CN106596426A - 一种绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的快速检测方法，所述方法在采用大孔树脂吸附、纯化绞股蓝总皂苷的生产中使用，所述方法包括采用分光光度法测定样品的吸光度，通过所述样品的吸光度的比较来确定上样过程上样终点和/或洗脱过程终点，对绞股蓝皂苷的分离纯化、过程控制具有重要的指导意义。

Description

一种绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的检测方法

技术领域

本发明属于医药领域。具体地，本发明涉及一种绞股蓝总皂苷的提取分离中的检测方法。

背景技术

绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostema pentaphullum(Thunb.)Makino的干燥全草。其作为一种与人参相似的免疫增强剂，有着“南方人参”的美誉，近年来一直是国内外学者研究的热点，也是保健食品研发和销售的热点。20世纪70年代以来，国内外学者采用现代分离技术和分析方法对绞股蓝主要成分进行了广泛而深入的研究。研究表明绞股蓝含有皂苷类、糖类、黄酮类、氨基酸、蛋白质、脂肪、矿物质、纤维素和维生素等。现代药学研究表明，其主要药效成分是绞股蓝皂苷，它具有抗肿瘤、抗血栓、降血糖、增强免疫力、保肝等作用。绞股蓝不仅有良好的医疗保健作用，而且可以作为食品、保健品以及化妆品的原料，是极具发展潜力的药材。

文献中，已有大量绞股蓝总苷生产工艺的研究报道，但较多的有：“通法”提取、“大孔吸附树脂法”、“膜分离法”等。“通法”提取，即以常规或常识性手段进行提取，是指用适当浓度的乙醇或甲醇提取药材，以乙醚或石油醚脱脂后，再以水饱和正丁醇或乙酸乙酯进行液－液萃取，得到绞股蓝总苷。由于该法缺乏专属性，所得到部位的皂苷含量较低，且有有机溶剂残留的风险，难以在大规模生产中使用。“大孔吸附树脂法”，即将药材水提液滤过，滤液通过大孔吸附树脂柱，再依次用不同浓度的有机试剂洗脱，得到绞股蓝总苷。该法具有方法简便、成本低、得率恒定、成品质量稳定且纯度较高等特点，使得该工艺在工业化生产中推崇。“膜分离法”是纯粹的物理分离，在压力驱动下常温进行，被分离物质不会有热力学性、化学性或生物性的变化，可较好地保持绞股蓝皂苷生理活性。该法操作简单、能耗低、无废水污染，因此越来越受到专家们的关注，成为分离纯化皂苷的热点方向。综上，目前工业生产中主要采用“大孔吸附树脂法”。

但是，大孔树脂吸附分离纯化中药是一个比较复杂的过程，对成分有吸附，也有分子筛等机理的不同，因此对于纯化特定类别的成分(拟要成分)达到“尽可能少地损失拟要成分，尽可能多地去除杂质”才是最理想的状态，要实现该目的，对生产过程的实时在线监测就显得尤为重要和必要。对于黄酮类成分(如银杏叶黄酮)，由于黄酮化合物自身有紫外吸收，在大孔吸附树脂纯化总黄酮的过程中可以很容易利用紫外检测器实现对产品生产全过程的在线检测和过程控制，特别是终点放行及其标准的制定；而该方法显然无法适用于皂苷类成分，绝大多数皂苷类成分由于没有紫外吸收，无法直接进行测定实现实时监测、在线控制。要实现对皂苷的过程控制，一般都是要对洗脱液进行取样、浓缩、化学反应、可见光检测等，进而才能了解洗脱液的皂苷含量进度情况，进而判定终点，这样显然时间长、操作繁琐、准确度差，无法满足产业化规模的生产过程在线控制和在线实时监测的需求。因此，开发适宜于无紫外吸收的皂苷类物质的在线快速检测方法和技术对产业化的发展具有重要的意义。

大孔吸附树脂纯化中药有效部位时，其生产的关键步骤在于：上样液性质、上样方式、吸附树脂、吸附过程、洗脱方式及方法等，各环节的任何不同，都可能直接影响到产物的品质和组成。一般在相关的专利中都会把重点放到吸附树脂的品种、类型，洗脱剂(解吸附剂)、洗脱速度，等方面上。

