CN106420849A - 一种由银杏叶组合物制备的舒血宁注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种银杏叶组合物，具体公开了一种由银杏叶组合物制备的舒血宁注射液及其制备方法。该银杏叶组合物的制备方法包括：取银杏叶超微粉碎，加入提取剂超声提取，滤渣再用有机溶剂回流提取，收集提取液；调节pH后离心；离心液过大孔吸附树脂柱；用的纯化水、15％乙醇冲洗树脂，用5‑6BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡0.5‑1h后洗脱，收集洗脱液；洗脱液经减压浓缩后萃取；调节pH，陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。本发明的银杏组合物目标成分含量高，纯度好，提高了产品质量。本发明的制得的舒血宁注射液，稳定性好，杂质少，溶解度好，疗效稳定。

Description

一种由银杏叶组合物制备的舒血宁注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种银杏叶组合物，具体涉及一种由银杏叶组合物制备的舒血宁注射液及其制备方法。
背景技术
银杏又名公孙树、白果树等，其种子白果仁作为止咳平喘、缩小便、止带浊的中药在我国已有很久历史。其叶子银杏叶又称白果叶，是银杏科植物银杏的干燥叶，味苦、甘涩、性平、小毒。银杏叶的化学成分很复杂，迄今已发现170多种化合物，主要为黄酮类、萜类、醇类、生物碱类、聚异戊二烯类、多糖等具有药理作用的活性成分，有毒成分为银杏酸。
银杏叶为传统的活血化瘀中药材。随着银杏叶生物活性成分药理与毒理研究的深入，其药用功能逐步探明。银杏黄酮具有扩张冠状血管、解痉、清除体内自由基等功能，银杏内酯与白果内酯属银杏特有成分，是治疗心脑血管疾病及神经系统疾病的首选天然药物。
银杏叶为舒血宁注射液的原料，经过提取注射成注射液，用于疗肺虚咳喘、冠心病、高血脂、抑郁症、糖尿病、神经疾病、记忆障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、脑转耳鸣等疾病的治疗。
目前，国内关于银杏叶提取物的提取方法的文献有很多。
中国专利申请201510197308.4公开了一种银杏叶提取物的制备方法，该方法包括：(1)银杏叶的预处理：将新鲜银杏叶洗净、烘干、粉碎至粉末；(2)浸提：将步骤(1)得到的银杏叶粉末用乙醇浸提，银杏叶粉末与乙醇的配比按银杏叶粉末的重量：乙醇的体积＝1：7，过滤，将滤渣再用乙醇浸提，滤渣与乙醇的配比按滤渣的重量：乙醇的体积＝1：7～8，过滤，合并浸提液；(3)抽滤：将步骤(2)得到的浸提液进行过滤、抽滤，得滤液；(4)蒸馏、浓缩：将步骤(3)得到的滤液进行浓缩，得浓缩滤液；(5)干燥：将步骤(4)得到的浓缩滤液进行干燥，纯化，得提取物。该制备方法仅采用乙醇进行浸提，无后续纯他除杂步骤，所得提取液的杂质多。
中国专利申请201310370709.6公开了一种银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：第一步，水洗，将采摘好的银杏叶用清水冲洗，以去除叶面的灰尘和杂质；第二步，甩干，将第一步洗净的银杏叶放入离心机中，对银杏叶进行甩干；第三步，粉碎，将经过第二步处理的银杏叶放入粉碎机中，对银杏叶进行粉碎处理，制得银杏叶粉末；第四步，水提，将经过第三步处理的银杏叶粉末使用HCl溶液进行提取，获得混合提取液；第五步，上柱，将第四步制得的混合提取液依次进行过滤、冷却、静置和离心过滤后，采用大孔树脂柱对混合提取液进行吸附，使得混合提取液中的有效成分被大孔树脂完全吸附；第六步，解析，将第五步中吸附了银杏叶提取液中有效成分的大孔树脂，使用纯净水冲洗，以去除蛋白质及多糖类大分子杂质，再使用乙醇对所述大孔树脂进行梯度解析，得到混合解析液，混合解析液经过浓缩得到粗浸膏；第七步，萃取，向第六步制得的粗浸膏中加入石油醚进行数次萃取；第八步，干燥。将第七步制得的银杏叶提取物浸膏放入真空干燥机中进行干燥处理，最终制得银杏叶提取物。该制备方法采用醚进行萃取，醚为低素试剂，该方法步骤繁杂，增加了带入外来杂质的几率，不适于大规模生产使用。
中国专利申请201610053191.7公开了一种由银杏叶提取物形成的中药组合物，以占所述中药组合物的质量百分比计，包括，24-40％的银杏总黄酮，6-16％的银杏内酯，银杏酸小于5ppm。优选地还包括，1-1.68％的槲皮素-3-O-葡萄糖苷，2.11-3.53％的槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷。进一步优选地还包括，1.4-3％的银杏内酯A，0.9-1.8％的银杏内酯B和1.2-1.3％的银杏内酯C。本申请的中药组合物明确了两种对其药物具有重要影响的槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，并进一步的将其含量精确限定为1-1.68％和2.11-3.53％，进一步的，清楚的界定其银杏内酯A1.4-3％，银杏内酯B0.9-1.8％和银杏内酯C1.2-1.3％。该申请采用乙醇－水溶液进行提取，有效成分提取率低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种有效成分含量高、杂质少的银杏叶提取物组合物。
本发明还提供了一种由银杏叶组合物制备的舒血宁注射液。
一种银杏叶组合物，以占所述组合物的质量百分比计，包括25-44％总黄酮醇苷，7-17％银杏内酯，2-5％白果内酯，银杏酸小于5ppm。
进一步地，以质量百分比计，所述银杏叶组合物中包括，2.02-2.66％芦丁(Rutin)、1.20-1.67％山柰酚-3-O-芸香糖苷(KGR)、1.21-1.98％异鼠李素-3-Q-芸香糖苷(IGR)、1.23-1.76％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷(KRG)、2.57-3.87％槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(QRcG)和1.95-2.65％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(KRcG)。
更进一步地，以质量百分比计，所述银杏叶组合物中包括，2.20-2.55％芦丁(Rutin)、1.41-1.57％山柰酚-3-O-芸香糖苷(KGR)、1.69-1.98％异鼠李素-3-Q-芸香糖苷(IGR)、1.34-1.75％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷(KRG)、2.90-3.53％槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(QRcG)和2.14-2.61％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(KRcG)。
