更高；同时，本发明的磁性吸附材料还可以重复回收使用，从而有效降低使用成本，节约资源。

本发明的又一具体实施方式中，所述前处理方法包括：

将内标准品工作液加入待测样品中，然后向其中再加入上述磁性吸附材料进行富集，收集磁性吸附材料进行解析，解析液经吹干后，加入异丙醇超声，过滤后待用。

所述内标准品工作液具体为采用甲醇溶解同位素标记的维生素K1-d₄后即得。

本发明的又一具体实施方式中，所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：

液相色谱条件包括：

采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸的水溶液，流动相B相：含0.1％甲酸的甲醇溶液；

流动相流速为0.3～0.5mL/min(优选为0.4mL/min)；柱温为30～45℃(优选为40℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；

梯度洗脱方式具体为：0～1.0min，60％B，2.0～6.0min，98％B，6.5～8min，60％B。

质谱条件包括：

采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度330℃、正离子电压4500V。维生素K1质谱扫描离子对及电压见表1。

表1 维生素K质谱扫描离子对及电压

物质	母离子	子离子	透镜电压	碰撞电压
					维生素K1	269.15	91.18	40.08	115

本发明的又一具体实施方式中，提供分析维生素K1的试剂盒，所述试剂盒包括：上述磁性吸附材料，所述磁性吸附材料基于共价有机框架材料制备得到，命名为COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl；需要说明的是，本发明的磁性吸附材料可回收重复使用，使用甲醇和水使用后即可恢复活性，用于下一次实验，从而延长磁性吸附材料使用寿命，降低使用成本。

所述试剂盒还包括维生素K1标准品；以及，

同位素标记的维生素K1-d₄作为同位素内标原料。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法和/或试剂盒在维生素K1含量检测中的应用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一种分析维生素K1的方法，包括：

磁性吸附材料COOH-Fe₃O₄的合成：本实验采用溶剂热法制备了COOH-Fe₃O₄。准确称取0.970g FeCl₃·6H₂O，2.150g乙酸铵和0.290g柠檬酸钠加入到50mL乙二醇中，超声分散至形成均匀溶液，转移至100ml反应釜中，200℃反应16h，去离子水和乙醇交替洗涤三次，通过外部磁力分离，得到黑色沉淀物。60℃真空干燥12h，得到COOH-Fe₃O₄，以供下一步实验使用。

磁性吸附材料(COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl)的室温合成法：准确称取50mg COOH-Fe₃O₄纳米粒子，将其分散于5mL乙腈的1，3，5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB，141mg)溶液中进行搅拌，转速为800r/min，得到COOH-Fe₃O₄@TAPB。将得到的150mgCOOH-Fe₃O₄@TAPB分散到乙酸(0.2mL)与2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛(DVA，112mg)的5mL乙腈中进行搅拌，转速为800r/min，得到COOH-Fe₃O₄@COFs。将所得COOH-Fe₃O₄@COFs于10mL容器中，加入2.0mL DMF，超声分散均匀后，加入2-苯基苯硫酚(22.4mg)，在避光环境下，通入N₂ 10min，密封后用365nm紫外灯照射2h。反应液经离心后，产物用水洗涤四次，然后60℃真空干燥12h，即得COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl。

维生素K1(对照品)，纯度：99％。用同位素标记的维生素K1-d₄做内标，可以减小实验过程中带来的误差，提高准确性。

仪器：YS EXT 9900MD高效液相色谱串联质谱检测系统。

飞诺美Kinetex polor C18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)；流动相A:含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；柱温:40℃；流速:0.4mL/min。梯度洗脱:0～1.0min，60％B，2.0～6.0min，98％B，6.5～8min，60％B。

采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度330℃、正离子电压4500V。维生素K1质谱扫描离子对及电压见表1。

表1 维生素K质谱扫描离子对及电压

物质	母离子	子离子	透镜电压	碰撞电压
					维生素K1	269.15	91.18	40.08	115

对照品储备溶液的配制：维生素K1标准品用甲醇溶解，配制成终浓度为1mg/mL的储备液，此过程全程避光操作。维生素K1内标成品即为1μg/mL溶液。临用时，用甲醇稀释至所需浓度。

血清样本处理：取血清样品300μL加入棕色玻璃瓶中，用去离子水等比稀释，将内标准品工作液加入到样品中，称取2mg NH₂-Fe₃O₄@COFs-ILs加入待测样品中，室温下涡旋振荡10min，利用外部磁力分离混合液，收集磁性吸附剂，加入500μL乙酸乙酯，超声解析1.0min。解析液在40℃条件下氮气吹干后，用100μL异丙醇复溶，复溶后转入进样板，进行HPLC-MS/MS分析。回收的吸附剂分别用3.0mL甲醇和水洗涤之后用于下一次实验。

对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对检测限、定量限、准确度。

线性关系及检测限、定量限：维生素K1标准溶液与牛血清白蛋白(BSA)精确配制成10ng/mL的混合溶液，用BSA倍比稀释一系列不同浓度的标准曲线浓度。提取方法与样本相同，以维生素K1与VK1-d₄内标峰面积比值为纵坐标，以浓度为横坐标，构建校准曲线，得到回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检出限，(S/N)≥10对应的浓度作为定量限，得到维生素K1各物质的检出限和定量限，结果见表2。

表2 人血清中测定维生素K1含量方法的线性方程、检测限和定量限

提取回收率：选择临床样品，将其分为体积相同的3份，每份300μL。在其中1份样本中加入10μL不含待测物的空白试剂(甲醇色谱级或以上)，作为基础样本；而在另2份样本中各加入10μL不同浓度的待测物标准品溶液，加入后样本中的标准液浓度见表3，制成2个不同加入浓度的回收样本。要求加入标准液后低水平样本中的待测物在参考范围中间值附近，而高水平样本中的待测物达到参考范围上限。不同浓度下维生素K1的提取回收率结果准确、重现性好。

