CN116973488A - 一种血清中25-羟基维生素d的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种血清中25‑羟基维生素D的检测方法。该检测方法包括：将样本与硫酸锌、甲醇和乙腈混合制得沉淀液，过滤所述沉淀液制得滤液，采用SPE板纯化所述滤液，制得纯化样本；然后采用高效液相色谱法检测所述纯化样本。本发明首先解决了采用SPE板前处理血清样本时容易发生堵孔的问题，前处理方法高效、去除杂质能力强、氮吹时间短。进一步，通过SPE板前处理血清样本结合等度洗脱的高效液相色谱法实现了对血清中25‑羟基维生素D2和25‑羟基维生素D3的高灵敏度、高准确性检测，线性范围、重复性、稳定性、特异性等均满足相关要求。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种血清中25-羟基维生素D的检测方法。
背景技术
维生素是维持机体正常生理功能、维持细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物，是人体健康所必须的一类基本营养物质，在调节物质代谢过程中发挥重要作用。维生素D属于脂溶性维生素，是调节骨代谢的重要维生素，婴幼儿缺乏维生素D会导致佝偻病，成人缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素D时，体内维生素D负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。25-羟基维生素D半衰期较长，体内存在形式稳定且浓度较高，是监测体内维生素D营养水平的标志物。25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是25-羟基维生素D在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素D的检测指标，因此，监测人体内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，有助于评价人体维生素D的状况。
现有技术中，已有众多的诊断检测人血清中25-羟基维生素D的高效液相色谱方法，但是对血清样本预处理之后杂质干扰仍然较多。
发明内容
为了尽可能的去除杂质干扰物，使得高效液相色谱的进样中的25-羟基维生素D更加富集，提高高效液相色谱检测25-羟基维生素D的灵敏度和准确度，本发明采用SPE板对血清中25-羟基维生素D进行富集。本发明发现，采用SPE板处理血清时，经过蛋白沉淀的沉淀液经过SPE板时易出现堵孔现象。为解决这一技术难题，提出下述发明内容。
本发明提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，包括：
将样本与硫酸锌、甲醇和乙腈混合制得沉淀液，过滤所述沉淀液制得滤液，采用SPE板纯化所述滤液，制得纯化样本；然后采用高效液相色谱法检测所述纯化样本。
本发明通过对蛋白沉淀剂的大量筛选，发现选择硫酸锌、甲醇和乙腈的组合对血清样本进行沉淀时，过滤后的滤液中的蛋白等杂质经过SPE板时，不会发生堵孔现象，而且蛋白沉淀效果好，沉淀固体均匀分布在蛋白沉淀板底部。
此外，采用SPE板前处理的方式收集的洗脱液远远低于液液萃取的体积，大幅缩短了后续氮吹时间。
优选地，甲醇和乙腈的体积比为1：（0.8~1.2）。
在上述配比下，蛋白沉淀效果更佳。
优选地，以样本、硫酸锌、甲醇和乙腈的总体积计，硫酸锌的浓度为6~10mmol/L。
优选地，SPE板在使用前依次采用甲醇和50%（v/v）甲醇水溶液进行活化。
优选地，所述纯化包括：将所述滤液加入SPE板中，然后依次采用4%~6%甲醇水溶液以及45%~55%甲醇水溶液淋洗SPE板。
本发明进一步发现，选择4%~6%甲醇水溶液以及45%~55%甲醇水溶液作为淋洗液，能够进一步降低血清样本中的杂质干扰，提高SPE板对血清样本的纯化效果，使得加标回收率进一步提升。
更优选地，所述纯化包括：将所述滤液加入SPE板中，然后依次采用4.5%~5.5%甲醇水溶液以及48%~52%甲醇水溶液淋洗SPE板。
优选地，所述纯化还包括：在淋洗SPE板之后，采用甲醇洗脱，收集洗脱液，制得纯化样本。
优选地，采用350~450μL甲醇洗脱。
本发明进一步发现，在本发明的检测方法中，选择350~450μL甲醇洗脱时能够使得洗脱效果较好且减少后续氮吹时间，提高检测效率。
