CN102443614B - 表没食子儿茶素（egc）单体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素单体的方法，本发明方法以绿茶提取物为原料，经过单宁酶酶解，吸附树脂柱色谱吸附后以含水乙醇洗脱，收集富含表没食子儿茶素（EGC）解吸馏分，高效外循环浓缩回收乙醇,再用反渗透膜低温浓缩，结晶处理，最终冷冻干燥得到高纯度的表没食子儿茶素（EGC）单体。本发明方法简便，单体提取率及产品纯度高，制备周期短，成本低，适宜规模型工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素（EGC）单体的方法，属于食品技术领域。
背景技术
儿茶素类物质具有明显的抗衰老、防癌抗突变、去脂减肥、降低血糖、血脂和胆固醇、预防心血管疾病等药理功能，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域（王婧，高玉堂. 茶多酚抗癌的流行病学研究 [J].肿瘤, 2011, 31(6): 553-556；刘学铭, 梁世中. 茶多酚的保健和药理作用及应用前景 [J].食品与发酵工业, 1998, 24(5):47-51,71； Yokozawa Tx, Dong Ex, Nakagawa Tx, el al. In vitro and in vivo studies on the radical scavenging activity of tea [J]. J Agric Food Chem, 1998,46(6):2143-2150）。2006年10月，美国食品和药物管理局(FDA)批准茶多酚作为新的处方药，用于局部（外部）治疗由人类乳头瘤病毒引起的生殖器疣，这是FDA根据1962年药品修正案条例首个批准上市的植物（草本）药（黄芳华. 从美国首个被批准植物药探讨中药药代动力学研究与评价策略[J].中国中药杂志, 2010, 35(7):932-935）。过去的二十年中，由于有关茶多酚/儿茶素的保健与药理功能研究的突破，不仅扩大了绿茶在国际市场上的份额，而且极大地推进了茶叶提取物产业的发展，为茶叶功能成分的研究与开发奠定了良好的产业与市场基础，目前，我国已经形成年产约5000吨茶多酚/儿茶素的产业规模。儿茶素粗品传统的提取分离工艺主要包括离子沉淀法、有机溶剂萃取法和吸附柱色谱法（黄思勇, 金显平, 康振兴, 干国平. 茶叶下脚料中茶多酚的提取纯化工艺研究 [J]. 湖北中医药大学学报, 2011, 13(4): 30-32；张盛，刘仲华，黄建安，刘爱玲，施兆鹏. 吸附树脂法制备高纯儿茶素的研究 [J]. 茶叶科学，2002，22（2）：125-130；胡莉娟. 绿茶中茶多酚的提取工艺研究 [J]. 云南农业大学学报, 2011, 26(3):426-429）。儿茶素药理保健功能研究与产业应用中最令人注目的是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC，分子式C15H14O7）和表儿茶素没食子酸酯（ECG），因而成为儿茶素单体分离、纯化与临床应用研究的焦点。但是由于茶叶的成分复杂，从茶叶中制取高纯度的儿茶素单体具有相当难度。其技术难点是精细分离，同时还应防止有效物及茶叶赋有的天然风味不被破坏和损失，加工过程尽量采用低温。目前国内外比较成功的应用于EGCG单体分离制备的工艺主要包括高速逆流色谱萃取、模拟移动床色谱分离等技术（Zhang Ying, Shi Zhao-peng, Nie Hong-yong, et al. Preparative Isolation and Purification of Catechins from Green Tea Extract by Preparative Counter-current Chromatography [J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Science), 2003, 29(5): 408-411, 417；黄永东，江和源，江用文，等. 传统SMB、Varicol和Partial-discard工艺分离纯化ECG和EGCG的比较研究[J]. 茶叶科学，2011，31（3）：201-210）。研究表明，EGC在诱导乳腺癌细胞凋亡（David Vergote, C′ecile Cren-Oliv′e, Val′erie Chopin, et al. (?)-Epigallocatechin (EGC) of green tea induces apoptosis of human breast cancer cells but not of their normal counterparts [J]. Breast Cancer Research and Treatment, 2002, 76: 195-201），食品抗氧化、抑菌上具有显著功效（Zhen-Yu Chen, Li-Ya Wang, Ping Tim Chan, et al. Antioxidative activity of green tea catechin extract compared with that of rosemary extract [J]. JOURNAL OF THE AMERICAN OIL CHEMISTS' SOCIETY, 1998, 75(9): 1141-1145），同时可降低茶饮料苦涩味，提高产品稳定性，为茶叶提取物深度开发与利用提供了新的途径。迄今，国内外尚未有EGC单体分离纯化方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素单体的方法，该方法简便，单体提取率及产品纯度高，制备周期短，成本低。
