CN104846029B - 一种简单茶黄素单体的制备方法 - Google Patents

一种简单茶黄素单体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种简单茶黄素单体的制备方法，所述方法包括如下步骤：1)向含有茶黄素提取物的溶液中添加鞣酸酶和果胶酶的混合物，在25℃‑30℃下搅拌20‑60min，得酶解液；2)将酶解液迅速升温到85‑90℃，保持5‑10min，待酶解液降至室温后，离心，取上清液；将上清液通入装有吸附树脂的层析柱，并用乙醇洗脱剂进行分级洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；将浓缩液在0～4℃温度下放置48～72h，添加少量茶黄素单体结晶，离心、干燥得到简单茶黄素(TF)单体。本发明所述方法使用复合酶对茶黄素进行酶解，具较好的转化效果，是一种转化率高，产品纯度高的制备方法。

Description

一种简单茶黄素单体的制备方法
技术领域
本发明属于茶黄素的制备领域，具体涉及一种简单茶素单体的制备方法。
背景技术
茶黄素(Theaflavins,TFs)是红茶加工过程中儿茶素类酶促氧化缩合形成的、与红茶品质高度相关的一类色素，红茶中茶黄素的质量分数达0.5％-2％。TFs是一类能溶于乙酸乙酯、具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称。茶黄素(TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G)、茶黄素-3′-没食子酯(TF-3′-G)和茶黄素双没食子酸酯(TFDG)是4种主要的茶黄素。其中TF由于化学结构中不含没食子酰基，被称为简单茶黄素，后三种茶黄素的化学结构中含有一个或两个没食子酰基，被称为酯型茶黄素。现已证实，茶黄素具有较好的抗氧化、抗菌和抗肿瘤作用。不同的茶黄素组分其功能活性不同，但酯型茶黄素由于其结构特点，在水中的溶解度比简单茶黄素(TF)低。红茶饮料，尤其是以茶黄素为主要原料的功能饮料，过高比例的酯型茶黄素会导致产品贮存期间产生沉淀严重、生理活性降低。
发明内容
针对酯型茶黄素溶解度低，添加在红茶饮料中易出现沉淀、生理活性下降的缺陷，本发明提出一种简单茶黄素(TF)的制备方法，其具体步骤如下：
1)向含有茶黄素提取物的溶液中添加鞣酸酶和果胶酶的混合物，在25℃-30℃下搅拌30-50min进行酶解，得酶解液；
2)将所述酶解液迅速升温到85-90℃，保持5-10min，待酶解液降至室温后，离心，取上清液，并过滤；
3)将步骤2)中过滤后的上清液通过装有吸附树脂的层析柱，并用乙醇洗脱剂进行分级洗脱，收集洗脱液，将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；
4)将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72h，添加少量茶黄素单体对浓缩液进行结晶，离心、干燥得到简单茶黄素(TF)单体。
本发明中，所述含茶黄素提取物的溶液中茶黄素的浓度为6～8mg/mL，在这种较低的浓度下，茶黄素可充分溶解，有利于酯型茶黄素的的进一步水解。
本发明中，选择鞣酸酶和果胶酶的混合物，同选择单一的酶相比，两种酶复合使用可协同提高酯型茶黄素的水解效率。
本发明中，所述鞣酸酶和果胶酶混合物与茶黄素的质量比为3:200～1:40；，选择这种比例范围，在保证实现良好的催化效果的前提下，可减少酶的浪费。
本发明中，所述鞣酸酶和果胶酶的混合物中，鞣酸酶和果胶酶的质量比为4～6:1。这种比例是果胶酶和鞣酸酶协同作用的最佳比例，既可协同提高酯型茶黄素的水解效率，还可减少鞣酸酶和果胶酶的用量。
本发明中，所述离心条件为：在8000-10000r/min转速下离心10-20min。
本发明中，所述吸附树脂优选DM130、D140，这两种树脂可以有效吸附简单茶黄素(TF)，对酯型茶黄素的水解产物没食子酸和其它杂质吸附率低，可以有效分离简单茶黄素(TF)。
本发明中，所述乙醇洗脱剂为10-60％的乙醇溶液。
本发明进一步对提取方法进行了优化，具体包括如下步骤：
1)在浓度为8mg/mL的茶黄素溶液中添加与茶黄素质量比为3：200的鞣酸酶果胶酶的混合物，其中鞣酸酶和果胶酶的质量比为5：1，在30℃下搅拌40-50分钟进行酶解，得酶解液。
2)将所述酶解液迅速升温到85-90°，保持5-10分钟，待酶解液降温至室温后在9000-10000r/min离心15-20min，取上清液，并过滤。
3)将步骤2中过滤后的上清液缓慢通过装有D140吸附树脂的层析柱，并分别用20％、40％、60％的乙醇水溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，洗脱液浓缩至16-18波美度，得浓缩液。
4)将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72小时，添加少量茶黄素单体对浓缩液进行结晶，然后离心、干燥得到简单茶黄素(TF)单体。
本发明所述的制备简单茶黄素(TF)的方法，采用由鞣酸酶和果胶酶组成的复合酶直接对酯型茶黄素进行酶解，使得酯型茶黄素水解为简单茶黄素(TF)，成功解决了简单茶黄素(TF)与酯型茶黄素难以分离的技术难题。同时，采用优选的吸附树脂DM130和D140可以有效吸附简单茶黄素(TF)，对酯型茶黄素的水解产物没食子酸和其它杂质吸附率低，解决了简单茶黄素(TF)与其它杂质的分离，从而成功实现了简单茶黄素(TF)单体的制备。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中所述茶黄素提取物购自长沙飞拓植物制品有限公司、鞣酸酶和果胶酶均购自诺维信酶制剂公司。
实施例1
1、取40％茶黄素提取物10克，配成500ml茶黄素溶液，向所述溶液中添加80mg鞣酸酶和20mg果胶酶，在25℃下搅拌30分钟进行酶解，得到酶解液。
2、将所述酶解液迅速升温到90℃，保持5分钟，待酶解液降温至室温后在8000r/min离心10min，取上清液，并过滤。