优选地，所述纯化还包括：收集洗脱液之后，采用氮气吹干所述洗脱液，而后用高效液相色谱法中的流动相复溶，制得纯化样本。
所述流动相为流动相A和流动相B的混合液。
优选地，氮气吹干的温度为55~65℃。
优选地，所述高效液相色谱法采用等度洗脱的方式检测所述纯化样本。
由于通过SPE板纯化后的血清样本中的杂质干扰较少，采用等度洗脱的方式即可实现血清中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的高灵敏度、高准确性、高重复性的检测效果。
优选地，等度洗脱的流动相包括：流动相A和流动相B；流动相A为乙酸水溶液，流动相B包括体积比为15~20:1:1的甲醇、异丙醇和异丁醇。
优选地，流动相B中还包含乙酸。
优选地，流动相A和流动相B的体积比为1:2.5~3.5。
本发明进一步对流动相的试剂组合以及体积比例进行优化，发现采用上述流动相以及体积比进行等度洗脱时，分离效果进一步提升。
在具体实施过程中，将校准品、质控品与样本进行一样的前处理。
在具体实施过程中，过滤沉淀液时可采用正压装置施加压力辅助。
在具体实施过程中，SPE板活化时可采用正压装置施加压力辅助。
在具体实施过程中，采用SPE板纯化所述滤液时可采用正压装置施加压力辅助。
在具体实施过程中，采用正压装置施加压力辅助甲醇洗脱。
优选地，控制采用正压装置时的流速为2s一滴。
优选地，控制采用正压装置时的压力为0.01~0.05 Mpa。
优选地，高效液相色谱检测中选择酝博C18 5μm 4.6×100mm色谱柱的检测效果更佳。
本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到本发明检测方法的其它较优实施方案。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明首先解决了采用SPE板前处理血清样本时容易发生堵孔的问题，本发明的前处理方法高效、去除杂质能力强、氮吹时间短。进一步，通过SPE板前处理血清样本结合等度洗脱的高效液相色谱法实现了对血清中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的高灵敏度、高准确性检测，线性范围、重复性、稳定性、特异性等均满足相关要求。
附图说明
图1是不同淋洗液组合的前处理效果图。
图2是对比例1蛋白沉淀板的照片。
图3是对比例2蛋白沉淀板的照片。
图4是实施例1蛋白沉淀板的照片。
图5是对比例3蛋白沉淀板的照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
由于人源样本难以获得，下述实施例采用BSA作为人血清的替代基质配制标准曲线的各个浓度点及质控。
下述实施例中的部分试剂和耗材如表1所示。
表1
设备如表2所示。
表2
实施例1
本实施例提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，包括如下步骤：
1、试剂配制
1.1 维生素D标准品及质控品配制
1.1.1 储备液配制
（1）购置的25-羟基维生素D2（BePure，MU-0005-1mg）具有准确的质量，无需称量，直接加入1mL（准确移取）甲醇，超声至25-羟基维生素D2完全溶解，得1.00mg/mL的25-羟基维生素D2储备液（SSC-D2），转移至1.5mL棕色小瓶中，贴标签，-20℃保存；
（2）购置的25-羟基维生素D3（BePure，MU-0010-1mg）具有准确的质量，无需称量，直接加入1mL（准确移取）甲醇，超声至25-羟基维生素D3完全溶解，得1.00mg/mL的25-羟基维生素D3储备液（SSC-D3），转移至1.5mL棕色小瓶中，贴标签，-20℃保存；
最终得到表3所示的储备液。
表3
1.1.2 替代基质H0配制
（1）精密量取45mL 10×PBS缓冲液，加入到405mL超纯水中混匀；
（2）分别称取抗坏血酸1000mg、绿原酸750mg、β-环糊精625mg，加入到步骤（1）配制的缓冲液中，超声充分溶解；
（3）称取25g牛血清白蛋白加入到步骤（2）配制的溶液中，超声充分溶解；
（4）精密量取50mL甲醇到步骤（3）的溶液中混匀，最终得到500mL带稳定剂的替代基质H0溶液。
1.1.3 校准品及质控品配制
（1）25羟基维生素D2/D3浓储液（SSC-D2/D3）配制
1）精密量取25μL SSC-D2和25μL SSC-D3加入到25mL棕色容量瓶中；
2）用甲醇定容至刻度线、并混合均匀，最终得到25mL 25羟基维生素D2/D3浓储液（SSC-D2/D3）。浓储液中各组分浓度为：D2：1000ng/mL；D3：1000ng/mL。
