CN115436544A - 维生素d供试品溶液的制备方法及维生素制品中维生素d的检测方法 - Google Patents
维生素d供试品溶液的制备方法及维生素制品中维生素d的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种维生素D供试品溶液的制备方法，包括待测样品DMSO超声溶解和甲醇定容两个步骤，能够大幅缩短维生素D供试液制备时间，有利于后续检测过程中降低维生素D含量测试误差，最终能够实现准确反映被检测样品中维生素D真实含量的目的。解决了现有技术中样品前处理过程复杂且耗时长的问题。同时，本发明的维生素D供试液制备方法还能够节约检测成本，亦有利于提升整个检测方法的效率。此外，本发明还涉及一种维生素D检测方法，仅采用高效液相色谱的反相检测系统，进一步节省检测时间、节省检测成本的同时，还具有专属性更强、线性更佳、重复性更佳、准确度更高、稳定性更强、检出限更低、精密度更好的优势。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种维生素D供试品溶液的制备方法。同时，本发明还涉及一种维生素制品中维生素D的检测方法。
背景技术
维生素D，一种脂溶性维生素，乃环戊烷多氢菲类化合物，一组结构上与固醇有关，功能上可防止佝偻病的维生素，最主要的是维生素D3与D2。维生素D 的主要功用是促进小肠粘膜细胞对钙和磷的吸收，有利于新骨生成和钙化。此外，维生素D还有促进皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能作用。一般成年人经常接触日光不致发生缺乏病，婴幼儿、孕妇、乳母及不常到户外活动的老人要增加维生素D供给量到每日10μg(相当于400国际单位)。由此，维生素D的含量检测，成为必不可少的环节。
目前，普遍采用国标GB5009.82-2016皂化法进行维生素D的含量检测，但该检测方法存在检测步骤繁琐、检测前处理复杂、检测专属性不强、测试周期长等问题。尤其是检测前处理步骤，包括皂化处理、石油醚提取、洗涤、浓缩步骤，存在过程复杂且耗时长的问题。另外，由于维生素D本身不稳定、易氧化、易分解的性质，冗长的时间会导致维生素D含量测试误差加大，无法准确反映被检测样品中维生素D的真实含量。
CN110632203A涉及一种同步快速检测维生素A、维生素D3和维生素E的方法，包括如下步骤：(1)采用二甲基亚砜提取待测样品中的维生素A、维生素 D3和维生素E，得到的提取液经正己烷震荡萃取、浓缩、复溶后得到样品溶液； (2)配制维生素A、维生素D3、维生素E的标准溶液，按照浓度梯度配制多份标准系列溶液；(3)采用高效液相色谱法对所述样品溶液和标准品溶液进行检测分析，利用外标法得到维生素A、D3、E的含量。该检测方法可实现维生素A、D3、 E的同步检测，能够大幅缩短样品前处理时间，提高工作效率，同时提高了检测精度，降低实验室成本。
CN114324648A公开了含维生素D3的制剂中有关物质的高效液相检测方法及供试品溶液的制备方法，本发明供试品溶液的制备方法提取率高、且重现性好，适于推广应用；且供试品溶液制备方法用到的有机溶剂种类相对较少、毒性相对较低，减少了实验人员的操作风险。本发明首次采用反相高效液相系统对含低剂量维生素D3的制剂中的有关物质进行检测，相比现有技术中的正相检测系统，其专属性更强、重现性更好、灵敏度更高，采用本发明的梯度洗脱方式，各主峰与杂质峰均可被检出并良好分离，并且主峰的响应度高，可有效控制含维生素 D3的制剂的质量。
CN110632203A和CN114324648A均用其他步骤代替了皂化反应且用其他步骤代替了石油醚提取步骤，在一定程度上缩短了样品前处理时间，对于提高检测效率有一定程度的提升。但是，两者对于样品前处理的处理时间仍有些许过长，且均未对检测方法的稳定性进行验证。
鉴于此，开发一种能够大幅缩短维生素D供试液制备时间的方法，以降低维生素D含量测试误差，实现准确反映被检测样品中维生素D真实含量目的，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维生素D供试液制备的制备方法，以大幅缩短缩短维生素D供试液制备时间、降低维生素D含量测试误差，最终实现准确反映被检测样品中维生素D真实含量目的。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种维生素D供试品溶液的制备方法，用于维生素制品中维生素D的检测，包括下列步骤：
S1：向所述维生素制品中加入二甲基亚砜，后超声提取，得到提取液；
S2：向所述提取液中加入甲醇，后过滤得到滤液，即得。
作为进一步技术方案，所述维生素制品为维生素D含片、维生素D咀嚼片、维生素D颗粒剂和维生素D片剂中的任意一种。
优选的，所述维生素D包括维生素D2或维生素D3。
优选的，步骤S1中，所述维生素制品与所述二甲基亚砜的质量比为1：1.1～11。
优选的，步骤S1中，超声时间为10～30min；优选的，超声时间为10min。
优选的，步骤S2中，所述维生素制品与所述甲醇的质量比为1:11.9～79.1。
优选的，步骤S2中，过滤选用0.22μm滤膜或0.45μm滤膜。
同时，本发明还提供了一种维生素制品中维生素D的检测方法，具体技术方案如下：
一种维生素制品中维生素D的检测方法，包括下列步骤
a、制备维生素D供试品溶液：按照权利要求1～8任一所述的制备方法制备得到维生素D供试品溶液；
b、制备维生素D标准储备溶液，后按照浓度梯度配制多份维生素D标准系列溶液；