3、将步骤2中过滤后的上清液缓慢通过装有DM130吸附树脂的层析柱，并分别用10％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，收集50％的乙醇洗脱液，并将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液。
4、将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48小时，添加少量茶黄素单体对浓缩液进行结晶，然后离心、干燥得到简单茶黄素2.13g。经过HPLC方法检测，其中简单茶黄素(TF)单体的含量为96.36％。经UV、FTIR、HPLC-MS、1H-NMR和13C-NMR鉴定分析，其结构式为：
实施例2
1、取60％茶黄素提取物10克，配成1000ml茶黄素溶液，向所述溶液中添加90mg鞣酸酶和15mg果胶酶，在28℃下搅拌40分钟进行酶解，得酶解液。
2、将所述酶解液迅速升温到85°，保持10分钟，待酶解液降温至室温后在8000r/min离心15min，取上清液，并过滤。
3、将步骤2中过滤后的上清液通过装有D140吸附树脂的层析柱，并分别用20％、40％、60％的乙醇水溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，将洗脱液浓缩至16-18波美度，得浓缩液。
4、将所述浓缩液在0～4℃温度下放置60小时，添加少量茶黄素单体对浓缩液进行结晶，然后离心、干燥得到简单茶黄素3.25g。经过HPLC方法检测，简单茶黄素(TF)单体的含量为97.21％。
实施例3
1、取80％茶黄素提取物10克，配成1000ml茶黄素溶液，在所述溶液中添加100mg鞣酸酶和20mg果胶酶，在30℃下搅拌50分钟进行酶解，得酶解液。
2、将所述酶解液迅速升温到90°，保持5分钟，待酶解液降温至室温后在10000r/min离心20min，取上清液，并过滤。
3、将步骤2中过滤后的上清液缓慢通过装有D140吸附树脂的层析柱，并分别用20％、40％、60％的乙醇水溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，洗脱液浓缩至16-18波美度，得浓缩液。
4、将所述浓缩液在0～4℃温度下放置72小时，添加少量茶黄素单体对浓缩液进行结晶，然后离心、干燥得到简单茶黄素4.39g。经过HPLC方法检测，得简单茶黄素(TF)单体含量为97.80％。
对比例1
同实施例1相比，其区别在于，将步骤1中酶的添加变为仅添加100mg鞣酸酶，干燥得简单茶黄素1.80g，经过HPLC方法检测，其中简单茶黄素(TF)单体的含量为85.79％。
对比例2
同实施例1相比，其区别在于，将步骤1中酶的添加变为仅添加100mg果胶酶，干燥得简单茶黄素1.71g，经过HPLC方法检测，其中简单茶黄素(TF)单体的含量为80.91％。
对比例3
同实施例1相比，其区别在于，将步骤1中鞣酸酶的添加量为60mg，果胶酶的添加量为60mg，干燥得简单茶黄素单体1.92g，经过HPLC方法检测，其中简单茶黄素(TF)单体的含量为89.10％。
由以上可以看出，本发明中，通过合理选择复配酶的种类和比例，成功的实现了催化酯型茶黄素转化为简单茶黄素(TF)，通过优选大孔树脂的类型，对简单茶黄素(TF)实现了良好的分离，最后得到了高纯度的简单茶黄素单体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种简单茶黄素单体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向含有茶黄素提取物的溶液中添加鞣酸酶和果胶酶，鞣酸酶和果胶酶的质量比为4～6:1，鞣酸酶和果胶酶的混合物与所述茶黄素提取物的质量比为3:200～1:40，在25℃-30℃下搅拌30-50min进行酶解，得酶解液；
2)将所述酶解液迅速升温到85-90℃，保持5-10min，待酶解液降至室温后，离心，取上清液并过滤；
3)将步骤2)中过滤后的上清液通入装有DM130或D140吸附树脂的层析柱，并用乙醇洗脱剂对所述层析柱进行分级洗脱，收集洗脱液，将所述洗脱液浓缩至16～18波美度，得浓缩液；
4)将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72h，添加茶黄素单体对浓缩液进行结晶，离心、干燥得到简单茶黄素单体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含茶黄素提取物的溶液中茶黄素的浓度为6～8mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述离心条件为：在8000-10000r/min转速下离心10-20min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇洗脱剂为10-60％的乙醇溶液。
5.权利要求1、2或4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在浓度为8mg/mL的茶黄素溶液中添加与茶黄素质量比为3：200的鞣酸酶果胶酶的混合物，其中鞣酸酶和果胶酶的质量比为5：1，在30℃下搅拌40-50分钟进行酶解，得酶解液；
2)将所述酶解液迅速升温到85-90℃，保持5-10分钟，待酶解液降温至室温后在9000-10000r/min转速下离心15-20min，取上清液，并过滤；
3)将步骤2)中过滤后的上清液缓慢通入装有D140吸附树脂的层析柱，并分别用20％、40％、60％的乙醇水溶液对所述层析柱进行洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，洗脱液浓缩至16-18波美度，得浓缩液；
4)将所述浓缩液在0～4℃温度下放置48～72小时，添加茶黄素单体对浓缩液进行结晶，然后离心、干燥得到简单茶黄素单体。
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