CN101168552B

CN101168552B - 秦艽环烯醚萜苷提取方法

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Publication number: CN101168552B
Application number: CN2006101377015A
Authority: CN
Inventors: 郭颂
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Quanfang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: CN101168552A

Abstract

本发明公开了一种秦艽环烯醚萜苷提取方法，该方法是将秦艽水提取，经乙醇醇沉，滤过，滤液浓缩，浓缩液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得秦艽环烯醚萜苷的方法。本发明涉及的秦艽环烯醚萜苷提取方法是一种操作简便、快捷的方法。所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。用本发明方法提取秦艽环烯醚萜苷含量可达55％以上，且重现性好，树脂可重复使用。

Description

秦艽环烯醚萜苷提取方法

技术领域

本发明为中药提取的方法，主要涉及中药有效组分提取的方法，尤其涉及秦艽环烯醚萜苷的提取方法。

背景技术

秦艽：本品为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽straminea Maxin.、粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk或小秦艽Gentiana dahurica Fisch的干燥根。前三种按性状不同分别习称“秦艽”和“麻花艽”，后一种习称“小秦艽”。春、秋二季采挖。除去泥沙；秦艽及麻化艽晒软。堆置“发汗”至表面呈红黄色或灰黄色时，摊开晒干，或下经“发汗”直接晒干；小秦艽趁鲜时搓去黑皮，晒干。主要分布于西南、西北、华北、内蒙。麻花艽分布于青海、甘肃、西藏、四川及宁夏，湖北西部亦有分布。

秦艽性味苦、辛，微寒，归胃、肝、胆经，祛风湿，舒筋络，善退黄疸，兼能通便。《本草纲目》称其为手足阳明经药，兼入肝胆，可治“手足不遂、黄疸、烦渴之病”，“取其去阳明之湿热”。《药性论》称秦艽“利大小便”。研究表明，秦艽中的龙胆苦苷能抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀、醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增加，对抗酵母多糖A、角叉菜胶所致的大鼠足跖肿胀，并有一定的剂量依赖关系。秦艽的免疫药理作用结果表明，秦艽能明显降低小鼠的胸腺指数，并能明显抑制SRBC所致的小鼠DTH。

目前，临床上已广泛用于病毒性疾病、神经性疾病、呼吸道疾病、心脑血管疾病及其他疾病的治疗，并取得满意疗效。

秦艽中主要含环烯醚萜苷类化合物。此外还有糖类、挥发油等

现有的秦艽环烯醚萜苷提取方法，一般采用水提取，浓缩，干躁，即得，这种方法提取的环烯醚萜苷含量低，用本发明可以克服此缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，是以水加热回流提取秦艽，经乙醇醇沉，滤过，滤液浓缩后，吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的秦艽环烯醚萜苷。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，将秦艽以以水加热回流提取1～4次，最优选为：3次。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，每次提取秦艽质量与水的体积比为1～14倍，优选提取体积为：4～12倍，最优选提取体积为：8倍。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，每次提取的时间为0.5～2h，最优选时间为：1.5h。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，将秦艽提取液浓缩后以80％乙醇醇沉。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP825、SP700、SP70，最优选SP70。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，秦艽提取液的上样量(秦艽质量∶树脂体积)为0.5∶1～8∶1，优选1∶1～4∶1，最优选1.5∶1。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，洗脱流速为洗脱液流速为1BV/h～5BV/h，最优选为2BV/h。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，洗脱剂乙醇溶液的洗脱浓度为：5％至95％，最佳的洗脱浓度为5％至40％。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，大孔树脂洗脱剂的洗脱体积为1～10倍柱体积，最佳洗脱体积为5倍柱体积。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，获得纯化的秦艽环烯醚萜苷含量大于55％。

本发明具有以下优点：

1、本发明涉及的秦艽环烯醚萜苷树脂纯化的方法是一种操作简便、快捷的方法。

2、所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。

3、本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。

4、用本发明方法纯化秦艽提取物，环烯醚萜苷含量可达55％以上，且重现性好，树脂可重复使用。

附图说明：

图1.秦艽静态吸附与解吸率曲线

图2.秦艽动态吸附泄漏曲线

图3.秦艽动态解吸曲线

图4秦艽比上柱量曲线

图5.秦艽洗脱终点曲线

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

说明：秦艽环烯醚萜苷含量测定方法

①仪器与试药

仪器：北京普析通用仪器有限公司TU-1901型紫外可见分光光度仪，联想数字处理中心。日本岛津LIBROR AEL-200万分之一电子分析天平，上海亚荣2000A型旋转蒸发仪，日本三菱公司SP70、SP700、SP825、SP850、HP20型大孔树脂。