所述银杏叶组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取银杏叶超微粉碎，加入提取剂，50-60℃下超声提取0.5-1h，收集提取液，滤渣再用3-5倍的有机溶剂回流提取0.5-1.5h，收集提取液；
(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.5-8.0，静置12-24h，过滤，加水定容至银杏叶量的5-6倍体积；
(3)加浓盐酸调节pH为4.5-5.0，4500-5000r/min离心；
(4)离心液以1.6-1.8BV/h过大孔吸附树脂柱；用1-1.5BV的纯化水、1.5-2BV的15％乙醇以3.0-4.0BV/h的流速冲洗树脂，用5-6BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡0.5-1h，以1.3-1.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；
(6)加入无水乙醇，使醇含量为85-88％，加入NaOH溶液调节pH为7.3-7.5，冷却静置24-36h，上清液用陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。
所述步骤(1)中的提取剂为浓度为6-10wt％碳酸氢钠和3-5wt％的乙酸钠的混合溶液，所述提取剂与银杏叶的质量比为4-5：1。
所述有机溶剂为50-60％的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，二者的体积比为3-4：1。
所述树脂为D101和ADS-F8，二者的质量比为2-3：1。
所述萃取第1次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4-5：1：4-5，第2次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为2-3：1：4-5。
一种舒血宁注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取所述银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；
(2)调节pH至3.5-4.0，加热至80-85℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸5-8min；
(3)冷却至50℃以下，调节pH4.7-5.0，定容，搅拌均匀；
(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。
本发明舒血宁注射液的使用方法为：肌肉注射，一次10ml，一日1～2次；静脉滴注，每日20ml，用5％葡萄糖注射液或0.9％生理盐水注射液稀释250ml或500ml后使用，或遵医嘱。
乙醇浓度对于银杏叶组合物的质量影响较大，银杏叶组合物的制备过程中，醇浓度越高，杂质去除的越多，有效成分损失也越大。因此，本发明所选取乙醇的浓度有利于组合物中杂质的去除及降低有效成分的损失。
与现有技术相比本发明的有益效果在于：本发明的银杏组合物的提取方法采用D101和ADS-F8两种树脂吸附，有效去除了有害成分总银杏酸，降低了类过敏反应的发生；同时，采用多种提取方法，包括碳酸氢钠和乙酸钠的混合溶液超声提取，以及采用乙醇和二氯甲烷组成的混合溶剂提取，还采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂多次萃取，目标成分含量高，纯度好，提高了产品质量。
本发明通过对银杏叶提取物组合物中有效成分含量的进一步精确，提高了银杏叶提取物的药效。本发明制得的舒血宁注射液，稳定性好，杂质少，溶解度好，疗效稳定。
具体实施方式
实施例1：银杏叶组合物
一、提取方法
(1)取银杏叶超微粉碎，加入提取剂，55℃下超声提取0.75h，收集提取液，滤渣再用4倍的有机溶剂回流提取1h，收集提取液；
(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.6，静置20h，过滤，加水定容至银杏叶量的6倍体积；
(3)加浓盐酸调节pH为4.6，4800r/min离心；
(4)离心液以1.7BV/h过大孔吸附树脂柱；用1.2BV的纯化水、1.6BV的15％乙醇以3.5BV/h的流速冲洗树脂，用5.5BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡1h，以1.4BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；
(6)加入无水乙醇，使醇含量为86％，加入NaOH溶液调节pH为7.4，冷却静置30h，上清液用陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。
其中，步骤(1)中的提取剂为浓度为8wt％碳酸氢钠和4wt％的乙酸钠的混合溶液，所述提取剂与银杏叶的质量比为5：1。
有机溶剂为55％的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，二者的体积比为4：1。
大孔吸附树脂柱中的树脂为D101和ADS-F8，二者的质量比为3：1。
萃取第1次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为5：1：4，第2次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为3：1：4。
二、含量检测
1、总黄酮醇苷照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0512)测定。
1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；
2)对照品溶液的制备：分别取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液；
3)供试品溶液的制备：取本品约35mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液(或对照提取物溶液)与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素与异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量：
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。
2、萜类内酯照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0512)测定。