例如，专利CN200610065788.X公开了一种绞股蓝总苷的制备方法，其制备方法包括取绞股蓝，粉碎成最粗粉，每克药粉用6－10毫升30％－70％的乙醇回流提取1－4次，每次1－2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，加水稀释成溶液，溶液浓度为每1ml含0.1g生药，滤过，得到的滤液定义为药液，将药液加于已预处理好的大孔树脂柱上，所述药液中的生药与干树脂重量比为1∶1－1∶2，先用水洗至流出液无色，再用60％－90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇后浓缩至60℃下相对密度为1.30～1.35的稠膏，真空干燥，粉碎成细粉，即得。

专利03114470.5公开了一种绞股蓝总皂甙的制取方法，该方法以绞股蓝为原料,将绞股蓝加入水煮沸提取,过滤提取液，澄清，将上清液通入大孔树脂吸附，用碱液冲洗柱子至流出液无色，再用水冲洗至中性，然后用原料5-8倍量50％-95％乙醇洗脱，脱除乙醇经干燥处理得股蓝总皂甙制品。

专利03114471.3公开了一种绞股蓝总皂甙的制取方法，该方法以绞股蓝为原料，将绞股蓝加入碱水煮沸提取，过滤提取液，澄清，将上清液通入大孔树脂吸附,碱液冲洗柱子至流出液无色，再用水冲洗至中性，然后用原料5-8倍量50％-95％乙醇洗脱，脱除乙醇经干燥处理得股蓝总皂甙制品。

专利200310106935.X公开了一种绞股蓝总皂甙的制取方法，其方法包括将绞股蓝原料除杂后；加水煮沸提取1～2小时，放置澄清,取上清液通入装有国产001型吸附树脂的树脂柱进行吸附，原料与吸附树脂的重量比为1∶0.7～1.2，吸附完毕后树脂柱用浓度为10～30％的乙醇洗去杂质，再用浓度为60～95％的乙醇洗脱，洗脱液脱除乙醇，经干燥处理得绞股蓝总皂甙制品。

而在大孔吸附树脂纯化的实际生产过程中，准确判断上样终点、洗脱比例和洗脱终点，同样是生产工艺的关键质量控制点，它直接影响产品的纯度和收率，是树脂纯化工艺中的重点和难点。不同批次样品上样药液、树脂性能、洗脱温度、洗脱速度等多种因素，都可能影响纯化过程的洗脱终点，如果没有准确、快速的终点放行或判定标准，仅仅靠参数放行的话，产品质量将难以稳定、均一，纯化效率更难提高。同时，由于国内从事绞股蓝植物提取的企业大多规模小，设备落后，生产工艺缺乏在线控制技术和在线监测技术，是造成产品质量差的关键内因，致使一些劣质产品甚至掺伪产品流入市场，影响了绞股蓝产业的健康发展。

常用的在线检测的方法除紫外法、温度、pH等外，还有近红外(NIR)法，但NIR的应用需要基于大量的数据收集、建模、校正等，需要对监测的对象的组成、比例等有深入而充分的了解，才能保证模型的正常使用，目前少数中药品种已应用的NIR在线监测多属于“摆设”或“聋子耳朵”级，因缺乏对生产过程的成分了解而无法实现真正的在线控制，处于十分尴尬的境地；而用分光光度法不仅简单方便、易于联机、易于在线测定、实时记录，而且仪器廉价，可普及性高，能较好的运用到大生产或生产的自动化中。

综上，迫切需要发展绞股蓝总皂苷提取和纯化工艺的在线检测技术，建立科学的上样终点过程、洗脱比例和洗脱终点的快速判断方法、技术和标准，以保证生产工艺的重现性，产品质量的稳定性、一致性，实现生产工艺的工程化和自动化，也有助于实现产品的过程控制和质量保证，保障人民用药安全。

发明内容

因此，基于现有技术仅靠参数放行模式进行生产，无法实现过程质量控制、无紫外吸收物质(如皂苷)难以突破快速检测技术瓶颈等方面的缺陷，本发明的目的在于提供一种绞股蓝总皂苷的提取、分离、纯化过程关键质量控制点的快速判断方法和在线监控方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的快速检测方法，其中，所述方法在采用大孔树脂吸附、纯化绞股蓝总皂苷的生产中使用，所述方法包括采用分光光度法测定样品的吸光度，通过所述样品的吸光度的比较来确定上样过程中上样终点和/或洗脱过程终点。其原理是依据绞股蓝总皂苷与其有紫外吸收的伴随物的质量变化规律，来确定大孔树脂吸附、解吸附、树脂再生等过程上样终点、解吸附的洗脱过程终点。