试药：龙胆苦苷对照品(供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号110770-200409)，使用前置五氧化二磷减压干燥器中干燥24小时，使之恒重。水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

②检测波长：274nm，空白对照：甲醇。

③对照品溶液的制备精密称取龙胆苦苷对照品10.2mg，置25ml量瓶中，以水溶解并稀释至刻度，摇匀。即得对龙胆苦苷照品溶液。

④工作曲线制作：精确量取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。于274nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，龙胆苦苷对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为：Y＝18.939X+0.0155，R²＝0.9999。

龙胆苦苷浓度在4.08～81.60μg/ml范围内呈线性关系。

⑤供试品溶液的制备

取秦艽提取物适量，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密移取1.0ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

⑥含量测定

取样品溶液置274nm处测定吸光度，记录吸光度值，代入工作曲线计算环烯醚萜苷含量。

实施例1本发明的一种纯化方法

(1)秦艽水提醇沉：秦艽以8倍体积水加热回流提取三次，每次1.5h，合并三次滤液，减压浓缩至比重为1.11-1.15(50-60℃)，加95％乙醇使醇浓度至80％，静置过夜。醇沉液减压浓缩至无醇味后加水稀释使溶液体积达到生药重量的2倍，过滤，备用。

(2)上柱：将秦艽提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量为药材重量∶树脂体积为1.5∶1，至提取液全部进入树脂床。

(3)洗脱：以5BV体积的5％乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速为2BV/h，以除去杂质。然后以5BV体积的40％乙醇，控制流速为2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物。

实施例2选用不同条件进行水提醇沉

采用本发明提供的方法，选用不同条件进行秦艽环烯醚萜苷提取实验。

表1 秦艽水提工艺因素水平表

表2 秦艽水提工艺三因素三水平方差分析

注：以D因素为误差项

①选定加水量(A)，煎煮时间(B)，提取次数(C)为影响因素，每个因素三个水平，设计三因素三水平的正交试验，见表1。称取秦艽药材10g，共9份，每份提取后滤液合并，减压浓缩至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，移取1.0ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定有效组分的含量，结果见表2。方差分析结果见表3。

表3 秦艽水提工艺正交试验方差分析表

*：F_0.10(2，2)＝9.00 **：F_0.05(2，2)＝19.00 ***：F_0.01(2，2)＝99.00

结果：方差分析结果表明以提取有效组分量为指标，3个因素均有极显著性差异。加水最对提取物总量影响最小，从时效因素考虑，选定其工艺为：A₁B₃C₃，即加8倍量水回流3次，每次90分钟。

结论：选择加8倍量水回流3次，每次90分钟。

②验证秦艽优选水提工艺

称取秦艽药材20g，加8倍水煎煮3次，每次90分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，重复3次。另取秦艽药材20g，加入12倍水煎煮3次，每次90分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀重复3次。按上述方法测定有效组分的含量，结果见表4。

表4 验证秦艽水提工艺结果

结果：从表4可以看出，A₃B₃C₃比A₁B₃C₃只高约5.0％，从热能消耗、生产时效等方面考虑，选择A₁B₃C₃，且具有良好的重现性。

结论：优选水提工艺具有良好的重现性。

③秦艽醇沉正交试验

为了进一步提高有效成分的含量和纯度，需将秦艽水提浸膏醇沉。选定浓缩液比重(A)，乙醇浓度(B)为影响因素，设计二因素三水平正交试验，见表5。取400g秦艽药材，按上述方法提取，将提取液合并，平均分成10份(每份40g生药)，取其中3份减压浓缩到比重为1.21-1.25(50-60℃)，其中3份浓缩至比重为1.16-1.20(50-60℃)，其中3份减压浓缩至比重为1.11-1.15(50-60℃)。相同比重浓缩液分别加95％乙醇使醇浓度至60％、70％、80％，静置过夜，滤过，滤液分别减压浓缩至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，稀释至刻度并摇匀，再移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其中有效组分含量。结果见表6、7。

表5 秦艽醇沉正交试验因素水平表

表6 秦艽醇沉实验含量测定表

表7 秦艽醇沉正交试验方差分析表

*：F_0.10(2，2)＝9.00 **：F_0.05(2，2)＝19.00 ***：F_0.01(2，2)＝99.00

结果：由表可知，醇沉最佳工艺为：A₁B₃，即浓缩至比重为1.11-1.15(50-60℃)，醇沉浓度为80％。

结论：选择浓缩至比重为1.11-1.15(50-60℃)，醇沉浓度为80％。

④验证优选醇沉工艺

称取秦艽药材40g，加入8倍水煎煮3次，每次90分钟，滤过，滤液合并，减压浓缩至比重为1.114(55℃)，加入95％乙醇使醇浓度至80％，搅匀，静置过夜，滤过，减压浓缩至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其中有效组分含量。结果见表8。