1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丁醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。
2)对照品溶液的制备：分别取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作为对照品溶液。
3)供试品溶液的制备：取本品约0.15g，精密称定，加水10ml，至水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，即得。
3、总银杏酸
照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0512)测定。
1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90∶10)为流动相；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。
2)对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为定位用对照溶液。
3)供试品溶液的制备：取本品粉末约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60-90℃)50ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚(60-90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。
4)测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。
4、Rutin、KGR、IGR、KRG、QRcG和KRcG含量的测定
1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相A：0.4％磷酸、流动相B：乙腈，按下表进行梯度洗脱；
时间(min) A(％) B(％)
0～8 83.5 16.5
8～17 83.5→80 16.5→20
17～25 80 20
25～34 80→78 20→22
34～-40 78 22
40～70 78→67 22→33
70～70.01 83.5 16.5
流速为1.0ml/min；检测波长为360nm；柱温48℃。理论按芦丁峰计算应不低于10000。
2)对照品溶液制备：精密称取芦丁(Rutin)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(KGR)、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷(IGR)、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷(KRG)、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(QRcG)和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(KRcG)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，即得。
3)供试品溶液的制备：取银杏叶提取物35mg，加甲醇10ml，超声处理10min，滤过，即得。
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别计算芦丁(Rutin)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(KGR)、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷(IGR)、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷(KRG)、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(QRcG)和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(KRcG)的总量。
5、杂质成分检测
5.1炽灼残渣：取本品1.0g置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；加硫酸1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在500-600℃炽灼使完全炭化，移至干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500-600℃炽灼至恒重，称重。该重量与取样量的比值为炽灼残渣值。
5.2重金属及有害元素(电感耦合等离子体质谱法)
1)标准品储备液的制备：分别精密量取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml分别含铅、砷、镉、汞、铜为1μg、0.5μg、1μg、1μg、10μg的溶液，即得。
2)标准品溶液的制备：精密量取铅、砷、镉、铜标准品储备液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml含铅、砷0ng、1ng、5ng、10ng、20ng，含镉0ng、0.5ng、2.5ng、5ng、10ng，含铜0ng、50ng、100ng、200ng、500ng的系列浓度混合溶液。另精密量取汞标准品储备液适量，用10％硝酸溶液稀释制成每1ml分别含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5ng的溶液，本液应临用配制。
3)内标溶液的制备：精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液适量，用水稀释制成每1ml各含1μg的混合溶液，即得。
4)供试品溶液的制备取供试品于60℃干燥2小时，粉碎成粗粉，取约0.5g，精密称定，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸5-10ml。密闭并按各微波消解仪的相应要求及一定的消解程序进行消解。消解完全后，消解液冷却至60℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50ml量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金单元素标准溶液(1μg/ml)，200μl，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
除不加金单元素标准溶液外，余同法制备试剂空白溶液。
