CN103623039A

CN103623039A - 黄芪总皂苷提取物、其制备方法和质量标准控制方法

Info

Publication number: CN103623039A
Application number: CN201210296882.1A
Authority: CN
Inventors: 杨义芳; 胡晓; 杨悦文; 屈晓晟
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2012-08-20
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了一种黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照中国药典2010版附录IX水分测定法，所述提取物的含水量不超过5％。本发明也公开了制备所述黄芪总皂苷提取物的方法，包括如下步骤：(1)黄芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到浓缩液；(2)浓缩液上大孔树脂柱，得到粗皂苷；(3)用中极性有机试剂反复洗涤粗皂苷，得到精制总皂苷；(4)将精制总皂苷碱化，再用稀酸中和至中性，水洗除去盐，得到黄芪总皂苷提取物。所述提取物主要从水分、灰分、重金属检查，总皂苷含量、黄芪甲苷含量以及所述提取物指纹图谱等方面进行质量标准控制。

Description

黄芪总皂苷提取物、其制备方法和质量标准控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药材黄芪的总皂苷提取物、其制备方法以及所述提取物的质量标准控制方法。

背景技术

黄芪(Radix Astragali)是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或者膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.的干燥根，为常用的补益药，味甘，性温。传统医学认为其具有补气固表，利尿脱毒，排脓，敛疮生肌，用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛等，药用历史非常悠久。现代研究表明，黄芪具有提高免疫功能，增强抗氧化、抗辐射和抗癌，保护心脑血管、肝脏、肾脏和肺脏，抗菌及抑制病毒等作用。黄芪皂苷作为黄芪的主要活性成分，临床和实验表明，黄芪皂苷具有免疫调节，抗肿瘤、抗病毒、降糖和改善心血管疾病等广泛活性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种黄芪总皂苷提取物，参照中国药典2010版附录IX水分测定法，所述黄芪总皂苷提取物的含水量不超过5％。

根据本发明的一个优选的实施方式，参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查法，所述黄芪总皂苷提取物的炽灼残渣不超过1％。

根据本发明的一个优选的实施方式，参照《中国药典》2010版附录IXE重金属检查法，所述黄芪总皂苷提取物的重金属含量不超过10ppm。

根据本发明的一个优选的实施方式，用比色法测定所述提取物黄芪总皂苷的含量，所述黄芪总皂苷提取物的黄芪总皂苷含量不低于90％。

根据本发明的一个优选的实施方式，用HPLC-DAD法测定所述提取物中黄芪甲苷的含量，所述提取物的黄芪甲苷含量不得低于50％。

根据本发明的一个优选的实施方式，根据所述指纹图谱检测法，所述黄芪总皂苷提取物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.90。

本发明的第二个目的是提供制备所述黄芪总皂苷提取物的方法，包括如下步骤：

(1)将黄芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到浓缩液；

(2)浓缩液上大孔树脂柱，得到粗皂苷；

(3)用中极性有机试剂反复洗涤粗皂苷，得到精制总皂苷；

(4)将精制总皂苷碱化，再用稀酸中和至中性，水洗除去盐，得到黄芪总皂苷提取物。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(1)中所述黄芪粉末过60目筛。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(1)中所述浸泡提取包括用60-90％乙醇在55℃下浸泡黄芪粉末的步骤。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(1)中所述回流提取包括用60-90％乙醇回流提取黄芪粉末至少两次，其中第一次使用6～8倍黄芪粉末重量的60-90％乙醇回流提取至少1小时，第二次使用3～5倍黄芪粉末重量的60-90％乙醇回流至少30分钟。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(2)中，先用去离子水洗脱，从而除去糖类和酚酸类；再用浓度20％～40％乙醇洗脱3～5个柱体积从而除杂，最后用浓度70％～90％洗脱3～5个柱体积，收集，浓缩蒸干得到粗皂苷。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(2)中所述大孔树脂柱选自非极性或弱极性大孔树脂柱。所述非极性大孔树脂柱可以选自AB-8、D101或D104，所述弱极性大孔树脂柱可以选自HP20或HPD300。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述大孔树脂的用量不低于20倍黄芪粉末重量。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(3)中，用体积为1～3倍粗皂苷重量的中极性有机试剂反复洗涤，洗涤次数＞2次，优选2～3次。所述中极性有机试剂选自丙酮、乙醚或乙酸乙酯，优选丙酮。每次洗涤试剂的体积为粗皂苷重量的3～6倍。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(4)中，用体积为3～5倍总皂苷重量的碱溶液，加热磁搅拌水解总皂苷。其中所述加热温度为40～60℃，磁搅拌转速为1000～2000rpm，时间为4～6h。所述碱溶液选自0.5％～1％的NaOH，Ca(OH)₂或KOH溶液。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(4)中所述稀酸为稀盐酸或醋酸或稀磷酸，稀酸浓度约为0.1～0.5mol/L。