c、高效液相色谱检测：采用高效液相色谱法对所述维生素D供试品溶液和多份所述维生素D标准系列溶液进行检测，根据检测结果计算得到维生素的含量。
优选的，步骤b中，所述维生素D标准储备溶液的浓度为100ug/mL和/或多份维生素D标准系列溶液的浓度分别为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL。
优选的，步骤c中，高效液相色谱法的条件为以下(i)至(vi)中的一项或多项：
(i)色谱柱：C18柱，内径4.6mm，粒径5μm；
(ii)柱温：30～40℃；
(iii)流动相：包括流动相A和流动相B；所述流动相A为甲醇，所述流动相B为水；所述甲醇与所述水的体积比为95：5；
(iv)流速：0.8～1.2mL/min；
(v)检测波长：264nm；和
(vi)进样量：100μL。
本发明的有益效果为：
相比于现有技术，本发明的维生素D供试液制备方法仅包括待测样品DMSO 超声溶解和甲醇定容两个步骤，能够大幅缩短维生素D供试液制备时间，有利于后续检测过程中降低维生素D含量测试误差，最终能够实现准确反映被检测样品中维生素D真实含量的目的。解决了现有技术中样品前处理过程复杂且耗时长的问题。其次，本发明的维生素D供试液制备方法有利于提高维生素D检测的效率。最后，本发明的维生素D供试液制备方法节省了现有技术中的试剂用量，节约了检测成本。
此外，本发明的维生素D检测方法，仅采用高效液相色谱的反相检测系统，进一步节省检测时间、节省检测成本的同时，还具有专属性更强、线性更佳、重复性更佳、准确度更高、稳定性更强、检出限更低、精密度更好的优势。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1.1中维生素D3标准系列溶液的高效液相色谱图；
图2为实施例1.1中两份供试品溶液的高效液相色谱图；
图3为实施例1.1中标准曲线图；
图4为实施例1.2中维生素D3标准系列溶液的高效液相色谱图；
图5为实施例1.2中两份供试品溶液的高效液相色谱图；
图6为实施例1.3中维生素D3标准系列溶液的高效液相色谱图；
图7为实施例1.3中两份供试品溶液的高效液相色谱图；
图8为实施例2中维生素D3标准系列溶液的高效液相色谱图；
图9为实施例2中三份供试品溶液的高效液相色谱图；
图10为实施例3中维生素D3标准系列溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图；
图11为实施例4的标准曲线图；
图12为实施例5中维生素D3标准系列溶液的高效液相色谱图；
图13为实施例5中六份供试品溶液的高效液相色谱图；
图14为实施例6中维生素D3标准系列溶液的高效液相色谱；
图15为实施例6中六份供试品溶液的高效液相色谱图；
图16为实施例7中第一标准品稀释液的色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
本发明的实验材料为优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊，为非市售产品，故提供其制备工艺如下：步骤一，称量：称取盐酸氨基葡萄糖400g、硫酸软骨素钠 297.3g、柠檬酸钙490g、维生素D3粉1.7g、维生素K2粉5g、硬脂酸镁6g，备用。步骤二，预混：将柠檬酸钙、盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠混合均匀，得到第一预混物；将维生素D3粉、维生素K2和硬脂酸镁混合均匀，得到第二预混物；步骤三，干法制粒：将第一预混物进行干法制粒，设置压辊压力为10Mpa，过1.5mm筛网，收集颗粒，得到干法制粒物；步骤四，将第二预混物与干法制粒物加入混合机中，混合20min，转速8转/分钟，得到总混颗粒；步骤五，充填：将总混颗粒与明胶空心胶囊置于全自动胶囊充填机中，充填胶囊，控制每粒胶囊内容物重量为0.6g±5％，即得。
无水乙醇、氢氧化钾均为分析纯，购自天津市天力化学试剂有限公司。分析纯抗坏血酸、分析纯甲醇，购自天津市东丽区天大化学试剂厂。2,6-二叔丁基对甲酚为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂。石油醚(沸程为30℃-60℃)，分析纯，购自天津市津东天正精细化学试剂厂。无水硫酸钠为分析纯，购自天津市致远化学试剂有限公司。色谱纯甲醇，购自湖北费顿科学技术有限公司。D-氨基葡萄糖盐酸盐购自浙江金壳药业股份有限公司。硫酸软骨素钠盐购自江阴技源药业有限公司。维生素K2粉剂购自广东双骏生物科技有限公司。柠檬酸钙购自郑州瑞普生物工程有限公司。硬脂酸镁购自湖州市菱湖新望化学有限公司。
本发明所用的仪器设备如下：高效液相色谱仪，型号：Agilent1260Infinity Ⅱ。有机系过滤头(孔径为0.45μm)。分析天平，型号：XSR-105DU梅特勒-托利多。分析天平，型号：GL2204B上海佑科仪器仪表有限公司。恒温水浴振荡器，型号：DK-S26。电热恒温水浴锅，型号：HH-S4A，北京科伟永兴仪器有限公司。旋转蒸发仪，型号：R100。超纯水机，型号：UPT-Ⅱ-10，上海杳森仪器设备有限公司。
实施例1本发明检测方法与国标法、CN110632203A方法的检测结果对比
实施例1.1采用国标法测定优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊中维生素D3含量