（2）校准品C6配制
1）精密量取180mLH0，加入到合适的玻璃容器中；
2）精密量取20mL SSC-D2/D3到步骤1）的容器中混匀，最终得到200mL校准品C6。C6中各组分浓度为：D2：100ng/mL；D3：100ng/mL。
（3）校准品C1-C5及质控品QCL、QCH配制
校准品C1-C5及质控品QCL、QCH由校准品C6和替代基质H0稀释得到，稀释比例见表4（此处以配制50mL为例）。
表4
配制后浓度如表5，配制好后，贴标签，-20℃保存。
表5
1.2 沉淀剂A的配制
以配制100mL的量为例，称取5.751g 七水硫酸锌（aladdin，Z111853-500g）放入100mL的容量瓶中，加适量超纯水进行超声至完全溶解，再用超纯水定容至刻度线，混合均匀，配制成0.2mol/L沉淀剂A，贴标签，常温保存。
1.3 沉淀剂B的配制
以配制400mL的量为例，用量筒分别准确量取200mL甲醇和200mL乙腈，放入一500mL的溶剂瓶中，超声混合均匀，配制成沉淀剂B，贴标签，常温保存。
1.4 流动相配制
流动相A液配制：用量筒准确移取500mL水，加入350μL乙酸溶液，混匀超声脱气，待用。
流动相B液配制：用量筒分别准确移取900mL色谱级甲醇、50mL色谱级异丙醇、50mL色谱级异丁醇，加入700μL乙酸溶液，混匀超声脱气，待用。
1.5 前处理试剂配制
（1）5%甲醇水130mL：用量筒分别量取6.5mL甲醇和123.5mL超纯水倒入合适的容器中混合均匀即可。
（2）50%甲醇水230mL：用量筒分别量取115mL甲醇和115mL超纯水倒入合适的容器中混合均匀即可。
（3）甲醇150mL：量取150mL HPLC级甲醇即可。
（4）复溶液10mL：用移液器分别量取7.6mL流动相B和2.4mL流动相A，放入合适容器中混合均匀即可。
2、前处理
（1）蛋白沉淀：在蛋白沉淀板各孔依次加入1200μL沉淀剂B和75μL 沉淀剂A，再在以上各孔中分别加入300μL校准品、质控品、样本，静置5min，用排枪吹打5次后，采用正压装置（压力约0.02Mpa）将沉淀液过滤至2mL深孔板中。
（2）SPE板活化：在SPE板各孔中加入900μL甲醇，采用正压装置保持2S一滴的流速流至近干，再加入900μL 50%甲醇水，保持2S一滴的流速流至近干，待用，丢弃废液。
（3）上样：在第（1）步的2mL深孔板中用排枪取1100μL 各样本加入已活化好的SPE板中，采用正压装置保持2S一滴的流速，流至近干，丢弃废液。
（4）淋洗：在上一步的SPE板各孔中加入1100μL 5%甲醇水，淋洗，再加入1100μL50%甲醇水，淋洗，以上两步均保持2S一滴的流速，流至近干，丢弃废液。
（5）洗脱：将SPE板放置到1mL96孔U型板上，在SPE板各孔加入400μL甲醇，收集洗脱液至U型板中，自然滴干后，采用正压装置压完残余液体即可。
（6）氮吹/复溶：将1mL96孔U型板放置于氮吹仪，60℃氮气吹干后，用复溶液80μL复溶。
（7）震荡：盖上96孔板垫，置于96孔板混匀仪中，1500rpm充分震荡5 min。
（8）检测：将96孔板置于LC中进行检测，LC参数如表6所示。
表6
3、检测结果
3.1 线性范围
按照上述检测方法处理待测产品校准品S1~S6溶液，每个浓度重复测试3次。参考公式计算线性回归的相关系数r。
xi：S1~S6的浓度；
yi：对应浓度溶液中校准品与其内标的峰面积比值均值。
接受标准：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数r均≥0.990。
实验结果如表7所示。
表7
结果表明，25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数R^2均≥0.990，满足接受标准；线性范围：维生素D2/D3:7ng/mL~100ng/mL。
3.2 重复性
使用已配制好的质控品，按照上述检测方法，每个样本重复测定10次，参考公式计算重复性的变异系数（CV）。
；
CV：重复性的变异系数；
：10次测量结果的平均值；
S：10次测量结果的标准差。
接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20%，高值质控品的变异系数CV≤15%。
实验结果如表8所示。
表8