优选地，根据前述的方法，其中，所述样品为所述大孔吸附树脂在上样过程的上样液、所述上样过程的流出液，和/或所述洗脱过程的洗脱流出液。通过在线或旁线测定或实时监测样品的特定波长的吸光度，来判定上样终点、洗脱进程和/或终点放行。

更优选地，根据前述的方法，其中，所述方法通过比较所述上样液和所述流出液的吸光度确定所述上样过程上样终点，优选地，所述吸光度的检测波长为250～800nm，更优选为400～750nm，再优选为500～680nm。

再优选地，根据前述的方法，其中，当所述流出液的吸光度为所述上样液吸光度的1％～70％时，优选为10％-60％，更优选为30％-50％时，作为所述上样过程的上样终点。

还优选地，根据前述的方法，其中，所述方法包括：

(1)通过分光光度法直接在线或旁线测定上样液的吸光度；

(2)通过分光光度法在线或旁线直接测定流出液的吸光度，每一个柱体积(柱体积，简称BV，其计算公式为：)读取一次吸光度值；

(3)比较步骤(2)中测定的所述流出液吸光度值和步骤(1)测定的所述上样液吸光度值以判断上样过程中的上样终点。

进一步优选地，根据前述的方法，其中，通过比较洗脱流出液的吸光度确定所述洗脱过程的终点。优选地，所述吸光度的检测波长为250～700nm。优选为400～650nm。更优选为500～600nm。

更进一步优选地，根据前述的方法，其中，当相邻检测点的洗脱流出液的吸光度值差异在1％～20％时，优选为5％-15％，更优选为5％-10％时，为洗脱过程的终点.

或更进一步优选地，根据前述的方法，其中，当连续10～20min内的洗脱流出液的吸收曲线与横坐标的夹角小于5°时，为洗脱过程的终点。

再进一步优选地，根据前述的方法，其中，所述方法包括：使用分光光度仪直接在线或旁线测定所述洗脱流出液的吸光度，每0.5个柱体积读取一次吸光度值或连续读取吸光度值以生成吸收曲线。

还进一步优选地，根据前述的方法，其中，采用大孔树脂吸附、纯化绞股蓝总皂苷的所述生产包括：

(a)采用乙醇回流提取绞股蓝总皂苷，所得提取液对大孔树脂吸附柱进行单柱上样时，到达所述上样过程的上样终点时停止上样，或所得提取液对大孔树脂吸附柱进行两柱三串联循环生产时，到达所述上样过程终点时停止上样，所述大孔树脂优选为HPD型，最优选为HPD500；(b)用去离子水对步骤(a)中停止上样的所述大孔树脂吸附柱进行杂质洗脱，直至到达所述杂质洗脱过程的洗脱终点；

(c)用5％～30％乙醇进行梯度洗脱，到达该梯度洗脱过程中不同浓度乙醇的洗脱终点后改变乙醇浓度再进行洗脱，直至到达乙醇浓度最高时的洗脱终点，优选地，用10％～20％乙醇进行梯度洗脱；

(d)用30％～80％乙醇进行产品制备洗脱，到达该产品制备洗脱过程中不同浓度乙醇的洗脱终点后改变乙醇浓度再进行洗脱，直至到达乙醇浓度最高时的洗脱终点，收集产品制备过程中的乙醇洗脱流出液，所述乙醇洗脱流出液即为分离出来的绞股蓝总皂苷，优选地，用50％～75％乙醇进行产品制备洗脱。

具体地，所述绞股蓝总皂苷的提取过程可以包括：

绞股蓝用10～70％的乙醇回流提取1～3次，所述乙醇的用量是所述绞股蓝的质量5～12倍，即料液比为1:5～12(W/V)，每次提取时间为1～3h，提取液合并，浓缩至密度1.01-1.15(25℃)，加去离子水0.5-4倍，常温静置4-24h，过滤，得到绞股蓝提取液。