根据一个特别优选的实施方式，本发明制备黄芪总皂苷提取物的方法具体包括如下步骤：将黄芪根粉碎，打粉，过60目筛，用乙醇回流提取多次；合并醇提液，浓缩至无醇味，加水混悬加入大孔吸附树脂柱，去离子水洗脱3～5个柱体积，除去糖、酚酸等杂质；再用20％～40％乙醇洗脱3～6个柱体积，优选40％乙醇，洗脱4个柱体积；再用70％～90％乙醇洗脱3～6个柱体积，优选70％的乙醇，洗脱5个柱体积，浓缩得到粗皂苷，粗皂苷用中极性有机试剂多次洗涤除杂，洗涤液弃去，得到白色的黄芪总皂苷。黄芪总皂苷中加入适量碱溶液，水解3～6小时，加稀酸中和至中性，水洗去盐，得到黄芪总皂苷提取物。通过中极性有机试剂的洗涤除杂，本发明方法得到的黄芪总皂苷提取物色泽更白、更美观，黄芪总皂苷的含量更高。

本发明的第三个目的是提供黄芪总皂苷提取物的质量标准控制方法。

黄芪总皂苷提取物的质量标准控制方法包括水分、炽灼残渣、重金属检查，黄芪总皂苷的含量测定，黄芪甲苷的含量测定和所述提取物指纹图谱检测。

(1)上述水分检查办法参照中国药典2010版附录IX水分测定法，具体方法如下：取黄芪总皂苷提取物2g，转移至干燥至恒重的称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在105℃下干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，再精密称定，在上述温度下干燥1h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算含水量。经测定三批提取物样品含水量均不超过5％。

(2)上述炽灼残渣检查方法参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查，具体方法如下：取黄芪总皂苷提取物1g，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓慢炽灼至炭化，放冷至室温；加硫酸0.5～1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽，在500～600℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重，放冷，称重。经测定，3批提取物炽灼残渣均不超过1.0％。

(3)上述重金属含量检查方法参照《中国药典》2010版附录IX E重金属检查法，具体方法如下：规定所述提取物重金属含量不得超过10ppm。取炽灼残渣项所得残渣，加硝酸0.5mL，蒸干后放冷，加盐酸2mL，置水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸盐缓冲液(PH 3.5)2mL，微热溶解后，置纳氏比色管中，加水稀释成25mL作为甲管。另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液(PH3.5)2mL与水15mL，作为乙管，再在两管中分别加入硫代乙酰胺试液各2mL，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自下向上透视，乙管中显出的颜色与甲管比，不得更深。经测定，3批提取物的重金属含量均小于10PPm。

(4)上述的提取物中黄芪总皂苷含量测定方法，用比色法测定黄芪总皂苷含量，具体步骤如下：

a.对照品溶液的制备：精密称取在105℃减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，配置每1ml成含黄芪甲苷0.604mg的标准对照品溶液。

b.线性关系的考察：精密吸取上述标准对照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置于具塞试管中，置水浴中加热，挥干溶剂，再分别精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，密塞，置于70℃水浴恒温加热20分钟，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸5.0ml摇匀，在560nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，黄芪甲苷量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，R值不低于0.9995。

c.供试品溶液的制备：精密称取约10mg黄芪总皂苷样品，加甲醇溶解，定容与20ml的容量瓶中，制得供试品溶液。

d.供试品中黄芪总皂苷的含量测定：按照c的制备方法和b中的操作方法，测定10批黄芪总皂苷提取物中黄芪总皂苷的含量均高于90％，为91.3％～96.82％，平均含量为93.12％。