1.1.1待测样品配制
1.1.1.1氢氧化钾溶液的制备：称取100g氢氧化钾，加入100mL水溶解，冷却备用。
1.1.1.2维生素D3标准系列溶液和维生素D2标准中间使用液的制备，其制备方法如下：
维生素D2标准储备溶液：准确称取维生素D2标准品10.0mg，用色谱无水乙醇溶解并定容至100mL，使其浓度为100ug/mL，于-20℃冰箱中密封保存。
维生素D2标准中间使用液：准确吸取回温至室温的维生素D2标准储备溶液10.00mL，用流动相稀释并定容至100mL棕色容量瓶中，混匀即得。其中，流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为甲醇，流动相B为水；甲醇与水的体积比为95：5。
维生素D3标准储备溶液：准确称取维生素D3标准品10.0mg，用色谱无水乙醇溶解并定容至100mL，使其浓度为100ug/mL，于-20℃冰箱中密封保存。
维生素D3标准中间使用液：准确吸取回温至室温的维生素D3标准储备溶液10.00mL，用流动相稀释并定容至100mL棕色容量瓶中。其中，流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为甲醇，流动相B为水；甲醇与水的体积比为95： 5。
维生素D3标准系列溶液：分别准确吸取维生素D3标准中间使用液0.50mL、 1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、10.00mL于100mL棕色容量瓶中，分别精密加入维生素D2标准中间使用液5.00mL，用甲醇定容至刻度。此标准系列溶液浓度分别为0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.40μg/ml、0.60μg/ml和1.00μg/ml。
1.1.1.3供试品溶液制备
取供试品优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊20粒，倾出内容物，研细，混匀，分别精密称取1.0g样品于250mL具塞锥形瓶中；共取两个试样，两个试样的取样量分别为1.0504g、1.0501g。分别加入20mL、40℃的温水，加入0.25mL维生素D2标准中间使用液，再加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT，混匀。分别加入30mL 无水乙醇，混匀，再加入10mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于恒温振荡水浴锅中80℃振荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
将冷却后的皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中，加入50mL石油醚，振荡萃取5min，将下层溶液转移至另一250mL分液漏斗中，加入50mL的石油醚再次萃取，合并醚层。用纯化水洗涤醚层，并用pH试纸检测下层水溶液 pH值，直至其洗至中性。
将洗涤后的醚层经3g无水硫酸钠滤入500mL旋转蒸发瓶中，用约15mL的石油醚冲洗分液漏斗和无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶中，并将其接在旋转蒸发仪上，于40℃水浴中进行减压蒸馏，待瓶中醚液剩下约2mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至5mL棕色容量瓶中，定容至刻度，作为供试品溶液，溶液过0.45μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
1.1.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液和两份供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D2和维生素D3的峰面积。其中，色谱柱型号为 WatersSymmetry-C18、5μm、4.6×250mm；柱温为35℃；流速为1ml/min；进样体积为100μL；检测波长为264nm；流动相A为甲醇、流动相B为水，两者体积比为95：5。图1和图2分别为维生素D3标准系列溶液的色谱图、供试品溶液的色谱图。其中，图2(a)和图2(b)分别对应两份供试品溶液的色谱图。需要说明的是，图1仅给出了其中一份维生素D3标准系列溶液的色谱图，下述实施例亦如此。表1示出了维生素D3标准系列溶液中维生素D2和维生素D3的峰面积，表2示出了供试品溶液中维生素D2和维生素D3的峰面积。
表1六份维生素D3标准系列溶液样品中维生素D2和维生素D3的峰面积
表2两份供试品溶液样品中维生素D2和维生素D3的峰面积
表3六份维生素D3标准系列溶液样品中维生素D3峰面积与维生素D2的峰面积比值
根据表1中维生素D2和维生素D3的峰面积，可得到维生素D3标准系列溶液样品中维生素D3峰面积与维生素D2峰面积的比值(表3)。采用内标法定量，以维生素D3标准系列溶液浓度为横坐标，以维生素D3峰面积与维生素D2峰面积比值的平均值为纵坐标绘制标准曲线(如图3)，得回归方程： Y＝2.0959X+0.0015，R2＝0.9999。需要说明的是，后续实施例均不再提供标准曲线图，仅提供回归方程。
接下来，计算两份样品中维生素D3含量。样品中维生素D3含量计算公式为