优选地，所述提取过程中步骤所述乙醇为30-40％，所述乙醇的用量是所述绞股蓝的质量8-10倍，提取时间为1-2h，回流提取次数为2次，浓缩密度为1.02-1.08(25℃)，加去离子水1-2倍，常温静置6-12h。

具体地，所述绞股蓝总皂苷的分离纯化过程(即上样和洗脱过程)可以包括：

步骤1：首次使用的大孔吸附树脂必须经过预处理，并达到国家相关标准中对各种残留物的限定要求。已使用过的大孔吸附树脂柱可以按照步骤5进行处理。所述预处理具体可以包括：用95％乙醇浸泡所述大孔树脂24h，充分溶胀，用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时为止，最后用去离子水洗至无醇味，经检测各种残留如果达不到标准的要求，可以再用1N的盐酸(药用级)浸泡所述大孔树脂24h，用去离子水洗至pH中性，再用1N的氢氧化钠(药用级)浸泡所述大孔树脂24h，用去离子水洗至pH中性，直至各种残留物达到标准的要求，备用；

步骤2：上样过程：采用前述绞股蓝提取液对大孔吸附树脂柱进行上样，(1)在单柱上样时，采用上述判断方法确定吸附过程的上样终点，到达上样终点时停止上样。(2)在两柱三串联循环生产时，共三个柱子，第一号是“上样柱”，第二号为“保险柱”(对第一号柱子泄露物质作保险处理)，第三号为“预备柱”，第四号为“循环柱”，也就是：经过前面的生产处理，此时第一根柱子已经完成洗脱、再生成为空载柱，可再次加入循环生产。即：上样液经第一根柱子(“上样柱”)后，流出液泵入第二根柱子(“保险柱”)；当第一根树脂柱上样达到饱和(达到上样终点)后，停止上样，对该柱进行下一步洗脱、再生等处理；转动进样阀，对第二根柱子成为“上样柱”进行上样，其流出液泵入第三根柱子(“保险柱”)，在第二根树脂柱上样达到饱和(达到上样终点)后，停止上样，对其进行下一步洗脱、再生等处理；此时，第三根柱子作为“上样柱”进行上样，其流出液泵入“循环柱”(此时，第一根柱已经完成了洗脱、再生，成为了空载树脂柱，可以作为本次循环的“保险柱”)，…，以此类推，循环生产，

采用上述判断方法对每次生产的“上样柱”和“保险柱”的流出液进行检测，在“上样柱”流出液的吸收值达到预设上样终点时，停止经“上样柱”的上样，该柱子将进入洗脱、再生环节；

步骤3：洗脱过程：先用去离子水对步骤2的“上样柱”进行除杂洗脱，采用上述方法确定除杂洗脱过程的终点，到达终点后，再用5％～30％乙醇进行梯度洗脱，同样，采用上述方法确定该梯度洗脱过程中不同浓度乙醇洗脱的终点，到达终点后；改变乙醇浓度(30％-80％)再进行产物制备洗脱，用上述方法确定洗脱终点，收集乙醇洗脱流出液；

步骤4：绞股蓝皂苷的制备：对步骤3中的乙醇洗脱流出液进行低温浓缩、干燥、收粉等处理，得到绞股蓝总皂苷粉末；

步骤5：“循环柱”的再生处理：步骤3中的树脂柱，以95％乙醇洗脱2-3BV后，放空乙醇洗脱液，乙醇洗脱液收集合并后另外回收处理；树脂柱再以2-5BV的去离子水洗脱后，即可作为“循环柱”加入生产循环中，

该步骤中回收的乙醇，依据其浓度的不同可以在生产中循环使用；所得到的残渣，因不含皂苷，可以依据实际情况另行处理。

优选地，步骤2中所述大孔树脂为HPD型，最优选为HPD500，步骤3中的梯度洗脱采用10％-20％乙醇，和/或产物制备洗脱采用50-75％乙醇。

本发明提供的绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的快速检测方法是用于绞股蓝皂苷纯化过程中“对无紫外吸收物质的在线检测”，是基于纯化过程中绞股蓝皂苷伴随物(简称：伴随物)的洗脱进度与绞股蓝皂苷(无紫外吸收)的洗脱进度呈正相关，以伴随物的吸光度值作为快速判断绞股蓝皂苷上样终点和洗脱终点，实现对无紫外吸收的皂苷类成分纯化过程的“替代”在线控制和实时监测。