本发明提供的技术方案是：一种从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素单体的方法，该方法包括如下步骤：
（1）加入纯水溶解绿茶提取物茶多酚，配置成浓度为5%（w/v）的溶液，加入柠檬酸调节pH,值 4.0~5.0，保持温度35~40℃，茶汤料液备用；
（2）按照茶汤料液0.02%（w/v）的重量加入单宁酶，静置酶解，间歇搅拌；离心过滤，取澄清液喷雾干燥，得到喷雾干粉；
（3）加入水溶解上述喷雾干粉配置成浓度为3%（w/v）的上柱料液，吸附树脂柱分离纯化，解吸溶剂为乙醇，高效外循环浓缩回收乙醇至酒精度<5，再用反渗透膜浓缩解吸馏分，将浓缩后的解吸馏分离心、喷雾干燥得到干燥产品；
（4）将上述干燥产品用3~4倍量（w/v）95%乙醇溶解，放置，结晶，将晶体冷冻干燥，得白色固体，即为表没食子儿茶素单体。
本发明方法的第（2）步中，加入单宁酶酶解，可以将表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）水解成为表没食子儿茶素（EGC）和没食子酸，从而提高粗品中EGC的含量，为后续树脂分离工艺提供较高含量底物，同时减少分离过程中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的影响。
上述的方法，（2）步中所述单宁酶的酶活力为200—500 U/mg，为诺维信公司的 NS-33049，酶活力 228 U/mg；Fluka公司的Tannase，酶活力314U/ mg；或Kikkoman公司的Tannase，酶活力 500U/ mg产品之一。
上述的方法，第（2）步中，加入单宁酶，静置酶解4小时，间歇30分钟搅拌5分钟；1000 r/min离心过滤，内衬200目绢布袋，取澄清液用离心喷雾塔喷雾干燥，控制进风温度160℃～180℃，排风温度70℃～80℃。
上述的方法，第（3）步所述的吸附树脂柱分离纯化，其中，树脂用量：40倍EGC粗品重量；上柱流速：1.0 BV/h；解吸溶剂：2BV 60%乙醇；解吸流速：1.0BV/h，收集乙醇解吸馏分，高效外循环浓缩回收乙醇至酒精度<5, 温度控制在45℃以下，真空度控制在-0.08Mpa以下，再用反渗透膜浓缩时操作温度控制在40℃以下，进膜压力控制在15 Bar以下；所述吸附树脂为HP20、NKA-9、聚酰胺或HPD100之一。
上述的方法，第（4）步中，放置温度为4℃，结晶，滤纸常压过滤后将晶体冷冻干燥，产品首先降温至-40℃预冻结，然后开始抽真空，真空度至30Pa时开始加热升华干燥，控制产品温度不超过20℃，干燥时长12~16h。
本发明具有以下有益效果：
本发明方法以绿茶提取物为原料，联用单宁酶酶解工艺，经过单宁酶酶解，吸附树脂柱色谱与反渗透膜浓缩技术，从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素（EGC纯度>98%）单体，优化了产品分离纯化工艺流程，单体提取率及产品纯度高。产品没有传统茶叶提取物的苦涩味，具有醇和回甘的滋味和良好的溶解性，是高效型功能饮料开发的首选原料。由于其风味上具有较好的中和性，也是许多功能食品开发的重要原料，可单独或者与维生素类物质复配应用于食品、药品和保健品领域。方法简便，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，适宜规模型工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素单体的方法，该方法包括如下步骤：
1、利用单宁酶将绿茶提取物中的表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate, EGCG）转化为表没食子儿茶素（EGC）：
（1）加入纯水溶解绿茶提取物95%茶多酚（95%茶多酚购自长沙三福生物科技有限公司，其中总儿茶素含量为76.50%，EGC含量为5.60%，EGCG含量为43.80%），配置成浓度为5%（w/v）的溶液，加入柠檬酸调节pH= 4.20，保持温度37+1℃，茶汤料液备用；
（2）按照茶汤料液0.02%（w/v）的重量加入单宁酶，静置酶解4小时，间歇30分钟搅拌5分钟；1000 r/min三足离心机离心过滤，内衬200目绢布袋，取澄清液用离心喷雾塔喷雾干燥，控制进风温度160℃～180℃，排风温度70℃～80℃，一级旋风分离器每隔30分钟取出喷雾干粉。
上述的单宁酶为诺维信公司的 NS-33049，酶活力 228 U/mg；Fluka公司的Tannase，酶活力314U/ mg；或Kikkoman公司的Tannase，酶活力 500U/ mg产品之一。
2、将上述喷雾干粉经吸附树脂柱色谱分离纯化：
（1）纯水溶解喷雾干粉配置成浓度为3%（w/v）的上柱料液，吸附树脂柱分离纯化（吸附树脂为HP20、NKA-9、聚酰胺或HPD100之一；树脂用量：40倍EGC粗品重量；上柱流速：1.0 BV/h；解吸溶剂：2BV 60%乙醇；解吸流速：1.0BV/h）；
