CN101167775A - 菊花总黄酮提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菊花总黄酮提取方法，该方法是将菊花经乙醇提取后，以大孔树脂吸附法将提取液经上柱、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得菊花总黄酮的方法。本发明涉及的菊花总黄酮提取方法是一种操作简便、快捷的方法。所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。用本发明方法提取菊花总黄酮含量可达55％以上，且重现性好，树脂可重复使用。

Description

菊花总黄酮提取方法

技术领域

本发明为中药提取的方法，主要涉及中药有效组分提取的方法，尤其涉及菊花总黄酮的提取方法。

背景技术

菊花：本品为为菊科植物Chrysanthe mum morifklium Ramat.的干燥头状花序。9-11月花盛开时分批采收，阴干或培干，或熏、蒸后晒干。药材按产地和加工方法不同，分为“毫菊”、“除菊”、“贡菊”、“杭菊”。

菊花，味甘苦，微寒，入肝经，明目，清头风，去目翳，发表。能平肝火，内风，治头晕目胀，偏正头风，黑睛生翳，抱轮红赤。病后翳膜不去者又能益肝补阴，治肝肾不足之目昏内障。本品有白菊、黄菊和野菊花三种，白菊花味甘、清热力稍弱，长于平肝明目；黄菊花其味苦重，清热力较强，常用于疏风散热；野菊花清热解毒力很强，善解痈肿疮毒。菊花中黄酮类物质对冠心病、心绞痛、高血压、心血管疾病有很好的疗效，同时还有显著的清除人体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂、降血压等药理保健功能。国外研究发现菊花对单纯疱疹病毒(HSV-1)、脊髓灰质炎病毒和麻疹病毒具有不同程度的抑制作用，与空白组对照，空斑形成率减少50％。菊花水浸剂(1∶4)在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、许兰氏黄癣菌、奥杜盎氏小芽肥癣菌、铁锈色小芽胞癣菌、羊毛状小芽胞癣菌、腹股沟表皮癣菌、红色表皮癣菌、星形好卡氏菌等皮肤真菌均有不同程度的抑制作用。另外菊花还具有抗艾滋病作用，它能抑制ZV递转录酶和HLV复制的活性。

《本草正义》说菊花为“目科要药”。菊花在眼科中有着广泛的应用，如白菊花配伍柴胡、蝉蜕、木贼、羌活、防风、苍术、白术、赤芍、女贞子、生地、菟丝子、甘草，用此方加减治疗中心性浆液性脉络膜视网膜病变、急性视网膜色素上皮炎、视网膜静脉周围炎、眼外伤及黄斑疾病等。配伍一些补气血、益肝肾滋补之品还可用于治疗白内障、原发性视网膜色素变性、视神经萎缩、远视、弱视、迎风流泪等。

菊花主要含黄酮类、绿原酸、挥发油等化合物。

现有的菊花总黄酮提取方法，一般采用水提取或者乙醇溶液提取，浓缩，干躁，即得，这种方法提取的总黄酮含量低，用本发明可以克服此缺点。国产的大孔树脂提取，提取物溶剂残留较多，不易达到药用标准，本发明可以克服这些缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，是以乙醇加热回流提取菊花，回收乙醇，浓缩，将菊花提取液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的菊花总黄酮。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，将菊花以10％～95％的乙醇提取，优选乙醇浓度为：20％～80％，最优选为：40％。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，将菊花以乙醇提取1～4次，最优选为：3次。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，每次提取菊花质量与乙醇溶液的体积比为1～20倍，优选提取体积为：4～14倍，最优选提取体积为：8～12倍。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，每次提取的时间为0.5～2h，最优选时间为：1h。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP850、SP700、SP70，最优选SP70。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，菊花提取液的上样量(菊花质量∶树脂体积)为0.5∶1～8∶1，优选1∶1～4∶1，最优选1.5∶1。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，洗脱流速为洗脱液流速为1BV/h～5BV/h，最优选为2BV/h。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，洗脱剂为有机醇，优选项为乙醇。本发明提供的菊花总黄酮大孔树脂纯化方法，洗脱剂的洗脱浓度为5％～95％，最优选为20％～75％。。洗脱剂的洗脱体积为1～10倍柱体积，优选为3～8倍柱体积，最优选为5倍柱体积。获得纯化的菊花总黄酮含量大于55％。