本发明提供的绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的快速检测方法与常用的在线检测的方法比较如下表所示：

本发明建立了科学的上样终点过程、洗脱比例和洗脱终点的快速判断方法、技术和标准，能够实现吸附过程上样终点以及洗脱过程起点与终点这些关键点的快速确定，对绞股蓝皂苷的分离纯化具有重要的指导意义，以保证生产工艺的重现性，产品质量的稳定性、一致性，实现生产工艺的工程化和自动化，也有助于实现产品的过程控制和质量保证，保障人民用药安全。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了实施例1原料液全波长扫描图；

图2示出了实施例1绞股蓝皂苷泄露率与吸光度关系图；

图3示出了实施例2各梯度洗脱流出液全波长扫描图；

图4示出了实施例2吸光度、含固量和总皂苷关系图；

图5示出了试验例2乙醇浓度对绞股蓝总皂苷提取的影响；

图6示出了试验例3料液比对绞股蓝总皂苷提取的影响；

图7示出了试验例4提取时间对绞股蓝总皂苷提取的影响；

图8示出了试验例5提取次数对绞股蓝总皂苷提取的影响。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：

乙醇(梅河口市阜康酒精有限责任公司)；甲醇(北京化工厂)；香草醛(北京化学试剂公司)；冰乙酸(国药集团化学试剂有限公司)；高氯酸(国药集团化学试剂有限公司)；石油醚(北京化工厂)。

仪器：

T6新世纪分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；SB-1100型EYELA水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(河南省予华仪器有限公司)；N-1100型EYELA旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

实施例1上样终点的在线监测

本实施例用于说明使用本发明的检测方法对上样终点进行在线监测。

1.确定检测波长

对浓缩处理好的原料液在600-800nm波长下扫描，结果见图1。样品在665nm处有最大吸收，所以选择检测波长为665nm。

2.上样终点在线检测

用处理好的HPD500树脂18mL装柱，不断进行上样，上样流量3BV/h，每18mL为1份收集下口流出液。量取其中9mL直接蒸干留样，剩余部分用来直接测定吸光度，并按照本发明提供的绞股蓝总皂苷测定方法计算每份中绞股蓝总皂苷含量。测定相同体积的母料液吸光度，并按照本发明提供的绞股蓝总皂苷测定方法计算母料液中绞股蓝总皂苷含量。按公式(1)计算泄露率。考察泄露率与吸光度的关系，确定最大上样体积，结果见图2。

泄露率＝每份下口流出液中总皂苷质量/相同体积原料液中总皂苷质量×100％ (1)

由图2及数据可得，原料液吸光度0.328，当上样量为22BV时，泄露率为102.34％，吸光度0.178；当上样量为21BV时，泄露率92.90％，吸光度0.172，此时的吸光度约等于原料液吸光度的1/2，所以建议上样量为21BV，此时生药量(g)：树脂体积(mL)＝2：1；用在线检测控制上样终点，选择吸光度为原料液1/2时上样终点。

实施例2洗脱过程的在线监测

本实施例用于说明使用本发明的检测方法对洗脱过程进行在线监测。

1.梯度洗脱

取生药含量为0.1g/mL的提取液以3BV/h的流速上柱，通过型号为HPD500树脂柱进行吸附，吸附饱和后，静置12h，分别用8BV去离子水洗脱，再分别用8BV15％乙醇和8BV70％乙醇洗脱，每个柱体积为一个流份，收集各流份，

2.检测波长的确定

分别选取水、15％乙醇、70％乙醇洗脱流出液各一份在500-800nm波长下扫描，结果如图3。本着吸光度小于1，且各梯度均有良好的吸收，故选择在555nm作为检测波长。

3.洗脱梯度在线检测

量取各流份洗脱流出液一半直接蒸干，另一半直接进行检测吸光度，然后计算每一个流份的含固量及总皂苷含量，建立每份流份的吸光度、含固量及总皂苷含量关系图，能通过吸光度来确定每个梯度的洗脱终点。建立每份流份的吸光度、含固量及总皂苷含量关系图，结果如图4。含固量即为每份样品蒸干后的质量。