（2）收集解吸馏分，高效外循环浓缩回收乙醇至酒精度<5,再采用反渗透膜系统进一步浓缩解吸馏分，反渗透膜操作温度控制在40℃以下，进膜压力控制在15 Bar以下（具体操作可参考：孙艳娟，朱跃进，李大伟，等. 膜分离技术在香菇速溶茶开发中的应用研究 [J].中国茶叶加工, 2010, (4): 42-45； 郑远斌，郁军，陈添顺，等.冷冻干燥工艺原理及相关设备装置 [J].速溶罗汉果粉的研制, 2010, 31(18): 450-452）。离心、喷雾干燥得到干燥产品。
3、将上述干燥产品用3~4倍量（w/v）95%乙醇溶解，4℃放置结晶处理，滤纸常压过滤后将晶体冷冻干燥，具体过程是：首先将产品降温至-40℃预冻结，然后开始抽真空，真空度至30Pa时开始加热升华干燥，控制产品温度不超过20℃，干燥时长12~16h（具体操作可参考：朱传江. 冷冻干燥工艺原理及相关设备装置 [J].齐鲁药事, 2006, 25(8): 503-504； 徐成海，张世伟，关奎之，等. 几种物料的冷冻干燥实验 [J].真空与低温, 1998, 4(3): 161-164；沈善明. 热敏性药品的干燥 [J].医药工程设计, 2010, 31(6): 1-4），得白色固体。
4、将第3步得到的白色固体与表没食子儿茶素（EGC）标准品（购自美国Sigma-Aldrich公司，C15H14O7，M.W. 306.27，编号：E3768，纯度≥95%（HPLC））对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测（具体鉴定、检测方法可参考：丁平平，李延芳，宋航，等. 儿茶素单体的分析方法比较 [J].四川化工, 2005, 8 (4): 38-41； 吴迪，杨丽珠，仇佩虹，等. 茶中儿茶素的分离分析方法研究进展 [J].分析科学学报, 2008, 24(4): 468-472；刘婷，杨红梅，郭启雷，等. 高效液相色谱法测定茶饮料中儿茶素 [J].分析实验室, 2009, 28: 277-280；谷勋刚，蔡继宝，张正竹，等. HPLC-DAD分析红茶儿茶素类物质和咖啡因的方法研究 [J].安徽农业大学学报, 2010, 37 (1): 5-10）。
鉴定、检测结果为：所述白色固体，分子量为306，（-）ESI-MS m/z：305 [M－H]-，熔点208～210oC. 比旋光度-50 o (C=0.04, EtOH)，分子式为：C15H14O7，表明所述白色固体为EGC单体，而且纯度 ≥98%。
Claims (7)
1.一种从绿茶提取物中分离纯化表没食子儿茶素单体的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）加入纯水溶解绿茶提取物茶多酚，配置成浓度为5% w/v的溶液，加入柠檬酸调节pH值 4.0～5.0，保持温度35～40℃，茶汤料液备用；
（2）按照茶汤料液0.02% w/v的重量加入单宁酶，静置酶解，间歇搅拌；离心过滤，取澄清液喷雾干燥，得到喷雾干粉；
（3）加入水溶解上述喷雾干粉配置成浓度为3% w/v 的上柱料液，吸附树脂柱分离纯化，解吸溶剂为乙醇，高效外循环浓缩回收乙醇至酒精度<5，再用反渗透膜浓缩解吸馏分，将浓缩的解吸馏分离心、喷雾干燥，得到干燥产品；
（4）将上述干燥产品用3～4倍量w/v的95%乙醇溶解，放置，结晶，将晶体冷冻干燥，得白色固体，即为表没食子儿茶素单体。
2.按照权利要求 1 所述的方法，其特征在于：第（2）步中所述单宁酶的酶活力为200—500 U/mg。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述单宁酶为诺维信公司的 NS-33049，酶活力 228 U/mg；Fluka公司的Tannase，酶活力314U/ mg；或Kikkoman公司的Tannase，酶活力 500U/ mg产品之一。
4.按照权利要求 1 所述的方法，其特征在于：第（2）步中，加入单宁酶，静置酶解4小时，间歇30分钟搅拌5分钟；1000 r/min离心过滤，内衬200目绢布袋，取澄清液用离心喷雾塔喷雾干燥，控制进风温度160℃～180℃，排风温度70℃～80℃ 。
5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第（3）步所述的吸附树脂柱分离纯化，其中，树脂用量：40倍EGC粗品重量；上柱流速：1.0 BV/h；解吸溶剂：2倍体积的60%乙醇；解吸流速：1.0BV/h，反渗透膜浓缩时操作温度控制在40℃以下，进膜压力控制在15 Bar以下。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述吸附树脂为HP20、NKA-9、聚酰胺或HPD100其中之一。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第（4）步中，放置温度为4℃，结晶，滤纸常压过滤后将晶体冷冻干燥，产品首先降温至-40℃预冻结，然后开始抽真空，真空度至30Pa时开始加热升华干燥，控制产品温度不超过20℃，干燥时长12～16h。
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