本发明具有以下优点：

1、本发明涉及的菊花总黄酮树脂纯化的方法是一种操作简便、快捷的方法。

2、所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。

3、本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。

4、用本发明方法纯化菊花提取物，总黄酮含量可达55％以上，且重现性好，树脂可重复使用。

附图说明：

图1.菊花静态吸附与解吸率曲线

图2.菊花动态吸附泄漏曲线

图3.菊花动态解吸曲线

图4菊花比上柱量曲线

图5.菊花洗脱终点曲线

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

说明：

菊花总黄酮含量测定方法

①仪器与试药

北京普析通用仪器有限公司TU-1901型紫外可见分光光度仪，联想数字处理中心。木犀草苷对照品(供含量测定用)：购于中国药品生物制品检定所，批号为111720-200501，使用前置五氧化二磷减压干燥器中干燥24小时，使之恒重。甲醇为分析纯(北京化工厂)，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

②检测条件

检测波长：348nm，空白对照：甲醇。

③对照品溶液的制备

精密称取木犀草苷对照品9.4mg，置25ml量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

④工作曲线制作：

精确吸取0.1、0.4、0.8、1.2、1.6ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇作为空白，于348nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，木犀草苷对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为：Y＝43.098X-0.0117，R2＝0.9999。

以浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度Y值为纵坐标，进行线性回归，其回归方程为：Y＝3590.7X-188.06  (r＝0.9999)

结果表明，木犀草苷浓度在3.76μg/ml～60.16μg/ml范围内呈良好线性关系。

⑤供试品溶液的制备

取菊花提取物适量，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密移取1.0ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

⑥含量测定

取样品溶液置348nm处测定吸光度，记录吸光度值，代入工作曲线计算总黄酮含量。

实施例1本发明的一种纯化方法

(1)菊花提取：菊花经40％乙醇分别以12倍、8倍、8倍体积加热回流三次，每次1h，合并三次滤液，减压浓缩至药材质量∶体积为1∶2，过滤，备用。

(2)上柱：将菊花提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量为药材重量∶树脂体积为1.5∶1，至提取液全部进入树脂床。

(3)洗脱：以5BV体积的20％乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速为2BV/h，以除去杂质。然后以5BV体积的75％乙醇，控制流速为2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物。

实施例2选用不同条件进行提取

采用本发明提供的方法，选用不同条件进行菊花总黄酮提取实验，分别称取菊花药材20g，9份，按表1的因素水平分别进行正交试验，每次提取1小时，提取后滤液合并，减压浓缩至干，真空干燥至恒重，精密称取干膏适量，以甲醇溶于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。移取1.0ml滤液至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定总黄酮的含量，并对结果进行方差分析，结果见表2、3。

表1菊花提取正交实验因素水平表

表2菊花提取正交三因素三水平方差分析

表3正交试验方差分析表

^*：F_0.10(2，2)＝9.00^**：F_0.05(2，2)＝19.00

结果：方差分析结果表明，以提取总黄酮量为指标，因素C有极显著差异，因素A、B有显著性差异，考虑到工业生产乙醇的成本问题，选择低度乙醇，提取3次。由于菊花吸取溶媒体积膨胀，首次用醇量加大，因此选择加醇量分别为12倍、8倍、8倍。

结论：选择40％乙醇提取3次，加醇量分别为12倍、8倍、8倍。

正交实验中，未涉及提取时间，因此作一个以时间为单因素的实验：称取菊花10g，共4份，每份分别加入12倍，8倍，8倍40％的乙醇，加热回流三次，每次分别为0min(煮沸后浸泡)、30min、60min、90min，重复2次，结果见4、5。

结果：由表4、5可以看出，提取时间对总黄酮含量有显著影响，但60min和90min无明显差别，以节约能耗为主，选择回流60min。

结论：选择每次提取1小时

表4不同提取时间对菊花总黄酮含量的影响

表5单因素方差分析表

最佳工艺验证：称取菊花药材20g，分别加入12倍、8倍、8倍40％乙醇回流3次，每次1小时，重复3次。另取药材20g，共3份，加入14倍80％乙醇回流3次，每次1小时，重复3次。分别滤过，滤液合并，减压浓缩至干，真空干燥至恒重，精密称取干膏适量，以甲醇溶于25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。移取1.0ml滤液至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定总黄酮的含量，结果见表6。

表6验证优选菊花醇提工艺结果

结果：从表6可以看出，A₃B₃C₃比优选醇提工艺只高约4％，优选醇提工艺具有良好的重现性。

结论：选择以12倍、8倍、8倍40％乙醇回流3次，每次1小时提取。

实施例3选取树脂种类、药液浓度、吸附速率、上样量、乙醇洗脱浓度、洗脱速率、洗脱终点等6因素分别进行单因素试验，确定各因素的最佳值。

①上柱液制备称取菊花药材500g，按上述优选提取工艺提取，12倍、8倍、8倍40％乙醇回流3次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至比重为1.275(55℃)，加水稀释至500ml，静置24小时，滤过，上清备用，测得溶液中总黄酮含量为20.8mg·ml^-1。