(5)上述的提取物中黄芪甲苷含量测定方法特征在于为HPLC-DAD测定法，具体步骤如下：

a.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.5％磷酸为流动相，比例为0.25∶0.75，进行梯度洗脱，0至20分钟，乙腈浓度从25％至35％；21分钟至50分钟，乙腈浓度从35％至48％；检测器为DAD，检测波长为201～210nm，最优检测波长为205nm；流速0.5～1.0ml，最优流速为0.8ml；柱温20～40℃，最优柱温为35℃；进样量5～50μl。

b.对照品溶液制备方法与标准曲线的绘制：取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，制得储备对照品溶液，用储备对照品溶液配成5个不同浓度，按照色谱条件进样，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，R²值不低于0.9995。

c.供试品溶液制备方法：取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解，制得供试品溶液。

d.供试品中黄芪甲苷的含量测定：取适量供试品，按照(3)制备方法制得供试品溶液，按照(1)色谱条件进样，依据(2)中的回归方程求得黄芪甲苷含量。测得，10批黄芪总皂苷提取物中黄芪甲苷的含量均高于50％。

(6)上述黄芪总皂苷提取物的指纹图谱检测，其具体步骤如下：

a.色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5％磷酸水溶液比例为0.25∶0.75为流动相，进行梯度洗脱；0至20分钟，乙腈浓度从25％至35％；21分钟至50分钟，乙腈浓度从35％至48％；流速为0.8ml/min；检测器为DAD，检测波长为205nm；进样量为10μl。

b.参照品溶液的配置：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.50mg的溶液，作为参照品溶液。

c.供试品溶液的制备：精密称取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解配成每1ml含2.50mg的溶液，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪总皂苷提取物的指纹图谱检测供试液。

d.供试液指纹图谱检测：按照(1)中的色谱条件，用高效液相色谱对10批黄芪总皂苷提取物的供试液进行指纹图谱检测，记录50分钟色谱图，得黄芪总皂苷提取物的指纹图谱，黄芪总皂苷提取物的指纹图谱应与标准指纹图谱的相似度均大于0.90；黄芪总皂苷提取物的指纹图谱有16个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，16个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.116±0.002，2号峰0.125±0.001，3号峰0.145±0.003，4号峰0.177±0.002，5号峰0.352±0.002，6号峰0.385±0.004，7号峰0.413±0.002，8号峰0.444±0.003，9号峰0.466±0.002，10号峰0.505±0.001，11号峰0.638±0.002，12号峰0.890±0.003，13号峰0.944±0.003，14号峰1.000(S峰)，15号峰1.186±0.004和16号峰1.195±0.004。

附图说明

图1为黄芪甲苷标准曲线图(比色法)；

图2为以S1为参照生成的对照指纹图谱；

图3为实施例1-3获得的10批样品的叠加图(S1-S10)与对照指纹图谱(R)。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，通过以下实施例来说明，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

取黄芪药材500g(产地：甘肃省岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60％乙醇，第二次加药材量5倍量的60％乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，上D101大孔吸附树脂(陕西蓝深树脂特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40％乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的90％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷4g，用体积为3倍粗皂苷量的丙酮进行洗涤，洗涤液弃去，一共三次，得到精制总皂苷2.5g，加入3倍量的0.5％NaOH溶液，60℃下磁搅拌3h，加入0.1mol/L的稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到淡白色黄芪总皂苷提取物2.0g，总皂苷含量为97％。

实施例2

取黄芪药材500g(产地甘肃岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60％乙醇，第二次加药材量5倍量的60％乙醇，第三次加药材量3倍量的60％乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，上D101大孔吸附树脂(陕西蓝深特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40％乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的90％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷5g，用体积为3倍粗皂苷量的乙酸乙酯进行洗涤，洗涤液弃去，一共三次，得到精制总皂苷3g，精制总皂苷加入3倍量的1％NaOH溶液，60℃下磁搅拌6h，加入0.1mol/L稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到灰白色的黄芪总皂苷提取物2.6g，总皂苷含量为90％。

实施例3

取黄芪药材500g(产地甘肃岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60％乙醇，第二次加药材量5倍量的60％乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，上AB-8大孔吸附树脂(陕西蓝深树脂特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40％乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷3.8g，用体积为3倍粗皂苷量的乙醚进行洗涤，洗涤液弃去，一共三次，得到精制总皂苷部位2.3g，精制总皂苷加入3倍量的1％NaOH溶液，60℃下磁搅拌6h，加入0.5mol/L稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到灰白色的黄芪总皂苷提取物1.9g，总皂苷含量为93％。