表8 秦艽验证优选醇沉工艺结果

结果：从表8可以看出，优选醇提工艺具有良好的重现性。

结论：优选醇提工艺具有良好的重现性。

实施例3确定大孔树脂提取最佳工艺

选取树脂种类、药液浓度、吸附速率、上样量、乙醇洗脱浓度、洗脱速率、洗脱终点6因素分别进行单因素试验，确定各因素的最佳值。

①上柱液制备称取秦艽药材500g，按上述优选提取工艺提取，8倍量水煮三次每次1.5小时，合并滤液，减压浓缩至约150ml，比重为1.241(55℃)，加95％乙醇使醇浓度至80％，搅匀，静置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，以水稀释至500ml，滤过，上清液备用，测得有效组分含量为37.7mg·ml^-1。

②静态吸附取5种处理好的大孔树脂各10g，分别加入秦艽水溶液30ml(有效组分浓度为7.54mg·ml^-1)，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液0.5ml于10ml量瓶中，于274nm处测定吸光度，计算各树脂对秦艽有效组分的吸附率。见表11、图1。

③静态解析将静态吸附的树脂过滤抽干，加30ml 40％乙醇解吸，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液0.1ml于10ml量瓶中，按上述方法测定有效组分浓度，计算各树脂对秦艽有效组分的解吸率。见表9、图1。

表9 5种大孔树脂对秦艽有效组分的吸附与解吸附率

表10 3种大孔树脂对秦艽有效组分动态吸附结果

结果：从表9可以看出，5种树脂的吸附率都较大(大于90％)，HP20 和SP850的解吸率都较小。因此选取SP70、SP700、SP825三种树脂做以下实验。

结论：取SP70、SP700、SP825三种树脂做动态吸附试验。

④动态吸附取静态吸附优选处理好的3种树脂各15ml于柱内(1cm×13cm)，加秦艽水溶液(有效组分浓度为7.54mg·ml^-1)于柱顶，以0.5BV/h的流速进行动态吸附，按树脂床体积收集流出液，于274nm处测定吸光度，计算有效组分的含量，绘制各树脂的泄漏曲线，结果见表10、图2。

结果：从图2可以看出，达到吸附饱和时，SP70和SP825所吸附的有效组分的量最大。

结论：选取SP70和SP825做动态解吸试验。

⑤动态解吸取处理好的SP70和SP825树脂各20ml于柱内(1cm×13cm)将浓度为7.54mg·ml^-1的秦艽水溶液30ml，以0.5BV/h的流速进行吸附后，用40％乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液，测定有效组分的含量，结果见表11，图3。

表11 秦艽动态解吸结果

结果：从图3可以看出，SP70较SP825的解吸效果好，因此选择SP70作为最佳树脂。

结论：选择SP70树脂。

⑥药液浓度考查取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg·ml^-1)10ml，分别稀释至相当于生药浓度为1g·ml^-1、0.5g·ml^-1、0.33g·ml^-1、0.2g·ml^-1、0.1g·ml^-1，加入20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以40％乙醇洗脱，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表12。

表12 秦艽药液浓度考察结果

结果：从表12可以看出，当药液稀释至5倍(相当于原生药浓度0.2g·ml^-1)时，解析率最高，稀释至2倍与稀释至3倍相当，且比不稀释要高约2％，综合考虑生产时效因素，选择稀释至2倍，即溶液体积∶生药重＝2ml∶1g。

结论：上柱液浓度为溶液体积达到生药重两倍。

⑦吸附速率考查取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg·ml^-1)10ml，加入20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，分别以0.5BV/h、1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、的流速进行吸附后，用5BV 40％醇以2BV/h的流速进行洗脱，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表13。

表13 秦艽吸附速率考察结果

结果：从表13可看出，当吸附速率为0.5BV·h^-1时，吸附效果最好。

结论：吸附速率为0.5BV·h^-1。

⑧上样量考察取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg·ml^-1)加于20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，按树脂床体积收集流出液，于274nm处测定吸光度，计算有效组分的含量，绘制比上柱量曲线。结果见表14、图4。

表14 秦艽上样量考察结果

结果：从图4可以看出，上样量为3倍树脂床体积(BV)时开始泄漏，7倍倍树脂床体积(BV)时达到吸附饱和，因此实际工艺中选择1.5倍树脂床体积(BV)上样量，即生药重(g)∶树脂体积(ml)＝1.5∶1。