其中，X为试样中维生素D3的含量，单位为μg/g；C为根据标准曲线计算得到的试样中维生素D3的进样浓度，单位为μg/mL；V为定容体积，单位为 mL；m为试样的称样量，单位为g。根据上述公式计算样品中维生素D3含量，结果为：两份样品中维生素D3的含量分别为3.3297μg/g、3.3420μg/g，平均值为 3.3358μg/g。
综合上述结果可知，样品采用恒温水浴振荡皂化处理后，不进行正向高效液相色谱半制备，直接反向色谱分离检测，六份维生素D3标准系列溶液和两份供试品溶液中维生素D2、维生素D3保留时间一致，且良好分离，说明该方法可行。
实施例1.2采用本发明的方法测定优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊中维生素D3含
量。
1.2.1待测样品配制
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。供试品溶液的制备方法为：取供试品20粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取1.0g 试样置于25mL棕色容量瓶中；其中，共称取两份试样，两份试样的称取量分别为1.0002g、1.0013g。分别向两份试样中加3mLDMSO，涡旋浸润样品后超声 10min，取出，放至室温后，用甲醇定容至刻度，混匀后过0.45μm滤膜，取滤液作为供试品溶液。
1.2.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液和两份供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。待测样品的检测方法同实施例1.1.2。图4 和图5分别为维生素D3标准系列溶液的色谱图、供试品溶液的色谱图。其中，图5(a)和图5(b)分别对应两份供试品溶液的色谱图。表4和表5示出了维生素D3标准系列溶液和供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表4六份维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积
表5两份供试品溶液中维生素D3的峰面积
以维生素D3标准品浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并得出标准曲线方程。标准曲线方程为Y＝270.1503X-0.3035，R2＝0.9999。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，结果为：两份样品中维生素 D3的含量分别为3.2067μg/g、3.2430μg/g，平均值为3.2248μg/g。
实施例1.3采用CN110632203A的方法测定优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊中维生
素D3含量。
1.3.1待测样品配制
需要说明的是，维生素D3标准系列溶液的浓度是根据待测样品的含量来调整的，同时为了对检测结果进行有效对比，故本实施例未采用CN110632203A中的浓度，而是采用与实施例1.1与实施例1.2相同的维生素D3标准系列溶液。本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。
供试品溶液的制备方法为：取供试品20粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取1.0g置于500mL棕色平底烧瓶中，向待测样品中加入30mL的DMSO，置于35℃水浴温度的超声仪中超声提取30min，超声过程中旋摇2-3次以防样品附着瓶底；取出放置冷却至室温，准确加入70mL正己烷，加盖，设置300次/min 的频率剧烈振摇15min，静置分层后再次准确加入70mL正己烷，重复提取一次，静置；待正己烷层变澄清透明，且中间乳化层消失以后，将全部正己烷层萃取液经析相分离纸过滤，备用。将滤液置于旋转蒸发器烧瓶中，在20℃条件下缓慢真空蒸发至近干；残渣用甲醇溶解，并稀释至25mL，过0.45μm微孔滤膜，得到待测供试品溶液。
1.3.2待测样品高效液相色谱仪测定
需要说明的是，CN110632203A是为了实现三种维生素的检测，故检测波长设置为325nm，264nm以及285nm三个波长同时检测，本实施例的样品仅涉及维生素D3，故仅设置264nm的检测波长。CN110632203A与本实施例的色谱柱、流速是相同的。实施例10已证实柱温对于本申请的检测方法并无影响，故本实施例依然采用柱温为35℃作为检测条件之一。进样量是根据待测样品的含量来调整的，同时为了对检测结果进行有效对比，故本实施例采用100μL的进样量。由于本申请的检测方法中流动相设置与CN110632203A相差甚微，故采用体积比为甲醇：水＝95：5作为本实施例的流动相。关于等度洗脱和反相液相色谱，本申请的检测方法与CN110632203A相同。综上，本实施例的色谱分析条件与实施例1.1.2相同。
将六份维生素D3标准系列溶液和两份供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。图6和图7分别为维生素D3标准系列溶液的色谱图、供试品溶液的色谱图。其中，图7(a)和图7(b)分别对应两份供试品溶液的色谱图。表6和表7示出了维生素D3标准系列溶液和供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表6六份维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积