②静态吸附取5种处理好的大孔树脂各10g，各加入菊花水溶液30ml(总黄酮浓度为4.16mg·ml^-1)，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液0.5ml于10ml量瓶中，于349nm处测定吸光度，计算各树脂对菊花总黄酮的吸附率。

③静态解析将静态吸附的树脂过滤抽干，加30ml 40％乙醇解吸，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液0.5ml于10ml量瓶中，按上述方法测定总黄酮浓度，计算各树脂对菊花总黄酮的解吸率。见表7、图1。

结果：从图1可以看出，5种树脂的吸附率都较大(大于90％)，SP850、SP700、SP70的解吸率都将近60％，其中SP70的解析率最大，选取SP850、SP700、SP70做动态吸附实验。

结论：选取SP850、SP700、SP70做动态吸附实验。

表7  5种大孔树脂对菊花总黄酮的吸附与解吸附率

④动态吸附取处理好的静态吸附优选3种树脂各15ml于柱内(1cm×13cm)，加菊花水溶液(总黄酮浓度为4.16mg·ml^-1)于柱顶，以0.5BV/h的流速进行动态吸附，按树脂床体积收集流出液，于349nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量，绘制各树脂的泄漏曲线，结果见表8、图2。

结果：从图2可以看出，SP70与SP850达到吸附饱和时，所吸附的总黄酮的量较大，SP70较SP850大。

结论：选取SP70和SP850做动态解吸试验。

表83种大孔树脂动态吸附结果

⑤动态解吸取处理好的SP70和SP850树脂各20ml于柱内(1cm×13cm)将总黄酮浓度为4.16mg·ml^-1的菊花水溶液30ml加于柱顶，以0.5BV/h的流速进行吸附后，用5BV75％以2BV/h的流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液，于349nm处测定吸光度，计算乙醇洗脱液总黄酮的含量，结果见表9、图3。

表9菊花动态解吸结果

结果：从图3可以看出，SP70较SP850的解吸效果好，因此选择SP70作为最佳树脂。

结论：选择SP70树脂。

⑥药液浓度考察取菊花水溶液(总黄酮浓度为20.8mg·ml^-1)10ml，分别稀释0、1.5、2、4、10倍，加入20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，以2BV/h的流速进行吸附后，以75％乙醇洗脱，收集洗脱液至100ml，于349nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果见表10。

表10菊花药液浓度考察结果

结果：从表10可以看出，当药液稀释2倍时，解析率最高，稀释1.5倍与稀释2倍相当，且比不稀释要高约2％，综合考虑生产时效因素，选择稀释1.5倍，即溶液体积(ml)∶生药重(g)＝1.5∶1。

结论：上柱液浓度为：溶液体积达到生药重的1.5倍。

⑦吸附速率考察取菊花水溶液(总黄酮浓度为20.8mg·ml^-1)10ml，加于20ml(1cm×13cm)，分别以0.5BV/h、1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、的流速进行吸附后，用5BV 75％以2BV/h的流速进行洗脱，于349nm处测定吸光度，计算乙醇洗脱液总黄酮的含量。结果见表11。

表11菊花吸附速率考察结果

结果：从表11可以看出，当吸附速率为0.5BV·h^-1时，吸附效果最好。

结论：吸附速率为0.5BV·h^-1。

⑧上样量考察取菊花水溶液(总黄酮浓度为20.8mg·ml^-1)加于20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，按树脂床体积收集流出液，于349nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果见表12、图4。

表12菊花上样量考察结果

结果：从图4可以看出，上样量为4倍树脂床体积(BV)时开始泄漏，7倍树脂床体积(BV)时达到吸附饱和，因此实际工艺中选择1.5倍树脂床体积(BV)上样量，即生药重(g)∶树脂体积(ml)＝1.5∶1。

结论：上样量为生药重(g)∶树脂体积(ml)＝1.5∶1。

⑨乙醇浓度考察取菊花水溶液(总黄酮浓度为20.8mg·ml^-1)150ml，加去离子水稀释至225ml(总黄酮浓度为13.86mg·ml^-1)，加于100ml(2.5cm×23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，分别用5BV水、5％、10％、20％、30％、40％、60％、80％乙醇以2BV/h流速进行洗脱，收集洗脱液至500ml，于349nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量，结果见表13。