由以上数据可得，当洗脱流出液吸光度基本稳定时可换下一个梯度进行洗脱，用70％乙醇洗脱时，吸光度基本稳定时就是洗脱终点。

试验例1绞股蓝总皂苷的测定方法

本试验例提供了一种绞股蓝总皂苷的测定方法，其原理为采用分光光度法测定样品吸光度，取绞股蓝皂苷XLIX对照品测量吸光度制作标准曲线以计算样品中的绞股蓝总皂苷含量。

具体地，所述测定方法包括：

(1)对照品溶液的制备

精密称取绞股蓝皂苷XLIX对照品10.00mg于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为2.00mg/mL的溶液，即得。

(2)标准曲线的绘制

精密吸取步骤(1)中所述对照品溶液5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL分别置15mL具塞试管中，挥干，精密加入新配制的5％香草醛冰乙酸溶液与高氯酸(2：8)的混合液2mL，摇匀，密塞，置60℃水浴中加热15min，取出，立即放入冷水中冷却2min，分别精密加冰乙酸10mL，摇匀。以精密加入2mL新配制的5％香草醛冰乙酸溶液与高氯酸(2：8)的混合液，密塞，置60℃水浴中加热15min，取出，立即放入冷水中冷却2min，分别精密加冰乙酸10mL，摇匀，作空白，按照紫外可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)试验，在555nm的波长处分别测定吸光度，平行测定三次取平均值。以绞股蓝皂苷XLIX对照品的含量(mg)对吸光度进行回归，以质量(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程为：Y＝1.0884X-0.0033，r＝0.999。结果表明，当取样量在0.01～0.20mg范围内时，绞股蓝皂苷XLIX的含量与吸光度呈良好的线性关系。

(3)样品含量测定

精密称取样品粉末10.00mg(精确至0.00001g)，置2mL离心管中，加石油醚2mL，超声处理10min，离心(6000r)5min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，用步骤(2)绘制的标准曲线计算出样品中绞股蓝总皂苷的含量。

试验例2乙醇浓度对提取绞股蓝总皂苷的影响

绞股蓝分别用0％、30％、50％、70、90％的乙醇回流提取2次，所述乙醇的用量是所述绞股蓝的质量10倍，每次提取时间为1.5h，得到回流提取液。合并两次提取的回流提取液，过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩、蒸干得绞股蓝各溶剂提取物质量即为含固量。精密称取绞股蓝各溶剂提取物10mg，置2mL离心管中，加石油醚2mL，超声处理10min，离心(6000r)5min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝各溶剂提取物中的绞股蓝皂苷总质量。乙醇浓度对绞股蓝总皂苷提取的影响见图5。

由图5可见，当乙醇浓度在30％-70％时，随着浓度的增加含固量基本不变，绞股蓝总皂苷质量也趋于平缓，乙醇浓度增大会增加生产成本，从经济实用角度出发，选用30％乙醇作为提取溶剂。

试验例3料液比对提取绞股蓝总皂苷的影响

绞股蓝用30％的乙醇回流提取2次，所述料液比分别为1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，每次提取时间为1.5h，得到回流提取液。合并两次提取的回流提取液，过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩、蒸干得绞股蓝各溶剂提取物质量即为含固量。精密称取绞股蓝各溶剂提取物10mg，置2mL离心管中，加石油醚2mL，超声处理10min，离心(6000r)5min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝各溶剂提取物中的绞股蓝皂苷总质量。料液比对绞股蓝总皂苷提取的影响见图6。

由图6可见，随着溶剂量的增加,提取效果也随着增高。当料液比为1：8时，绞股蓝总皂苷质量最大，当料液比超过1∶8时，含固量虽然增大，但绞股蓝总皂苷质量基本不变。因此选择1∶8作为提取的最佳料液比。

试验例4提取时间对提取绞股蓝总皂苷的影响

绞股蓝用30％的乙醇回流提取2次，所述料液比为1:8，每次提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，得到回流提取液。合并两次提取的回流提取液，过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩、蒸干得绞股蓝各溶剂提取物质量即为含固量。精密称取绞股蓝各溶剂提取物10mg，置2mL离心管中，加石油醚2mL，超声处理10min，离心(6000r)5min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝各溶剂提取物中的绞股蓝皂苷总质量。提取时间对绞股蓝总皂苷提取的影响见图7。

