CN103664855A - 一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法:a备料:将新鲜莲房干燥并粉碎;b热回流抽提:向热回流提取罐内加入上述莲房粉末,随后加入6-10倍量提取溶剂,热回流抽提3-5次得提取液A,提取液浓缩得浓缩液B;c纯化:浓缩液B离心处理,上清液C过大孔吸附树脂,采用洗脱溶剂梯度洗脱,分别得到低聚体莲房原花青素洗脱液D、高聚体莲房原花青素洗脱液E;d浓缩干燥:将洗脱液D和E分别减压浓缩,真空干燥或者冷冻干燥得到产品低聚体莲房原花青素和高聚体莲房原花青素。该方法工艺简单,原料成本低廉,对环境友好,制得的原花青素纯度可达80%以上,低聚原花青素纯度可达90%以上,并实现低聚和高聚原花青素的分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法,属于一种原花青素的制备工艺。
背景技术
原花青素(Procyanidins)是一大类多酚化合物的总称,由不同数目的黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇聚合而成,按照聚合度大小,二至四聚体称为低聚原花青素,而五聚体以上则称为高聚原花青素。原花青素有强抗氧化作用,人体吸收度高,可以清除体内的自由基和活性氧,预防由于人体血液中低密度脂蛋白的氧化为主要原因而引起的动脉硬化。同时还有降压、保护心肌、抗辐射、抗微生物、促进细胞增殖活性、抗突变和抗癌等作用。其中低聚原花青素以其高效、低毒、高生物利用率引起了人们的极大兴趣。
莲房是睡莲科植物莲的成熟花托(又名莲蓬壳,lotus seedpod,简称LS),为2000版以前药典收载。在莲子加工过程中,人们从莲房中取出莲子后,莲房常常被大量丢弃,造成了植物资源的浪费,并污染环境。长期以来,人们对莲房化学成分研究较少。近年来,随着关注度的增加和相关研究的开展,发现莲房与葡萄籽类似,含有大量原花青素成分,莲房原花青素具有广泛的生物活性和药理作用,其所含原花青素中,低聚体原花青素占有相当高的比例。莲房可以作为原花青素的新的开发资源。
发明专利01109225.4一种从植物原料中提取低聚原花青素的方法,该方法包括步骤如下:将干燥的植物原料粉碎;制备含原花青素的浸出液;加入无机盐使杂质沉淀;以极性有机溶剂萃取低聚原花青素;以非极性有机溶剂使低聚原花青素从极性有机溶剂中析出;对析出的产物作纯化处理。
发明专利03117429.9一种从松树皮中提取低聚体原花青素的方法,生产工艺流程为:原药材→前处理→提取→回收溶媒、浓缩→固液分离→浓缩→高效逆流萃取→浓缩→干燥→灭菌、包装,其中采用水为提取溶媒,乙酸乙酯为萃取溶媒。
发明CN101845035A一种低聚原花青素的提取方法,公开了一种提取低聚原花青素的方法,其包括如下步骤:将含低聚原花青素的植物原料用溶剂提取所得的粗提物上大孔吸附树脂柱,用水洗脱除去蛋白质和多糖类杂质,之后再用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱:乙醇、甲醇和丙酮,收集以体积比为4∶1∶5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂,硅胶薄层层析板上Rf值为0.2~0.5的洗脱部分,即得低聚原花青素提取物。较现有技术,本发明的方法纯度和收率均有显著提高,低聚原花青素收率可达80%以上,产品纯度≥50%。
CN03137933.8葡萄籽低聚原花青素的提取方法,发明涉及一种葡萄籽低聚原花青素的提取方法,该方法首先是将葡萄籽进行粉碎、过筛、脱脂得到葡萄籽渣,再将葡萄籽渣经含无机矿酸的有机溶剂提取、过滤、无机碱中和、过滤、减压浓缩后即可得到原花青素粗提物,再将粗提物中加入石油醚或三氯甲烷,放置、过滤、干燥得到精制原花青素。利用该方法可从葡萄酒厂的下脚料葡萄籽中快速、简单提取得到含量大于60%,收率可达2%的低聚原花青素。