实施例4

取实施例1-3获得的黄芪总皂苷提取物3批(批号分别为20111205，20111208和20111210)。

1.水分检查

取黄芪总皂苷提取物约2g，转移至干燥至恒重的称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在105℃下干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，再精密称定，在上述温度下干燥1h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算含水量(％)，结果见表1。

2.炽灼残渣检查

取黄芪总皂苷提取物1g，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓慢炽灼至炭化，放冷至室温；加硫酸0.5～1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽，在500～600℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重，放冷，称重，结果见表1。

3.重金属检查

取炽灼残渣项所得残渣，加硝酸0.5mL，蒸干后放冷，加盐酸2mL，置水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸盐缓冲液(PH 3.5)2mL，微热溶解后，置纳氏比色管中，加水稀释成25mL作为甲管。另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液(PH3.5)2mL与水15mL，作为乙管，再在两管中分别加入硫代乙酰胺试液各2mL，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自下向上透视，乙管中显出的颜色与甲管比，不得更深，结果见表1。

表1：水分、炽灼残渣、重金属检查结果

批号	水分(％)	炽灼残渣(％)	重金属(ppm)
				20111205	4.33	0.68	＜10
20111208	4.86	0.77	＜10
				20111210	4.75	0.62	＜10

实施例5

取实施例1-3获得的10批黄芪总皂苷提取物(批号分别为20111205、20111208、20111210、20111214、20111217、20111220、20111222、20111225、20111229、20111231)。

1.黄芪总皂苷提取物中黄芪皂苷含量测定

1.1实验仪器与试剂

1.1.1实验仪器

AB204-S型电子天平(METTLER TOLEDO)(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)

UV-2500PC光谱检测器(日本，shimadzu公司)

KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)

V-800旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)

1.1.2实验材料与试剂

对照品：黄芪甲苷购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，规格20mg/支，纯度大于98％；香草醛、冰醋酸、高氯酸和甲醇皆为分析纯，实验用水为实验室自制双蒸水。

1.1.3标准曲线的绘制

1.1.3.1对照品溶液的制备

精密称取在105℃减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，配置每1ml成含黄芪甲苷0.604mg的标准对照品溶液。

1.1.3.2供试品溶液的制备

精密称取称取约10mg黄芪总皂苷提取物，加甲醇溶解，定容与20ml的容量瓶中，制得供试品溶液。

1.1.3.3线性关系的考察

精密吸取上述标准对照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置于具塞试管中，置水浴中加热，挥干溶剂，再分别精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，密塞，置于70℃水浴恒温加热20分钟，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸5.0ml摇匀，在560nm处测定吸收度。结果表明黄芪甲苷浓度在60.4～302ug范围内，线性关系良好，标准回归方程为Y＝0.0012X+0.1986(R＝0.9997，n＝5)，见图1。

1.1.4 10批黄芪总皂苷提取物中总皂苷含量测定

取10份不同批次的黄芪总皂苷提取物，精密称定，按照供试品溶液制备方法和线性关系项下方法操作，依据标准曲线回归方程进行含量测定，结果见表2.

表2：10批黄芪总皂苷含量测定数据

2.黄芪总皂苷提取物中黄芪甲苷含量测定

2.1实验仪器与试剂

2.1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)

KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)

V-800旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)

2.1.2实验材料与试剂

对照品：黄芪甲苷购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，规格20mg/支，纯度大于98％。

试剂：乙腈、甲醇为色谱醇，磷酸为分析纯，水为实验室自制双蒸水。

2.2色谱条件

色谱柱为Ultimate XB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.5％磷酸水溶液体系，流速为0.8ml/min，检测波长为205nm。洗脱梯度见表3。

表3：洗脱梯度表

时间	乙腈/％	0.5％磷酸/％
			0	25	75
20	35	65
			50	48	52

2.3对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品19.92mg，以甲醇溶解并定溶于10ml容量瓶中，配置成每1ml含黄芪甲苷1.992mg的溶液。

2.4供试品溶液的制备

取黄芪总皂苷提取物约50mg，精密称定，用甲醇超声溶解并转移至20ml容量瓶中，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.5标准曲线的绘制

取上述对照品溶液，分别进样5、10、20、30、40μl。以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制工作曲线，回归方程为Y＝49.955x-18.475，R2＝1，线性范围：9.96～79.68μg。

2.6 10批黄芪总皂苷提取物中黄芪甲苷的含量测定

分别取10批黄芪总皂苷提取物约50mg，精密称定，按供试品处理方法制成样品溶液，按照上述色谱条件分别进样20μl，利用回归方程计算黄芪甲苷含量，每批重复三次，相对标准差RSD均不大于3％。结果见表4。