由图7可见，随着提取时间的延长，随着提取次数增多，绞股蓝提取物含固量增高，当提取次数超过2次时,绞股蓝总皂苷质量增加不明显，这可能是由于经过2次提取后，绞股蓝总皂苷的提取趋于完全所致。所以，提取次数取2次为好。

试验例5提取次数对提取绞股蓝总皂苷的影响

绞股蓝用30％的乙醇回流提取，提取次数分别为1～5次，所述料液比为1:8，每次提取时间为1.5h，得到回流提取液。合并提取的回流提取液，过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩、蒸干得绞股蓝各溶剂提取物质量即为含固量。精密称取绞股蓝各溶剂提取物10mg，置2mL离心管中，加石油醚2mL，超声处理10min，离心(6000r)5min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝各溶剂提取物中的绞股蓝皂苷总质量。提取次数对绞股蓝总皂苷提取的影响见图7。

由图8可见，随着提取时间的延长，绞股蓝提取物含固量不断增大，但绞股蓝总皂苷质量基本趋于平缓，提取时间延长不利于生产周期，会增加生产成本和能耗，所以提取时间控制在2h以内为宜。

试验例6多因素对提取绞股蓝总皂苷的影响

选取料液比、提取时间、提取次数为考察因素，各取考察因素的3个水平，选用L9(34)正交表进行试验。以得到的绞股蓝总皂苷质量为指标。正交试验水平因素见表1，试验结果见表2。

表1正交试验因素水平表

表2 L9(3⁴)正交试验设计及结果

由表2可知，3个因素对总皂苷得率的影响主次顺序为A>B>C即提取次数>提取时间>料液比，最佳工艺参数为A2B2C2。

本实验通过单因素乙醇浓度、料液比、提取时间及提取次数考察及正交试验，优选出从绞股蓝总皂苷的最佳提取工艺为30％乙醇，提取液用量是绞股蓝的8倍，每次提取1.5h，回流提取2次。

试验例7大孔树脂静态吸附和解析试验

1.大孔树脂预处理

7种不同型号大孔吸附树脂(HPD 100-HPD 500、SP825L、NKA-Ⅱ)分别用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀，用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时为止，最后用去离子水洗至无醇味，备用。

2.静态吸附和解吸实验

称取各型号经预处理的树脂5g(湿质量)置于100mL锥形瓶中，各加入绞股蓝提取液50mL，持续振摇30min，静置12h后，抽滤，得吸附后的滤液。将吸附后的各型号树脂滤出后分别另置100mL锥形瓶中，各加入95％乙醇50mL，其余操作同上，得解吸后的滤液。精密量取吸附后的滤液100μL、原料液30μL和解吸后的滤液50μL分别置15mL具塞试管中，挥干后加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量(原料液总皂苷质量为244.78mg)，再按下式(2)、(3)计算每种树脂对总皂苷的静态饱和吸附量及解吸率，结果见表2。

饱和吸附量＝(原料液总皂苷质量-流出液总皂苷质量)/树脂的量 (2)

解吸率＝洗脱液总皂苷质量/(原料液总皂苷质量-流出液总皂苷质量)×100％ (3)

表3 7种大孔吸附树脂对绞股蓝总皂苷的静态饱和吸附量、解吸率测定结果

由表3可见，HPD系列树脂饱和吸附量及解吸率都优于其他两种类型(SP825L、NKA-Ⅱ)树脂，综合吸附及解吸两方面因素考虑，可以认为HPD系列树脂对绞股蓝总皂苷具有较好的吸附及解吸能力，因此选用HPD系列树脂来进行下一步考察。