结果表明，低值质控品的变异系数CV≤20%，高值质控品的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
3.3 HPLC血样精密度结果评价
混合低、中、高三个不同浓度的血样，低浓度样本25-羟基维生素D3含量小于15ng/mL；中浓度样本25-羟基维生素D3含量大于15ng/mL并且小于30ng/mL；高浓度样本25-羟基维生素D3含量大于30ng/mL或25-羟基维生素D2含量为未检出。在其中分别加入25羟基维生素D2标准品，使得低、中、高浓度混合血样的25-羟基维生素D2含量为分别为10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml。连续测试5天，每天每个浓度平行处理5份，分别计算5天测试含量的平均值、批内差和批间差。25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的批内和批间精密度评价结果分别如表9和表10所示。
表9
表10
结果表明，HPLC测试相同血样的25-羟基维生素D2/D3的批间批内精密度RSD均≤15%，批内批间精密度评价满足方法学要求。
3.4 HPLC基质效应结果评价
300μL血样前处理后测得峰面积A；300μL带基质的标样经前处理后测得峰面积B；150μL血样和150μL带基质的标样混合后经前处理测得峰面积C。
可接受标准：基质偏差（%）=（A+B）/2C（%），基质偏差≤±20%。
25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的测试结果分别如表11和表12所示。
表11
表12
结果表明，HPLC测试相同血样的25-羟基维生素D2/D3的基质效应均≤±20%，基质效应评价满足方法学要求。
3.5 HPLC血样干扰评价
按照表13配制贮存液。
表13
按照实验设计的干扰物浓度要求，在基础样本（混合血清）上添加一定量的干扰物贮存液作为测试样本，本实验方案添加量统一为基础样本的5%添加量。在基础样本（混合血清）中统一添加5%制备贮存液的溶剂作为对照样本，其添加体积与测试样本相同。每个样本重测5次，取均值。
按交互顺序分析测试标本和对照标本，即：C1T1C2T2C3T3C4T4C5T5。
若Dev%=（`Xtest-`Xcontrol）/`Xcontrol≤±15%，则潜在干扰物质对分析物的测定没有影响，否则可以判断潜在的干扰成立。
25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的测试结果分别如表14和表15所示。
表14
表15
结果表明，4个干扰物质对分析物测定的偏差Dev%均在接受标准范围内，4个潜在干扰物质对分析物的测定没有影响。
3.6 加标回收率
（1）血清样本本底测试：取两种不同的混血，分别取300μL血清各4个，按照上述检测方法使用已配制好的校准品测试血清中25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2本底含量。
（2）加标样本配制：取270μL的混合血清样本，分别加入浓度为24ng/mL、48ng/mL、96ng/mL的低、中、高两种水平的25-羟基维生素D2/D3的标准品30μL，待用。
（3）按照上述检测方法使用已配制好的校准品测试血清加标后的样本。
接受标准：加标回收率80%~120%。
25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的测试结果分别如表16和表17所示。
表16
表17
结果表明，25-羟基维生素D3的加标回收率为100%~115%，25-羟基维生素D2的回收率为87%~107%，均在范围内，满足要求。
3.7 实际样本检测
按照上述检测方法使用已配制好的校准品测试实际人血样本49例，数据如表18所示。
表18
/>
综上所述，本发明的检测方法25-羟基维生素D2线性范围为7~100ng/mL、25-羟基维生素D3线性范围为7~100ng/mL，相关系数均≥0.990；低值质控品重复性的变异系数（CV）≤20%，高值质控品重复性的变异系数（CV）≤15%；准确度的相对偏差（B）≤±15%，加标回收率为80%~120%，均满足其检测要求。
实施例2
本实施例提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：
在前处理中，（4）淋洗分别采用不同比例的淋洗液进行淋洗，具体地，分别仅采用3%、8%的甲醇水溶液替换实施例1中的5%甲醇水，仅采用40%、60%的甲醇水溶液替换实施例1中的50%甲醇水完成淋洗。