表4：10批黄芪总皂苷提取物中黄芪甲苷含量

3.HPLC指纹图谱测定

3.1仪器、材料与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(含四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器)。色谱数据的采集与处理由Agilent化学工作站完成。AB204-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。黄芪甲苷标准品购自阿拉丁试剂(上海)有限公司(规格20mg/支，纯度大于98％)。乙腈、甲醇为色谱醇，磷酸为分析纯，水为实验室自制双蒸水。

3.2色谱条件

Ultimate C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)梯度系统，0～20min，25％～35％A，21～50min，35％～48％A；检测波长205nm；柱温为35℃；流速为0.8ml/min。

3.3黄芪总皂苷提取物指纹图谱测定

3.3.1参照峰的选择

黄芪甲苷作为黄芪皂苷指标性成分，我们选择黄芪甲苷峰作为参照峰(S)，将其保留时间、峰面积均设为1.0，分别计算各峰相对保留时间和相对峰面积比值。各共有峰的相对保留时间见表5。

表5：10批黄芪总皂苷提取物的相对保留时间

3.3.2共有峰的指定

运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》相似度评价软件系统，结合10黄芪总皂苷提取物的HPLC图谱的相关参数，选择HPLC图谱中能够反映黄芪总皂苷提取物特征的共有峰来进行测定，最终确定16个共有峰。

3.3.3对照指纹图谱的生成

根据已建立的色谱条件对10批样品进行测定，将结果运用《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》相似度评价系统软件进行分析，以S1为参照图谱，经过多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱，结果见图2。

3.3.4相似度分析

运用《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》相似度评价系统软件，得到10批样品HPLC指纹图谱叠加图，见图3。通过多点矫正和数据匹配，对照图谱的生成，采用夹角余弦法计算10批样品与对照图谱的整体相似性，结果见表6。

表6：10批黄芪总皂苷提取物图谱与对照图谱相似度

对比例1

取黄芪药材500g(产地：甘肃省岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60％乙醇，第二次加药材量5倍量的60％乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水混悬，上D101大孔吸附树脂(陕西蓝深树脂特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40％乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的90％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷4.2g，加入3倍量的0.5％NaOH溶液，60℃下磁搅拌3h，加入0.1mol/L的稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到淡黄色黄芪总皂苷提取物3.6g。经检测，该提取物含水量5.03％，炽灼残渣0.75％，重金属含量小于10ppm，黄芪总皂苷含量为62％，黄芪甲苷含量为25％，与指纹对照图谱相似度为0.73。

Claims

1.黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照中国药典2010版附录IX水分测定法，所述提取物的含水量不超过5％。

2.根据权利要求1所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查法，所述提取物的炽灼残渣不超过1％。

3.根据权利要求1或2所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照《中国药典》2010版附录IX E重金属检查法，所述提取物的重金属含量不超过10ppm。

4.根据权利要求1至3任一项所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于用比色法测定所述提取物黄芪总皂苷的含量，所述提取物的黄芪总皂苷含量不低于90％。

5.根据权利要求1至4任一项所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于用HPLC-DAD法测定所述提取物中黄芪甲苷的含量，所述提取物的黄芪甲苷含量不得低于50％。

6.根据权利要求1至5任一项所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于根据所述指纹图谱检测法，所述提取物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.90。

7.制备权利要求1-6任一项所述的黄芪总皂苷提取物的方法，包括如下步骤：

(2)浓缩液上大孔树脂柱，得到粗皂苷；

(3)用中极性有机试剂反复洗涤粗皂苷，得到精制总皂苷；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述黄芪粉末过60目筛。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述浸泡提取包括用体积百分数为60-90％的乙醇在55℃下浸泡黄芪粉末的步骤。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述回流提取包括用60-90％乙醇回流提取黄芪粉末至少两次，其中第一次使用6～8倍黄芪粉末重量的60-90％乙醇回流提取至少1小时，第二次使用3～5倍黄芪粉末重量的60-90％乙醇回流至少30分钟。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(2)中，先用去离子水洗脱，再用浓度20％～40％乙醇洗脱3～5个柱体积，最后用体积百分数为70％～90％的乙醇洗脱3～5个柱体积，收集，浓缩蒸干得到粗皂苷。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述大孔树脂柱选自非极性或弱极性大孔树脂柱。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述非极性大孔树脂柱选自AB-8、D101或D104，所述弱极性大孔树脂柱选自HP20或HPD300。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述大孔树脂的用量不低于黄芪粉末重量的20倍。