表7两份供试品溶液中维生素D3的峰面积
以维生素D3标准品浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并得出标准曲线方程。标准曲线方程为Y＝240.5588X-0.4185，R2＝0.9999。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，结果为：两份样品中维生素 D3的含量分别为3.0472μg/g、3.0574μg/g，平均值为3.0523μg/g。
综合实施例1的结果可知，实施例1.1的样品前处理时间为6～8h，实施例 1.3的样品前处理时间为2～2.5h，而本发明方法的样品前处理时间为0.5～1h(实施例1.2)，由此证实了本发明的技术效果：能够大幅缩短维生素D供试液制备时间，有利于后续检测过程中降低维生素D含量测试误差，最终能够实现准确反映被检测样品中维生素D真实含量的目的。解决了现有技术中样品前处理过程复杂且耗时长的问题。同时，本发明的维生素D检测方法，仅采用高效液相色谱的反相检测系统，进一步节省检测时间。更重要的是，本发明的维生素D 检测方法，分离效果良好，且所得结果(3.2248μg/g)与国标方法(3.3358μg/g) 测得结果基本一致、所得结果略优于CN110632203A方法(3.0523μg/g)。由此说明，本发明的供试溶液制备方法(待测样品DMSO超声溶解和甲醇定容)能够满足维生素D3的检测要求，而非以牺牲检测结果准确度为代价的缩短前处理时间。
实施例2本实施例提供不同超声时间下方法的验证
2.1待测样品配制
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。供试品溶液的制备方法与实施例1.2.1基本相同，区别仅在于：(1)样品称取三份；(2) 三份样品的超声时间分别为10min、20min、30min。
2.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液和三份供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。待测样品的检测方法同实施例1.1.2。图8、图9分别为维生素D3标准系列溶液、供试品溶液的色谱图。其中，图9(a)、图9(b)、图9(c)分别对应三份供试品溶液的色谱图。表8和表9示出了维生素D3标准系列溶液和供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表8维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积
表9供试品溶液中维生素D3的峰面积
以维生素D3标准品浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并得出标准曲线方程。标准曲线方程为Y＝270.1503X-0.3035，R2＝0.9999。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，结果为三份样品中维生素D3含量分别为3.1208μg/g、2.9660μg/g、3.0530μg/g，RSD为2.55％。
综合上述结果可知，超声30min以内，各组间结果差异不大，RSD值符合要求。为了更进一步缩短维生素D供试液制备时间，优选确定超声时间为10min。
实施例3本实施例提供方法的专属性验证
3.1待测样品配制
阴性样品的制备：除维生素D3粉原料之外，所有原辅料(盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠、柠檬酸钙、维生素K2粉和硬脂酸镁)按0.6g/粒、2000粒进行配料。盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠、柠檬酸钙、维生素K2粉和硬脂酸镁的取用量分别为400g、297.3g、490g、5g和6g。将柠檬酸钙、盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠混合均匀，得到混合物A。将维生素K2和硬脂酸镁按比例混合均匀，得到混合物B。将混合物A和混合物B加入混合机中，设定转速为8转/分钟，共混合20min。混合均匀后作为阴性样品。另取1.0g阴性样品，精密称定置于25mL棕色容量瓶中。向其中加3mLDMSO，涡旋浸润样品后超声10min，取出，放至室温后，用甲醇定容至刻度，混匀后过0.45μm滤膜，取滤液作为阴性样品溶液。
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。供试品溶液的制备方法为：取优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊供试品20粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取1.0g试样置于25mL棕色容量瓶中。向其中加3mLDMSO，涡旋浸润样品后超声10min，取出，放至室温后，用甲醇定容至刻度，混匀后过 0.45μm滤膜，取滤液作为供试品溶液。