试验例8 HPD大孔树脂动态吸附和解析试验

取绞股蓝药材120g，经拣选，切成2-4cm小段，置圆底烧瓶中，按前文所提的提取工艺进行提取，合并提取液，过滤，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，浓缩液放置室温后，加水稀释至1200mL(即生药量含量0.1g/mL)，3500r/min离心20min，取相同体积上清液6份，每份120mL，一份蒸干得绞股蓝提取物，称重(见表4)；另外5份分别通过预先处理好的HPD 100、HPD 200、HPD 300、HPD 400、HPD 500型大孔吸附树脂柱，再分别以2BV去离子水和3BV 95％乙醇洗脱，95％乙醇洗脱液浓缩，干燥、收粉，得绞股蓝总皂苷粉末，称重(见表4)。精密称取样品绞股蓝总皂苷粉末10.00mg(精确至0.00001g)，置2mL离心管中，加石油醚2mL，超声处理10min，离心(6000r)5min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2mL离心(10000r)10min，精密量取上清液100μL置15mL具塞试管中，挥干甲醇后，以同上作空白，按照紫外可见分光光度法试验，在555nm的波长处测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量(见表4)。

表4 HPD系列大孔吸附树脂动态吸附及解吸结果

注：含固量＝每份样品蒸干后的质量；总皂苷纯度(％)＝紫外测得的总皂苷质量/含固量×100％；

回收率(％)＝通过大孔树脂后得到的总皂苷质量/相同体积原液中总皂苷质量×100％

从以上实验结果可以看出，HPD系列大孔吸附树脂对绞股蓝提取液有很好的吸附和纯化效果。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的快速检测方法，其特征在于，所述方法在采用大孔树脂吸附、纯化绞股蓝总皂苷的生产中使用，所述方法包括采用分光光度法测定样品的吸光度，通过所述样品的吸光度的比较来确定上样过程上样终点和/或洗脱过程终点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为所述上样过程的上样液、所述上样过程的流出液和/或所述洗脱过程的洗脱流出液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法通过比较所述上样液和所述流出液的吸光度确定所述上样过程上样终点，优选地，所述吸光度的检测波长为250～800nm，更优选为400～750nm，再优选为500～680nm。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述流出液的吸光度为所述上样液吸光度的1％～70％时，优选为10％-60％，更优选为30％-50％时，作为所述上样过程的上样终点。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法包括：

(1)通过分光光度法直接在线或旁线测定上样液的吸光度；

(2)通过分光光度法在线或旁线直接测定流出液的吸光度，每一个柱体积读取一次吸光度值；

(3)比较步骤(2)中测定的所述流出液吸光度值和步骤(1)测定的所述上样液吸光度值以判断上样过程中的上样终点。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，通过比较洗脱流出液的吸光度确定所述洗脱过程的终点，优选地，所述吸光度的检测波长为250～700nm，优选为400～650nm，更优选为500～600nm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当相邻检测点的洗脱流出液的吸光度值差异在1％～20％时，优选为5％-15％，更优选为5％-10％时，为洗脱过程的终点。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当连续10～20min内的洗脱流出液的吸收曲线与横坐标的夹角小于5°时，为洗脱过程的终点。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：使用分光光度仪直接在线或旁线测定所述洗脱流出液的吸光度，每0.5个柱体积读取一次吸光度值或连续读取吸光度值以生成吸收曲线。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法所述大孔树脂吸附提取分离包括：

(a)采用乙醇回流提取绞股蓝总皂苷，所得提取液液对大孔树脂吸附柱进行单柱上样时，到达所述上样过程的上样终点时停止上样，或所得提取液液对大孔树脂吸附柱进行两柱三串联循环生产时，达到上样过程上样终点时停止上样，所述大孔树脂优选为HPD型，最优选为HPD500；

(b)用去离子水对步骤(a)的大孔树脂吸附柱进行杂质洗脱，直至到达所述杂质洗脱过程的洗脱终点；

(c)用5％～30％乙醇进行梯度洗脱，到达该梯度洗脱过程中不同浓度乙醇的洗脱终点后改变乙醇浓度再进行洗脱，直至到达乙醇浓度最高时的洗脱终点，优选地，用10％～20％乙醇进行梯度洗脱；

(d)用30％～80％乙醇进行产品制备洗脱，到达该产品制备洗脱过程中不同浓度乙醇的洗脱终点后改变乙醇浓度再进行洗脱，直至到达乙醇浓度最高时的洗脱终点，收集产品制备过程中的乙醇洗脱流出液，所述乙醇洗脱流出液即为分离出来的绞股蓝总皂苷，优选地，用50％～75％乙醇进行产品制备洗脱。