15.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(3)中，用体积为1～3倍粗皂苷重量的中极性有机试剂反复洗涤，洗涤次数＞2次。

16.根据权利要求15所述的方法，所述中极性有机试剂选自丙酮、乙醚或乙酸乙酯，优选丙酮。

17.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(4)中，用体积为3～5倍精制总皂苷重量的碱溶液，加热磁搅拌水解总皂苷。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述加热温度为40～60℃，磁搅拌转速为1000～2000rpm，时间为4～6h。

19.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述碱溶液选自0.5％～1％的NaOH，Ca(OH)₂或KOH溶液。

20.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述稀酸为稀盐酸或醋酸或稀磷酸，稀酸浓度为0.1～0.5mol/L。

21.根据权利要求7至20任一项所述的方法得到的黄芪总皂苷提取物。

22.黄芪总皂苷提取物的质量标准控制方法，其特征在于测定所述提取物的水分、炽灼残渣、重金属含量、黄芪总皂苷含量、黄芪甲苷含量以及提取物指纹图谱检测。

23.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于参照中国药典2010版附录IX水分测定法，规定所述提取物的含水量不得超过5％。

24.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查法，规定所述提取物的炽灼残渣不得超过1％。

25.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于参照《中国药典》2010版附录IX E重金属检查法，规定所述提取物的重金属含量不得超过10ppm。

26.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于用比色法测定所述提取物黄芪总皂苷的含量，规定所述提取物的黄芪总皂苷含量不得低于90％。

27.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于用HPLC-DAD法测定所述提取物中黄芪甲苷的含量，规定所述提取物的黄芪甲苷含量不得低于50％。

28.根据权利要求27中所述的质量标准控制方法，其特征在于所述HPLC-DAD法测定包括如下步骤：

(1).色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.5％磷酸为流动相，进行梯度洗脱；检测器为DAD，检测波长为201～210nm；流速0.5～1.0ml，柱温20～40℃，进样量5～50μl；

(2).对照品溶液制备方法与标准曲线的绘制：取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，制得储备对照品溶液，用储备对照品溶液配成3～6个不同浓度，按照色谱条件进样，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，R²值不低于0.9995；

(3).供试品溶液制备方法：取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解，制得供试品溶液；

(4).供试品中黄芪甲苷的含量测定：取适量供试品，按照(3)制备方法制得供试品溶液，按照(1)色谱条件进样，依据(2)中的回归方程求得黄芪甲苷含量。

29.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于根据所述指纹图谱检测法，规定黄芪总皂苷提取物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度应大于0.90。

30.根据权利要求29中所述的质量标准控制方法，其特征在于所述指纹图谱检测法包括如下步骤：

(1).色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5％磷酸水溶液比例为0.25∶0.75为流动相，进行梯度洗脱；0至20分钟，乙腈浓度从25％至35％；21分钟至50分钟，乙腈浓度从35％至48％；流速为0.5～1ml/min；检测器为DAD，检测波长为201～210nm，最优波长为205nm；进样量为5～50μl；

(2).参照品溶液的配置：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.50mg的溶液，作为参照品溶液；

(3).供试品溶液的制备：精密称取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解配成每1ml含2.50mg的溶液，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪总皂苷提取物的指纹图谱检测供试液；

(4).供试液指纹图谱检测：按照(1)中的色谱条件，用高效液相色谱对黄芪总皂苷提取物的供试液进行指纹图谱检测，记录50分钟色谱图，得黄芪总皂苷提取物的指纹图谱，黄芪总皂苷提取物的指纹图谱应与标准指纹图谱的相似度大于0.90；所述黄芪总皂苷提取物的指纹图谱共有16个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，16个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.116±0.002，2号峰0.125±0.001，3号峰0.145±0.003，4号峰0.177±0.002，5号峰0.352±0.002，6号峰0.385±0.004，7号峰0.413±0.002，8号峰0.444±0.003，9号峰0.466±0.002，10号峰0.505±0.001，11号峰0.638±0.002，12号峰0.890±0.003，13号峰0.944±0.003，14号峰1.000(S峰)，15号峰1.186±0.004和16号峰1.195±0.004。