3.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液、一份供试品溶液和一份阴性样品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。待测样品的检测方法同实施例1.2.1。图10示出了维生素D3标准系列溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图(由上至下)。根据图10可知，各原辅料对维生素D3含量测定无干扰，目标峰满足分离要求，表明本发明的方法专属性良好。
实施例4本实施例提供方法的线性验证
4.1待测样品配制
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。
4.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.1.2，区别仅在于浓度为0.1019μg/mL的维生素D3标准品浓度需要连续进样6次。表10示出了维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积。
表10六份维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积
以维生素D3标准品浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并得出标准曲线方程(如图11所示)。标准曲线方程为 Y＝271.5238X-0.3920，R2＝0.9999。由结果可知，本发明的检测方法线性良好。
实施例5本实施例提供方法的重复性验证
5.1待测样品配制
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。供试品溶液的制备方法同实施例1.2.1，区别仅在于，称取六份供试品，而不是称取两份。
5.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液和六份供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1。图12、图13分别为维生素D3标准系列溶液、供试品溶液的色谱图。其中，图13(a)、图13(b)、图13(c)、图13(d)、图13(e)和图13(f) 分别对应六份供试品溶液的色谱图。表11、表12分别示出了维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积、供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表11维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积
表12供试品溶液中维生素D3的峰面积
以维生素D3标准品浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并得出标准曲线方程。标准曲线方程为Y＝265.8658X-0.4896，R2＝0.9999。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，六份样品中维生素D3的含量分别为3.4658μg/g、3.5086μg/g、3.4680μg/g、3.5020μg/g、3.4706μg/g和3.4992μg/g，样品中维生素D3平均含量为3.4857μg/g；RSD为0.57％，满足检测要求，说明本发明的方法重复性良好。
实施例6本实施例提供方法的准确度验证
6.1待测样品配制
配制加标回收标准溶液。按照实施例1.1.1.2的方法制备维生素D3标准中间使用液，回温至室温，精密量取2.5mL置于50mL棕色容量瓶中，用DMSO定容，得到浓度为0.5184μg/mL的加标回收标准溶液。
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.1.1.2。供试品溶液的制备方法为：取供试品优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊20粒，倾出内容物，研细，混匀。分别精密称取称取六份0.5g样品于25mL棕色容量瓶中，加入3mL配制好的加标回收标准溶液，涡旋浸润样品后，超声10min取出，放至室温后，加甲醇至刻度，混匀后过0.45μm滤膜，取滤液作为供试品溶液。
6.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液和六份供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1。图14、图15分别为维生素D3标准系列溶液、供试品溶液的色谱图。其中，图15(a)、图15(b)、图15(c)、图15(d)、图15(e)和图15(f) 分别对应六份供试品溶液的色谱图。表13、表14分别示出了维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积、供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表13维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积
表14供试品溶液中维生素D3的峰面积