目前已有文献报道及专利公开低聚原花青素的纯化制备方法,主要是以松树皮、葡萄籽及沙棘等植物为原料经过提取、分离得到。但是这些方法都或多或少存在缺陷。专利申请号01109225.4和03117429.9发明专利中采用乙酸乙酯等有机溶剂萃取方法分离原花青素的低聚体和高聚体,但萃取法所得低聚体原花青素得率低,且较难分离。王继森以AB-8大孔树脂通过30%乙醇洗脱纯化莲房原花青素,得到原花青素纯度为59.85%,纯度较低。凌志群采用Sephadex-LH20柱层析分离纯化莲房原花青素,得到莲房原花青素纯度大于98%,但是该方法成本高昂,不适用于工业生产。段玉清等比较了14种大孔树脂对莲房原花青素的纯化效果,选择DM130树脂,以50%乙醇洗脱时,得到原花青素纯度为95.31%,未能实现分离低聚及高聚原花青素的分离,且没有总收率的报道。
发明内容
本发明提供一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法,选用低成本的莲房作为原料,工艺简单、稳定性好。
本发明是通过以下的技术方案实现的:
a、备料:将新鲜莲房干燥,粉碎;
b、热回流抽提:向热回流提取罐内加入上述莲房粉末,随后加入6-10倍量提取溶剂,热回流抽提3-5次得提取液A,提取液浓缩得浸膏B;
c、纯化:浸膏B离心处理,上清液C过大孔吸附树脂,采用洗脱溶剂梯度洗脱,分别得到低聚体莲房原花青素洗脱液D、高聚体莲房原花青素洗脱液E;
d、浓缩干燥:将洗脱液D减压浓缩,真空干燥或者冷冻干燥得到产品低聚体莲房原花青素和高聚体莲房原花青素;
所述步骤d中的上清液C过大孔吸附树脂的上样体积和流速精确控制方式具体为:在大孔吸附树脂柱的进口处安装第一流量计,第一流量计连接一个变频泵,第一流量计将信息传输给控制系统,该控制系统经过运算给出调节信号,改变所述变频泵频率,调节流速并控制上样体积;
所述步骤d中的得到洗脱液D的洗脱流速控制方式具体为:在大孔吸附树脂柱的出口处安装第二流量计,第二流量计连接所述变频泵,第二流量计将实际流速信号反馈给所述控制系统,所述控制系统通过运算确定流速调大或调小,同时将执行信号发送给所述变频泵;
所述步骤d中的得到洗脱液D的洗脱终点的确定方式具体为:在大孔吸附树脂柱的出液口连接一个紫外可见分光光度计,预先测得所述洗脱溶剂的吸光度值f,开始洗脱,测定所述洗脱液D的吸光度值F,当f-0.01<F<f+0.01,为洗脱终点。
所述步骤a所述新鲜莲房干燥采用晒干、阴干或者烘干方法至含水量小于15%,莲房粉碎至10目以下。
所述步骤b所用提取溶剂为水、水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮中的一种,有机溶剂占水体积的40%-60%。
所述步骤b选择水作为提取溶剂提取,所述滤液A不进行步骤c浓缩。
所述步骤b浓缩至0.05-0.3g/mL生药。
所述步骤c离心转速为2000-13000rpm/min,离心10-30min。
所述步骤c所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂、D-101型大孔吸附树脂和HZ-818型大孔吸附树脂中的一种;所述大孔树脂的上样体积为4倍树脂体积;大孔树脂的上样速度为每小时2倍大孔树脂体积。
所述步骤d所述大孔树脂纯化步骤,上样后先用4倍大孔树脂体积的去离子水洗脱杂质;洗杂速度为每小时2倍大孔树脂体积。
本发明可以根据产品要求聚合度的不同采用不同的洗脱方式:当产品要求混合聚合度原花青素,大孔树脂洗脱液醇浓度为20-100%;当产品要求同时分离低聚和高聚莲房原花青素,则采用梯度洗脱,第一部分洗脱液醇浓度为10%-50%,第二部分洗脱液醇浓度为50%-100%,大孔树脂洗脱速度为每小时1-5倍树脂体积,洗脱溶剂量为2-10倍树脂体积。
所述步骤e中采用40-80℃真空干燥,或者-40℃~-50℃冷冻干燥。
本发明得到的莲房原花青素性状为棕红色粉末,易溶于水和稀醇溶液。
本发明的有益效果为:
1、本发明采用热回流抽提法提取莲房原花青素,提取和浓缩在同一设备中完成,节能环保,节省成本;
2、本发明采用大孔树脂纯化莲房原花青素,工艺简单,原料成本低廉,对环境友好;
3、本发明提取得到的莲房原花青素收率为3%,纯度可达80%以上,低聚原花青素纯度可达90%以上;
4、本发明制备莲房原花青素可以同时分离低聚和高聚原花青素。
5、可作为食品、药品、保健品、化妆品等的添加剂。
附图说明
图1莲房原花青素洗脱曲线
采用不同体积的洗脱液,得到的原花青素的浓度有高低之分。
图2是大孔吸附树脂连接的上样和洗脱控制装置
具体实施方式
以下结合附图和实施例,对本发明做进一步说明。