表3 人血清中测定维生素K1含量方法的提取回收率

将此材料对比了其它磁分散材料：GO@NH₂-Fe₃O₄、MWCNTs@Fe₃O₄。如表4和表5所示，本发明的材料对维生素K1表现出更高的提取回收率。

表4 GO@NH₂-Fe₃O₄对人血清中测定维生素K1含量方法的提取回收率

表5 MWCNTs@Fe₃O₄对人血清中测定维生素K1含量方法的提取回收率

用本实施例检测方法检测20例临床样本中维生素K1的含量。如下表5所示：

表5

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (12)

1.一种分析维生素K1的方法，所述方法包括：

基于HPLC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行维生素K1的检测；

其中，所述前处理方法中包括采用磁性吸附材料对待测样品中的维生素K1进行富集；所述磁性吸附材料基于共价有机框架材料制备得到，命名为COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl；

所述COOH-Fe3O4@COFs-Diphenyl，其制备方法包括：

S1、基于溶剂热法合成COOH-Fe3O4：将FeCl3、乙酸铵和柠檬酸钠置于醇液中分散均匀，采用溶剂热反应，经洗涤、分离、干燥后即得；

S2、基于室温合成法制备磁性吸附材料：将步骤S1制得的COOH-Fe3O4分散于含1，3，5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB)的乙腈溶液中，搅拌得COOH-Fe3O4@TAPB；将得到的COOH-Fe3O4@TAPB分散到含乙酸与2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛的乙腈溶液中，搅拌得COOH-Fe3O4@COFs，向所述COOH-Fe3O4@COFs加入DMF，分散均匀后，加入2-苯基苯硫酚，在避光环境下，通入惰性气体密封后采用紫外光源辐照，经离心、洗涤、干燥后即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测样品为受试者血清。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，

所述FeCl₃、乙酸铵和柠檬酸钠的质量比为0.5～2.0:1.5～5:0.1～1.0；其中，所述FeCl₃为六水合三氯化铁；

所述醇液为乙二醇；

溶剂热反应条件为：在180～220℃反应10-20h；

所述洗涤具体为采用水和乙醇交替洗涤，洗涤次数为2-3次；

通过外部磁力将磁性吸附剂进行分离；

在50-80℃条件下真空干燥10-20h。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，

所述FeCl3、乙酸铵和柠檬酸钠的质量比为0.974:2.150:0.290；

溶剂热反应条件为：在200℃反应16h；

在60℃真空干燥12h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，

COOH-Fe₃O₄与TAPB的质量比为1:2-4；

所述乙酸和2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛的体积质量比为0.1-1mL：100-150mg；

所述紫外光源具体为波长365nm的紫外光，辐照时间控制为1-3h；反应液经离心后，产物用水洗涤3-4次，在50-80℃条件下真空干燥10-20h，即得。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，

COOH-Fe3O4与TAPB的质量比为1:2.82；

所述乙酸和2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛的体积质量比为0.2mL：112mg；

所述紫外光源具体为波长365nm的紫外光，辐照时间控制为2h；反应液经离心后，产物用水洗涤3-4次，在60℃真空干燥12h。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理方法包括：

将内标准品工作液加入待测样品中，然后向其中再加入上述磁性吸附材料进行富集，收集磁性吸附材料进行解析，解析液经吹干后，加入异丙醇超声，过滤后待用；

所述内标准品工作液具体为采用甲醇溶解同位素标记的维生素K1-d₄后即得。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：

液相色谱条件包括：

采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸的水溶液，流动相B相：含0.1％甲酸的甲醇溶液；

流动相流速为0.3～0.5mL/min；柱温为30～45℃；进样量1～10μL；

梯度洗脱方式具体为：0～1.0min，60％B，2.0～6.0min，98％B，6.5～8min，60％B；

质谱条件包括：

采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度330℃、正离子电压4500V；维生素K1质谱扫描离子对具体为：母离子269.15，子离子91.18；透射电压为40.08，碰撞电压为115。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，液相色谱条件中，流动相流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样量为5μL。

11.分析维生素K1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：磁性吸附材料，所述磁性吸附材料基于共价有机框架材料制备得到，命名为COOH-Fe₃O₄@COFs-Diphenyl；

所述COOH-Fe3O4@COFs-Diphenyl，其制备方法包括：

S1、基于溶剂热法合成COOH-Fe3O4：将FeCl3、乙酸铵和柠檬酸钠置于醇液中分散均匀，采用溶剂热反应，经洗涤、分离、干燥后即得；

S2、基于室温合成法制备磁性吸附材料：将步骤S1制得的COOH-Fe3O4分散于含1，3，5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB)的乙腈溶液中，搅拌得COOH-Fe3O4@TAPB；将得到的COOH-Fe3O4@TAPB分散到含乙酸与2，5-二乙烯基-1，4-苯二甲醛的乙腈溶液中，搅拌得COOH-Fe3O4@COFs，向所述COOH-Fe3O4@COFs加入DMF，分散均匀后，加入2-苯基苯硫酚，在避光环境下，通入惰性气体密封后采用紫外光源辐照，经离心、洗涤、干燥后即得；

所述试剂盒还包括维生素K1标准品；以及，

同位素标记的维生素K1-d4作为同位素内标原料。

12.权利要求1-10任一项所述方法和/或权利要求11所述试剂盒在维生素K1含量检测中的应用。

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