结论：上样量为生药重(g)∶树脂体积(ml)＝1.5∶1。

⑨洗脱用乙醇浓度考察取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg·ml^-1)50ml，加于100ml(2.5cm×23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，分别用5BV水、5％、10％、20％、30％、40％、60％、80％乙醇以2BV/h流速进行洗脱，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表15。

表15 秦艽乙醇洗脱浓度考察结果

结果：从表15可以看出，当乙醇浓度为20％-40％时，有效组分的含量最高，因此选择先以20％乙醇洗脱，再以40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液。

结论：选择先以20％乙醇洗脱，再以40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液。

⑩洗脱速率考察取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg·ml^-1)10ml，加于20ml(1cm×13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以40％乙醇洗脱，流速分别为1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h、测定洗脱液有效组分的总量。结果见表16。

表16 秦艽洗脱脱速率考察结果

结果：从表16可以看出，流速为1BV/h洗脱时解吸率最高，但与2BV/h洗脱相差不大，为提高效率，用2BV/h流速洗脱较优。

结论：洗脱速率为2BV/h。洗脱终点考察将吸附饱和的树脂40％乙醇以2BV/h流速进行洗脱，

按树脂床体积收集洗脱液(20ml)，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表17、图5。

表17 秦艽洗脱终点测定结果

结果：从图5可以看出，当洗脱液用5倍树脂床体积时，已基本将有效组分洗净。

结论：以5倍树脂床体积的乙醇洗脱。

验证优选秦艽大孔树脂提取工艺

取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg·ml^-1)150ml，加去离子水稀释至300ml(有效组分浓度为18.85mg·ml^-1)，加于100ml(2.5cm×23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml 5％乙醇2BV速率洗脱，再以500ml 40％乙醇2BV速率洗脱，收集40％乙醇洗脱液至500ml，减压浓缩至干，75℃真空干燥，测定有效组分的含量，计算得率，重复3次。结果见表18。

表18 秦艽总有效组分得率及含量测定结果

结果：从表18可以看出，经SP70大孔树脂处理处理过的秦艽水溶液，环烯醚萜苷含量可超过55％，达到80％左右，得率约1.6％，且具有良好的重现性。

实施例4 SP70大孔树脂反复使用稳定性考察

称取秦艽药材1kg，按上述优选水煮及醇沉工艺提取，提取液定容至1000ml。取秦艽水溶液150ml，加水稀释至300ml，加于100ml(2.5cm×23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml 20％乙醇2BV速率洗脱，再以500ml 40％乙醇2BV速率洗脱，收集40％乙醇洗脱液至 500ml，再以500ml 75％乙醇洗柱，40％乙醇洗脱液减压浓缩至干，75℃真空干燥至恒重，测定有效组分的含量，计算得率，在同一树脂柱上按上述步骤重复5次。结果见表19。

表19 SP70大孔树脂反复使用5个周期稳定性考察

结果：从表19可以看出上述树脂工艺在5个周期内产品得率及有效组分含量较稳定，SP70树脂可以反复使用。

结论：使用SP70树脂产品得率及有效组分含量在5个周期内较稳定。

本发明涉及的参考文献：

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Claims

1.秦艽环烯醚萜苷提取方法，具体方法是：将秦艽水提取，经乙醇醇沉，滤过，滤液，浓缩液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得秦艽环烯醚萜苷。

2.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：将秦艽以水加热回流提取1～4次，最优选为：3次。

3.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：每次提取秦艽质量与水的体积比为1～14倍，优选提取体积为：6～12倍，最优选提取体积为：8倍。

4.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：每次提取的时间为0.5～2小时(h)，最优选时间为：1.5h。

5.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：乙醇醇沉的浓度为20％～90％，优选：60％～90％，最优选为：80％。

6.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP825、SP700、SP70，最优选SP70。

7.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：秦艽提取液大孔树脂的上样量(秦艽质量∶树脂体积)为0.5∶1～8∶1，优选1∶1～4∶1，最优选1.5∶1。

8.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：大孔树脂洗脱剂为有机醇，优选项为乙醇。

9.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：大孔树脂洗脱液流速为1倍柱体积/小时(BV/h)～5BV/h，最优选为2BV/h。

10.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：大孔树脂洗脱剂乙醇溶液的洗脱浓度为：5％至95％，最佳的洗脱浓度为5％至40％。

11.如权利要求1述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：大孔树脂洗脱剂的洗脱体积为1～10倍柱体积，最佳的洗脱体积为5倍柱体积。

12.如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是：获得纯化的秦艽环烯醚萜苷含量大于55％。