如图2,是大孔吸附树脂连接的上样和洗脱控制装置,大孔吸附树脂柱1的入口处连接第一流量计2,大孔吸附树脂柱的出口处连接第二流量计3,第一流量计2和第二流量计3同时连接一个变频泵4;另外,大孔吸附树脂柱1出口处还连接一个紫外可见分光光度计5。本装置的第一流量计2、第二流量计3、变频泵4和紫外可见分光光度计5均通过一个控制系统进行控制。本装置主要负责:
上清液C过大孔吸附树脂的上样体积和流速精确控制:具体方式为:第一流量计将信息传输给控制系统,该控制系统经过运算给出调节信号,改变所述变频泵频率,调节流速并控制上样体积;
得到洗脱液D的洗脱流速控制方式,具体为:第二流量计将实际流速信号反馈给所述控制系统,所述控制系统通过运算确定流速调大或调小,同时将执行信号发送给所述变频泵;
得到洗脱液D的洗脱终点的确定方式,具体为:紫外可见分光光度计预先测得所述洗脱溶剂的吸光度值f,开始洗脱,测定所述洗脱液D的吸光度值F,当f-0.01<F<f+0.01,为洗脱终点。
实施例1
a提取:取干燥莲房粉末1738g,加入10倍量水,热回流抽提3次,提取液浓缩。
b纯化与洗脱:将浓缩液在2000rpm/min离心30min,上清液上大孔吸附树脂采用AB-8型大孔吸附树脂,AB-8型大孔吸附大孔树脂的上样体积为4倍树脂体积,上样速度为每小时2倍大孔树脂体积。先用水4BV以2BV·h-1流速洗杂,再用质量分数为20%乙醇洗脱,用量为2倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,洗脱速度为每小时2倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,收集洗脱液。
c浓缩干燥:洗脱液减压浓缩,浓缩液在-20℃预冻,在-50℃冷冻干燥24h,得到莲房原花青素粉末53.9g,纯度为93.2%,平均聚合度为2.62。
实施例2
a提取:取干燥莲房粉末1000g,提取液为水-乙醇溶液,乙醇溶液浓度为50%,料液比8倍量,热回流抽提5次,提取液浓缩至生药浓度为0.18g/ml。
b纯化与洗脱:将浓缩液6500rpm/min离心20min,上清液上大孔吸附树脂AB-8型大孔吸附树脂,AB-8型大孔吸附大孔树脂的上样体积为4倍树脂体积,上样速度为每小时2倍大孔树脂体积。先用水4BV以2BV·h-1流速洗杂,再用质量分数为30%乙醇洗脱,用量为3倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,洗脱速度为每小时5倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,收集洗脱液。
d浓缩干燥:洗脱液减压浓缩,浓缩液在-20℃预冻,在-40℃冷冻干燥24h,得到莲房原花青素粉末32g,纯度为91.5%,平均聚合度为3.1。
实施例3
a提取:取干燥莲房粉末1500g,提取液为水-甲醇溶液,甲醇浓度40%,料液比6倍量,热回流抽提4次,提取液减压浓缩至生药浓度为0.3g/ml。
b纯化与洗脱:将浓缩液11000rpm/min离心30min,上清液上大孔吸附树脂D-101型大孔吸附树脂,D-101型大孔吸附大孔树脂的上样体积为4倍树脂体积,上样速度为每小时2倍大孔树脂体积。用水4BV以2BV·h-1流速洗杂,先用质量分数为10%的乙醇洗脱,用量为5倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,洗脱速度为每小时6倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,收收集洗脱液。再用质量分数为50%乙醇洗脱,用量为5倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,洗脱速度为每小时5倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,收收集洗脱液,测定原花青素含量,得到洗脱曲线见图1,可以看出,梯度洗脱分离了不同聚合度的原花青素。
d浓缩干燥:洗脱液分别减压浓缩,浓缩液在-20℃预冻,在-45℃冷冻干燥24h,得到低聚体莲房原花青素粉末48.15g,纯度92.9%,平均聚合度为2.55,高聚体粉末8.85g,纯度85.6%。
实施例4
a提取:取干燥莲房粉末600g,提取液为水-丙酮溶液,丙酮浓度为60%,液料比为7倍量,热回流抽提3次,提取液浓缩至生药浓度为0.05g/ml。