以维生素D3标准品浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并得出标准曲线方程。标准曲线方程为Y＝266.9388X-0.4472，R2＝1.0000。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，六份样品中维生素D3的含量分别为3.3340μg/g、3.1676μg/g、3.1685μg/g、3.3196μg/g、3.3177μg/g和3.1737μg/g。根据加标回收标准溶液的浓度可知，每份供试品溶液中加入维生素D3的量为 1.5552g，扣除1.5552g则六份样品中维生素D3的含量分别为1.7770μg、1.7439μg、 1.7446μg、1.7739μg、1.7749μg和1.7432μg。根据回收率计算公式可得，六份样品的回收率分别为100.12％、91.54％、91.56％、99.39％、99.20％和91.98％。由此可知，样品平均回收率为95.63％、RSD为4.53％。综合上述结果可知，本发明的检测方法准确度良好。
优韧集牌氨糖硫酸软骨素钙胶囊样品中维生素D3含量的计算公式如下：
X2＝m*X
式中，X2为试样中维生素D3含量，单位为微克；m为试样称重量，单位为克；X为实施例5重复性试验测得试样中维生素D3含量，为3.4857μg/g。
加标回收标准溶液中维生素D3含量的计算公式如下：
X3＝c*1
式中，X3为加入维生素D3量，单位为微克；c为加标回收标准溶液浓度，为0.5184μg/mL；1为加入加标回收标准溶液的体积，单位为mL。
样品回收率计算公式如下：
式中，H为试样的回收率，单位为％；X1为本实施例测得的维生素D3含量，单位为微克；X2为计算得到的试样中维生素D3含量，单位为微克；X3为加入维生素D3标准品溶液中维生素D3含量，单位为微克(μg)。
实施例7本实施例提供方法的稳定性验证
7.1待测样品配制
本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.2.1，区别在于：仅使用浓度为0.10μg/mL的维生素D3标准系列溶液。供试品溶液的制备方法同实施例1.2.1，区别仅在于，称取一份供试品，而不是称取两份。
7.2待测样品高效液相色谱仪测定
将一份维生素D3标准系列溶液(0.10μg/mL)和一份供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1，区别仅在于维生素D3标准系列溶液和供试品溶液的取样时间。待测样品配制完成后，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、 24h后进样。表15、表16分别示出了维生素D3标准系列溶液中维生素D3的峰面积、供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表15维生素D3标准系列溶液(0.10μg/mL)中维生素D3的峰面积
表16供试品溶液中维生素D3的峰面积
根据表15和表16可知，24h内维生素D3标准系列溶液(0.10μg/mL)中维生素D3的平均峰面积RSD为0.76％，供试溶液中维生素D3的平均峰面积RSD 为0.57％，由此证明，本发明的检测方法中维生素D3在24h内稳定性良好。
实施例8本实施例提供方法的检出限验证
8.1待测样品配制
按照实施例1.1.1.2的方法制备浓度为维生素D3标准储备溶液，恢复室温。区别仅在于：维生素D3标准储备溶液的浓度为0.2μg/ml。
精密吸取恢复至室温的维生素D3标准储备溶液1ml于100ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，浓度为0.002μg/ml，为第一标准品稀释液。
精密吸取第一标准品稀释液5ml于10ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，浓度为0.001μg/ml，为第二标准品稀释液。
精密吸取第一标准品稀释液2ml于10ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，浓度为0.0004μg/ml，为第三标准品稀释液。
8.2待测样品高效液相色谱仪测定
将第一、第二和第三标准品稀释液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1。图 16示出了第一标准品稀释液的色谱图。第二和第三标准品稀释液的色谱图未示出，这是由于其色谱图中的峰面积无法积分。接下来计算本发明方法的检出限，得出本发明方法的检出限为0.0020μg/ml。具体检出限的计算方法如下：
式中，S色谱仪最低响应值，即仪器能辨认的最小的物质信号；b为标准曲线回归方程中的斜率(选自实施例4的标准曲线方程)。其中，S的计算公式如下：
S＝3N
式中，N为仪器噪音水平，本实施例的N取值为0.178。
综合上述结果可知，本发明维生素D3检测方法的最小检出浓度为为 0.0020μg/mL。当取样量为1.0g且定容体积为25ml时，维生素D3的检测限为 0.05μg/g。
实施例9本实施例提供方法的精密度验证
9.1待测样品配制
按照实施例1.1.1.2的方法制备浓度为维生素D3标准系列溶液，恢复室温。仅使用浓度为0.10μg/mL的维生素D3标准系列溶液(下称维生素D3标准品溶液)。按照实施例1.2.1的方法制备供试品溶液，区别仅在于：称取一份供试品，而不是称取两份。
9.2待测样品高效液相色谱仪测定
