CN105219815A

CN105219815A - 一种表儿茶素单体的制备方法

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Publication number: CN105219815A
Application number: CN201510747468.1A
Authority: CN
Inventors: 叶艳; 龙菲菲; 罗祥; 马松; 吴世华
Original assignee: Hubei Zhongxin Biotech Co Ltd
Current assignee: Hubei Zhongxin Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明涉及一种表儿茶素单体的制备方法，包括如下步骤：（1）向含有大叶种绿茶儿茶素提取物的溶液中添加单宁酶，在30℃～35℃下静止酶解，间歇搅拌，离心过滤，得酶解液；（2）将酶解液通入装有吸附树脂的层析柱，并用乙醇洗脱剂进行分级洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；将浓缩液在0～4°C温度下放置48～72h，添加少量表儿茶素单体结晶和重结晶，离心、干燥得到表儿茶素（EC）单体。本发明所述方法使用单宁酶对表儿茶素没食子酸酯进行酶解，具有较好的转化效果，是一种转化率高，产品纯度高的制备方法，而且制备周期短，成本低，适宜规模化生产。

Description

一种表儿茶素单体的制备方法

技术领域

本发明属于儿茶素的制备领域，具体涉及一种表儿茶素单体的制备方法。

背景技术

儿茶素是茶叶中最重要的生理活性物质，约占多酚类80%，属黄烷醇类，其基本结构是α-苯基苯并吡喃，分为酯型和非酯型两类，结构上的主要区别在于氢基取代的数量和位置不同。儿茶素主要由表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表儿茶素(EC)单体组成。儿茶素具有明显的抗衰老、防癌抗突变、降脂减肥、降低血糖、血脂和胆固醇、预防心血管疾病等药理功能，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域。卫生部已批准了茶多酚为我国食品添加剂。国内外研究成果表明，EC可防心血管疾病，预防癌症，抗氧化作用，具有明显的抗衰老功能，有望开发成为一种天然的护肤品。从1990开始，由于有关茶多酚/儿茶素的保健与药理功能研究的突破，不仅扩大了绿茶在国际市场上的份额，而且极大地推进了我国茶叶深加工产业的快速发展，为茶叶功能成分的研究与开发奠定了良好的产业与市场基础，目前，我国已经形成年产5000多吨茶多酚/儿茶素的产业规模。儿茶素粗品传统的提取分离工艺主要包括离子沉淀法、有机溶剂萃取法和吸附柱色谱法。由于茶叶的功能成分复杂，从茶叶中制取高纯度的表儿茶素单体具有相当难度。迄今，国内外尚未有表儿茶素（EC）单体制备方面的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表儿茶素单体的制备方法，该方法简便，只使用酒精溶剂，制备周期短，成本低，符合绿色和安全的要求，表儿茶素单体的提取率及产品纯度高，适宜规模化生产。

本发明提供的技术方案是：一种表儿茶素单体的制备方法，包括如下步骤：

（1）加入纯水溶解大叶绿茶儿茶素提取物，配置成浓度为5%w/v的溶液，加入柠檬酸调节pH为4.0～5.0，制得茶汤料液，备用；

（2）按照0.025%w/v的比例，在茶汤料液中添加单宁酶，在30℃～35℃下静止酶解，间歇搅拌，得酶解液，离心过滤；

（3）将步骤（2）中过滤后的上清液通过装有吸附树脂的层析柱，并用乙醇水溶液进行分级洗脱，收集洗脱液，将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；

（4）将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72h，按照浓缩液总质量0.1～0.2%的比例添加少量表儿茶素单体，对浓缩液进行结晶和重结晶，离心、干燥，得到表儿茶素单体。

对上述技术方案的进一步说明：步骤（2）中，加入单宁酶酶解，可以将表儿茶素没食子酸酯（ECG）水解成为表儿茶素和没食子酸，从而提高粗品中表儿茶素的含量，为后续树脂分离工艺提供较高含量底物，同时减少分离过程中表儿茶素没食子酸酯（ECG）的影响。

对上述技术方案的进一步限定：步骤（2）中，静置酶解时间为4-6小时，每间歇30分钟搅拌5分钟，在1000r/min的转速下离心过滤。

对上述技术方案的进一步限定：步骤（3）中吸附树脂层析柱中的吸附树脂用量：50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速：1.0BV/h；解吸溶剂：10%、30%和80%乙醇水溶液；三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV；解吸流速：1.0BV/h，收集30%乙醇洗脱液。

对上述技术方案的再进一步限定：所述吸附树脂为ADS-8、HPD-450和HPD-450A之一。

本发明所述的一种制备表儿茶素（EC）单体的方法，采用由单宁酶直接对表儿茶素没食子酸酯（ECG）进行酶解，使得表儿茶素没食子酸酯（ECG）水解为表儿茶素（EC），成功解决了表儿茶素（EC）与酯型儿茶素（ECG和EGCG）难以分离的技术难题；同时，采用优选的吸附树脂ADS-8、HPD-450和HPD-450A可以有效分离表儿茶素（EC）与表儿茶素没食子酸酯（ECG），对酯型儿茶素的水解产物没食子酸和其它杂质吸附率低，解决了表儿茶素（EC）与其它杂质的分离，从而成功实现了表儿茶素（EC）单体的制备。

本发明具有的有益效果：本发明方法以大叶绿茶儿茶素提取物为原料，联用酶工程技术，经过单宁酶酶解，吸附树脂柱色谱与结晶、重结晶技术，从绿茶提取物中分离纯化表儿茶素（EC纯度>98%）单体，优化了产品分离纯化工艺流程，单体提取率及产品纯度高。产品可防心血管疾病，预防癌症，抗氧化作用，具有明显的抗衰老功能，有望开发成为一种天然的护肤品。也是许多功能食品开发的重要原料，可单独或者与维生素类、天然植物成分复配应用于保健食品、化妆品等领域。本发明方法简便，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，适宜规模化生产。