c纯化与洗脱:提取液5000rpm/min离心25min,上清液上大孔吸附树脂HZ-818型大孔吸附吸附树脂,HZ-818型大孔吸附大孔树脂的上样体积为4倍树脂体积,上样速度为每小时2倍大孔树脂体积。用水4BV以2BV·h-1流速洗杂,先用10%乙醇洗脱,收集洗脱液。用量为5倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,洗脱速度为每小时8倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,再用60%乙醇洗脱,收集洗脱液。用量为5倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,洗脱速度为每小时10倍AB-8型大孔吸附树脂的体积,
d浓缩干燥:洗脱液分别减压浓缩,浓缩液在-20℃预冻,在-50℃冷冻干燥24h,得到莲房原花青素低聚体粉末11g,纯度92.7%,高聚体粉末8.2g,纯度83.8%。
本发明使用的滴定方法为香草醛-盐酸法,具体为:
原花青素含量测定采用香草醛-盐酸法。移取不同浓度原花青素对照品和供试品(甲醇空白)1mL至10mL具塞试管,加入3%香草醛-甲醇(W/V)溶液3mL和浓盐酸1.5mL,摇匀,于30℃水浴中避光显色15min,取出,照紫外-可见分光光度法在500nm波长处测定吸光度。
以乙酸作溶剂,香草醛只与末端黄烷-3-醇发生缩合反应。采用传统的香草醛法测定原花青素的质量,同时建立以乙酸为溶剂,使香草醛只与原花青素末端黄烷-3-醇反应来测定原花青素的物质的量的方法,两者结合即可求出原花青素平均分子质量,进而求得原花青素的平均聚合度。
以冰乙酸为空白,精密移取1mL供试品与儿茶素对照品溶液,加入4%盐酸-1%香草醛冰乙酸溶液5mL,20℃避光反应10min,照紫外-可见分光光度法在500nm波长处测定,计算儿茶素物质的量。
平均聚合度测定DP=(m1-m2)/(M×n)m1为原花青素质量μg,m2为单体儿茶素质量μg,n为原花青素物质的量μmoL,M为单体儿茶素的相对分子量。
Claims (3)
1.一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法,其特征在于按照以下步骤实现的:
a、备料:将新鲜莲房干燥,粉碎;
b、热回流抽提:向热回流提取罐内加入上述莲房粉末,随后加入6-10倍量提取溶剂,热回流抽提3-5次得提取液A,提取液浓缩得浓缩液B;
c、纯化:浓缩液B离心处理,上清液C过大孔吸附树脂,采用洗脱溶剂梯度洗脱,分别得到低聚体莲房原花青素洗脱液D、高聚体莲房原花青素洗脱液E;
d、浓缩干燥:将洗脱液D减压浓缩,真空干燥或者冷冻干燥得到产品低聚体莲房原花青素和高聚体莲房原花青素;
所述步骤c中的上清液C过大孔吸附树脂的上样体积和流速精确控制方式具体为:在大孔吸附树脂柱的进口处安装第一流量计,第一流量计连接一个变频泵,第一流量计将信息传输给控制系统,该控制系统经过运算给出调节信号,改变所述变频泵频率,调节流速并控制上样体积;
所述步骤c中的得到洗脱液D的洗脱流速控制方式具体为:在大孔吸附树脂柱的出口处安装第二流量计,第二流量计连接所述变频泵,第二流量计将实际流速信号反馈给所述控制系统,所述控制系统通过运算确定流速调大或调小,同时将执行信号发送给所述变频泵;
所述步骤c中的得到洗脱液D的洗脱终点的确定方式具体为:在大孔吸附树脂柱的出液口连接一个紫外可见分光光度计,预先测得所述洗脱溶剂的吸光度值f,开始洗脱,测定所述洗脱液D的吸光度值F,当f-0.01<F<f+0.01,为洗脱终点。
2.如权利要求1中所述的一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法,其特征在于所述步骤b所用提取溶剂为水、水-乙醇、水-丙酮、水-加醇中的一种,有机溶剂占水体积40%-60%。
3.如权利要求1中所述的一种高纯度低聚体莲房原花青素制备方法,其特征在于所述步骤c大孔树脂采用洗脱溶剂梯度洗脱具体过程为:先用水洗杂,再用10%-50%乙醇水溶液洗脱得低聚体莲房原花青素洗脱液D,最后用50%-100%乙醇水溶液洗脱得莲房原花青素E洗脱液。
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