结果如图1所示，1号谱图的淋洗液为3%甲醇水+50%甲醇水；2号谱图的淋洗液为8%甲醇水+50%甲醇水；3号谱图的淋洗液为5%甲醇水+40%甲醇水；4号谱图的淋洗液为5%甲醇水+60%甲醇水；5号谱图的淋洗液为实施例1的5%甲醇水+50%甲醇水。
结果发现，选择5%甲醇水溶液和50%甲醇水溶液作为淋洗液，能够进一步降低血清样本中的杂质干扰，提高SPE板对血清样本的纯化效果，使得加标回收率进一步提升。
对比例1
本对比例提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：将沉淀剂A替换为等体积的饱和硫酸铵溶液。
结果发现，在前处理过程中，蛋白沉淀效果较差，过滤时固体沉淀不均匀，蛋白沉淀板容易发生堵孔现象（图2），导致沉淀液不能完全过滤，影响下一步的上样量。
对比例2
本对比例提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：不加沉淀剂A。
结果发现，在前处理过程中，过滤沉淀液时，固体沉淀为偏黄色，且过滤时沉淀不够松散，个别孔容易结块，发生堵孔现象（图3）。而实施例1的前处理过程中，固体沉淀比较松散，过滤时不会出现堵孔现象（图4）。
对比例3
本对比例提供了一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：将沉淀剂B甲醇：乙腈（1：1）替换为等体积的甲醇。
结果发现，在前处理过程中，蛋白沉淀效果较差，过滤时固体沉淀不均匀，蛋白沉淀板容易发生堵孔现象（图5），导致沉淀液不能完全过滤，影响下一步的上样量。且测试回收率较低，不满足方法学验证要求，数据如表19所示。
表19 不同沉淀剂测试回收率结果
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括：
将样本与硫酸锌、甲醇和乙腈混合制得沉淀液，过滤所述沉淀液制得滤液，采用SPE板纯化所述滤液，制得纯化样本；然后采用高效液相色谱法检测所述纯化样本。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，甲醇和乙腈的体积比为1：（0.8~1.2）。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，以样本、硫酸锌、甲醇和乙腈的总体积计，硫酸锌的浓度为6~10mmol/L。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的检测方法，其特征在于，SPE板在使用前依次采用甲醇和甲醇水溶液进行活化。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述纯化包括：将所述滤液加入SPE板中，然后依次采用4%~6%甲醇水溶液以及45%~55%甲醇水溶液淋洗SPE板。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述纯化还包括：在淋洗SPE板之后，采用甲醇洗脱，收集洗脱液，制得纯化样本。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述纯化还包括：收集洗脱液之后，采用氮气吹干所述洗脱液，而后用高效液相色谱法中的流动相复溶，制得纯化样本。
8.根据权利要求1~3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用等度洗脱的方式检测所述纯化样本。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，等度洗脱的流动相包括：流动相A和流动相B；流动相A为乙酸水溶液，流动相B包括体积比为15~20:1:1的甲醇、异丙醇和异丁醇。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，流动相A和流动相B的体积比为1:2.5~3.5。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117630233A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 一种全血中25-羟基维生素d的检测方法 |
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