具体实施方式

实施例1

1、取大叶绿茶儿茶素提取物100克，配成2000ml儿茶素溶液，加入柠檬酸调节pH为4.0～5.0，向所述溶液中添加0.5克单宁酶，在30～35℃下酶解4小时，每间歇30分钟搅拌5分钟，将酶解液在1000r/min条件下离心过滤；

2、将步骤1中过滤后的上清液缓慢通过装有ADS-8吸附树脂的层析柱，并分别用10%、30%、80%的乙醇水溶液依次洗脱，吸附树脂用量：50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速：1.0BV/h；三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV；解吸流速：1.0BV/h；收集30%的乙醇洗脱液，并将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；

3、将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72小时，按照浓缩液总质量0.1%的比例添加少量表儿茶素（EC）单体对浓缩液进行结晶和重结晶，然后离心、干燥得到10.25g白色固体。将步骤3得到的白色固体与表儿茶素（EC）标准品（购自美国Sigma-Aldrich公司，C₁₅H₁₄O₆，M.W.290.27，编号：E4018，纯度≥98%（HPLC））对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测（鉴定、检测结果为：所述白色固体，分子量为290，(-)ESI-MSm/z：289[M－H]-，熔点240oC，分子式为：C₁₅H₁₄O₆，表明所述白色固体为表儿茶素（EC）单体，而且纯度≥98%。

实施例2

1、取大叶绿茶儿茶素提取物100克，配成2000ml儿茶素溶液，加入柠檬酸调节pH为4.0～5.0，向所述溶液中添加0.5克单宁酶，在30～35℃下酶解5小时，间歇30分钟搅拌5分钟，将酶解液在1000r/min条件下离心过滤。

2、将步骤1中过滤后的上清液缓慢通过装有HPD-450吸附树脂的层析柱，并分别用10%、30%、80%的乙醇水溶液洗脱，吸附树脂用量：50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速：1.0BV/h；三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV；解吸流速：1.0BV/h；收集30%的乙醇洗脱液，并将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液。

3、将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72小时，按照浓缩液总质量0.2%的比例添加少量表儿茶素（EC）单体对浓缩液进行结晶和重结晶，然后离心、干燥得到11.36g白色固体。将步骤3得到的白色固体与表儿茶素（EC）标准品（购自美国Sigma-Aldrich公司，C₁₅H₁₄O₆，M.W.290.27，编号：E4018，纯度≥98%（HPLC））对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测（鉴定、检测结果为：所述白色固体，分子量为290，(-)ESI-MSm/z：289[M－H]-，熔点240oC，分子式为：C₁₅H₁₄O₆，表明所述白色固体为表儿茶素（EC）单体，而且纯度≥98%。

实施例3

1、取大叶绿茶儿茶素提取物100克，配成2000ml儿茶素溶液，加入柠檬酸调节pH为4.0～5.0，向所述溶液中添加0.5克单宁酶，在30～35℃下酶解6小时，间歇30分钟搅拌5分钟，将酶解液在1000r/min条件下离心过滤。

2、将步骤1中过滤后的上清液缓慢通过装有HPD-450A吸附树脂的层析柱，并分别用10%、30%、80%的乙醇水溶液洗脱，吸附树脂用量：50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速：1.0BV/h；三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV；解吸流速：1.0BV/h；收集30%的乙醇洗脱液，并将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；

3、将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72小时，按照浓缩液总质量0.2%的比例添加少量表儿茶素（EC）单体对浓缩液进行结晶和重结晶，然后离心、干燥得到11.19g白色固体；将步骤3得到的白色固体与表儿茶素（EC）标准品（购自美国Sigma-Aldrich公司，C₁₅H₁₄O₆，M.W.290.27，编号：E4018，纯度≥98%（HPLC））对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测（鉴定、检测结果为：所述白色固体，分子量为290，(-)ESI-MSm/z：289[M－H]-，熔点240oC，分子式为：C₁₅H₁₄O₆，表明所述白色固体为表儿茶素（EC）单体，而且纯度≥98%。

在本发明中，对添加表儿茶素单体的进一步说明：添加少量表儿茶素单体的作用是加速表儿茶素的结晶，如果不添加表儿茶素结晶速度慢或者不能结晶。

对本发明的进一步说明：30%的乙醇洗脱液为高含量的表儿茶素溶液；采用浓度为80%的乙醇水溶液主要目的是洗脱其它吸附在树脂上的儿茶素成分，以便再次使用树脂；所述BV为层析柱（树脂柱）内装载树脂的体积。

以上实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中，所述大叶绿茶儿茶素提取物购自长沙飞拓植物制品有限公司，单宁酶购自诺维信酶制剂公司，（本发明中“添加少量表儿茶素单体对浓缩液进行结晶和重结晶”）表儿茶素(95%)单体购自杭州禾田生物技术有限公司。

Claims

1.一种表儿茶素单体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种表儿茶素单体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，静置酶解时间为4～6小时，每间歇30分钟搅拌5分钟，在1000r/min的转速下离心过滤。

3.根据权利要求1或2所述的一种表儿茶素单体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中吸附树脂层析柱中的吸附树脂用量：50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速：1.0BV/h；解吸溶剂：10%、30%和80%乙醇水溶液；三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV；解吸流速：1.0BV/h，收集30%乙醇洗脱液。

4.根据权利要求3所述的一种表儿茶素单体的制备方法，其特征在于：所述吸附树脂为ADS-8、HPD-450和HPD-450A其中之一。