表13菊花乙醇洗脱浓度考察结果

结论：从表13可以看出，当乙醇浓度为20％-60％时，总黄酮的含量最高，80％乙醇洗脱物中含量也较高，考虑与工业处理大孔树脂用75％，直接用75％洗脱后不需用高浓度乙醇处理树脂柱，因此选择先以20％乙醇洗脱，再以75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液。

结论：先以20％乙醇洗脱，再以75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液。

⑩洗脱速率考察取菊花水溶液(总黄酮浓度为20.8mg·ml^-1)10ml，分别稀释至溶液体积(ml)∶生药重(g)为1∶1、1.5∶1、2∶1、4∶1、、10∶1，加入20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以75％乙醇洗脱，收集洗脱液至100ml，于349nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果见表14。

表14菊花脱速率考察结果

结果：从表14可以看出，流速为1BV/h洗脱时解吸率最高，但与2BV/h洗脱相差不大，为提高效率可，用2BV/h流速洗脱较优。

结论：洗脱速率为2BV/h。

洗脱终点考察将吸附饱和的树脂75％乙醇以2BV/h流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液(20ml)，于349nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果见表15、图5。

表15菊花洗脱终点测定结果

结果：从图5可以看出，当洗脱液用4倍树脂床体积时，已基本将总黄酮洗净，选择以5倍乙醇洗脱。

结论：以5倍柱体积的乙醇洗脱。

最佳工艺验证：

取菊花水溶液(总黄酮浓度为20.8mg·ml^-1)150ml，加去离子水稀释至225ml(总黄酮浓度为13.86mg·ml^-1)，加于100ml(2.5cm×23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml 20％乙醇洗脱，再以500ml75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液至500ml，减压浓缩至干，60℃真空干燥8小时，测定干膏收率，计算总黄酮的含量，重复3次。结果见表16。

表16总黄酮得率及含量测定结果

结果：从表16可以看出，经SP70大孔树脂处理处理过的菊花水溶液，总黄酮含量可超过55％，达到66.23％，得率约2.4％，且具有良好的重现性。

实施例4  SP70大孔树脂反复使用稳定性考察

称取菊花药材1kg，按上述优选醇提工艺提取，提取液定容至1000ml。取菊花水溶液150ml，加水稀释至225ml，加于100ml(2.5cm×23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml 20％乙醇2BV速率洗脱，再以500ml 75％乙醇2BV/h速率洗脱，收集75％乙醇洗脱液至500ml，75％乙醇洗脱液减压浓缩至干，75℃真空干燥至恒重，测定总黄酮的含量，计算得率，在同一树脂柱上按上述步骤重复5次。结果见表17。

表17  SP70大孔树脂反复使用5个周期稳定性考察

结果：从表17可以看出上述树脂工艺在5个周期内产品得率及总黄酮含量较稳定，SP70树脂可以反复使用。

结论：使用SP70树脂产品得率及总黄酮含量在5个周期内较稳定。

本发明涉及的参考文献：

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13、中华人民共和国药典2005年版(一部).北京：化学工业出版社，2005.218.

Claims (11)

1.菊花总黄酮提取方法，具体方法是：将菊花经乙醇提取后，以大孔树脂吸附法将提取液经上柱、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得菊花总黄酮。

2.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：将菊花以10％～95％的乙醇提取，优选乙醇浓度为：20％～80％，最优选为：40％。

3.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：将菊花以乙醇提取三次，每次提取菊花质量与乙醇的体积比为1～20倍，优选提取体积为：4～14倍，最优选提取体积为：8～12倍。

4.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：菊花以乙醇提取三次，提取的时间为0.5～2h，最优选时间为：1h。

5.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP850、SP700、SP70，最优选SP70。

6.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：菊花提取液的上样量(菊花质量：树脂体积)为0.5∶1～8∶1，优选1∶1～4∶1，最优选1.5∶1。

7.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：洗脱剂为有机醇，优选项为乙醇。

8.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：洗脱液流速为1BV/h～5 BV/h，最优选为2BV/h。

9.如权利要求5所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：洗脱剂的洗脱浓度为5％～95％，最优选为20％～75％。

10.如权利要求1述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：洗脱剂的洗脱体积为1～10倍柱体积，优选为3～8倍柱体积，最优选为5倍柱体积。

11.如权利要求1所述的菊花总黄酮提取方法，其特征是：获得纯化的菊花总黄酮含量大于55％。

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