将维生素D3标准品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1，区别仅在于两个待测样品均需连续进样6次。表17示出了维生素D3标准品溶液中维生素D3的峰面积、供试品溶液中维生素D3的峰面积。
表17维生素D3标准品溶液和供试品溶液中维生素D3的峰面积
根据表17可知，标准品和样品精密度测定的RSD分别为0.27％和1.85％，表明仪器精密度良好。
实施例10本实施例提供色谱条件的范围验证
实施例10.1柱温的范围验证
10.1.1本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.2.1。供试品溶液的制备方法同实施例1.2.1，区别仅在于，称取四份供试品，而不是称取两份。
10.1.2待测样品高效液相色谱仪测定
将六份维生素D3标准系列溶液和四份供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1，区别仅在于柱温分别为30℃、35℃、38℃和40℃。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，结果为：四份样品中维生素D3的含量分别为 3.2568μg/g、3.1815μg/g、3.2226μg/g和3.3667μg/g，平均值为3.2569μg/g，RSD 为4.72％。由此可知，不同柱温下试样检测含量虽有一定波动，但波动范围并不大，即柱温对本发明检测结果的影响并不大。
实施例10.2流速的范围验证
10.2.1本实施例中，维生素D3标准系列溶液的制备方法同实施例1.2.1。供试品溶液的制备方法同实施例1.2.1，区别仅在于，称取三份供试品，而不是称取两份。
10.2.2将六份维生素D3标准系列溶液和三份供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，并记录维生素D3的峰面积。本实施例中，待测样品的检测方法同实施例1.2.1，区别仅在于流速分别为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min。按照维生素D3含量计算公式(实施例1.1)计算，结果为：三份样品中维生素 D3的含量分别为3.0815μg/g、3.2229μg/g和3.2677μg/g，平均值为3.1907μg/g， RSD为3.05％。由此可知，不同流速下试样检测含量虽有一定波动，但波动范围并不大，即流速对本发明检测结果的影响并不大。
Claims (10)
1.一种维生素D供试品溶液的制备方法，用于维生素制品中维生素D的检测，其特征在于：包括下列步骤：
S1：向所述维生素制品中加入二甲基亚砜，后超声提取，得到提取液；
S2：向所述提取液中加入甲醇，后过滤得到滤液，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述维生素制品为维生素D含片、维生素D咀嚼片、维生素D颗粒剂和维生素D片剂中的任意一种。
3.根据权利要求1-2中任一所述的制备方法，其特征在于：所述维生素D包括维生素D2或维生素D3。
4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述维生素制品与所述二甲基亚砜的质量比为1：1.1～11。
5.根据权利要求4中所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，超声时间为10～30min；优选的，超声时间为10min。
6.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述维生素制品与所述甲醇的质量比为1：11.9～79.1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，过滤选用0.22μm滤膜或0.45μm滤膜。
8.一种维生素制品中维生素D的检测方法，其特征在于：包括下列步骤
a、制备维生素D供试品溶液：按照权利要求1～7中任一所述的制备方法，制备维生素D供试品溶液；
b、制备维生素D标准储备溶液，后按照浓度梯度配制多份维生素D标准系列溶液；
c、高效液相色谱检测：采用高效液相色谱法对所述维生素D供试品溶液和多份所述维生素D标准系列溶液进行检测，根据检测结果计算得到维生素D的含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，所述维生素D标准储备溶液的浓度为100ug/mL，和/或多份所述维生素D标准系列溶液的浓度分别为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL。
10.根据权利要求8-9中任一所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，高效液相色谱法的条件为以下(i)至(vi)中的一项或多项：
(i)色谱柱：C18柱，内径4.6mm，粒径5μm；
(ii)柱温：30～40℃；
(iii)流动相：包括流动相A和流动相B；所述流动相A为甲醇，所述流动相B为水；所述甲醇与所述水的体积比为95：5；
(iv)流速：0.8～1.2mL/min；
(v)检测波长：264nm；
(vi)进样量：100μL。
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