5)测定法：以测量值(3次读数的平均值)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，读取3次读数的平均值。从标准曲线上计算相应的浓度。在相同的分析条件下进行空白试验，扣除空白干扰。
5.3大孔吸附树脂残留检查：照残留溶剂测定法(《中国药典》2015年版四部附录0861第二法)测定。
1)色谱条件与系统适用性试验：以键合/交联聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氢火焰离子化检测器，柱温，程序升温，起始温度为60℃，维持16分钟，再以每分钟20℃升温至200℃，维持2分钟；检测器温度300℃；进样口温度240℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟。理论板数以邻二甲苯峰计算应不低于40000，各待测峰之间的分离度应符合规定。
2)对照品溶液的制备：精密称取正己烷，苯，甲苯，对二甲苯，邻二甲苯，苯乙烯，1，2-二乙基苯和二乙烯苯对照品适量，加N，N-二甲基乙酰胺制成每1ml中分别含20μg、4μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg的溶液，作为对照品储备液。精密吸取上述储备液2ml，置50ml量瓶中，加25％N，N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得。
3)供试品溶液的制备：取本品约0.1g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入25％的N，N-二甲基乙酰胺溶液5ml，密封瓶口，摇匀，即得。
4)测定法：分别精密量取顶空气体1ml，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
检测结果：总黄酮醇苷(％)：42.5；银杏内酯(％)：12.1；白果内酯(％)：4.3；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.22；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。
其中，2.55％芦丁、1.41％山柰酚-3-O-芸香糖苷、1.69％异鼠李素-3-Q-芸香糖苷、1.67％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷、3.18％槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷和2.61％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷。
实施例2：银杏叶组合物
一、提取方法
(1)取银杏叶超微粉碎，加入提取剂，50℃下超声提取0.5h，收集提取液，滤渣再用3倍的有机溶剂回流提取0.5h，收集提取液；
(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.5，静置12h，过滤，加水定容至银杏叶量的5倍体积；
(3)加浓盐酸调节pH为4.5，4500r/min离心；
(4)离心液以1.6BV/h过大孔吸附树脂柱；用1BV的纯化水、1.5BV的15％乙醇以3.0BV/h的流速冲洗树脂，用5BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡0.5h，以1.3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；
(6)加入无水乙醇，使醇含量为85％，加入NaOH溶液调节pH为7.3，冷却静置24h，上清液用陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。
其中，步骤(1)中的提取剂为浓度为6wt％碳酸氢钠和5wt％的乙酸钠的混合溶液，所述提取剂与银杏叶的质量比为4：1。
有机溶剂为50％的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，二者的体积比为3：1。
大孔吸附树脂柱中的树脂为D101和ADS-F8，二者的质量比为2：1。
萃取第1次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4：1：5，第2次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为2：1：5。
二、含量检测，方法同实施例1。
检测结果：总黄酮醇苷(％)：39.2(其中槲皮素的含量为5.87％、山柰素的含量为6.23％、异鼠李素的含量为2.80％)；银杏内酯(％)：7.0；白果内酯(％)：3.2；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.28；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。
其中，2.20％芦丁、1.52％山柰酚-3-O-芸香糖苷、1.83％异鼠李素-3-Q-芸香糖苷、1.75％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷、3.53％槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷和2.14％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷。
实施例3：银杏叶组合物
一、提取方法
(1)取银杏叶超微粉碎，加入提取剂，60℃下超声提取1h，收集提取液，滤渣再用5倍的有机溶剂回流提取1.5h，收集提取液；
(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为8.0，静置24h，过滤，加水定容至银杏叶量的6倍体积；
(3)加浓盐酸调节pH为5.0，5000r/min离心；
(4)离心液以1.8BV/h过大孔吸附树脂柱；用1.5BV的纯化水、2BV的15％乙醇以4.0BV/h的流速冲洗树脂，用6BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡1h，以1.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；
(6)加入无水乙醇，使醇含量为88％，加入NaOH溶液调节pH为7.5，冷却静置36h，上清液用陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。
其中，步骤(1)中的提取剂为浓度为10wt％碳酸氢钠和3wt％的乙酸钠的混合溶液，所述提取剂与银杏叶的质量比为5：1。
有机溶剂为60％的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，二者的体积比为4：1。
大孔吸附树脂柱中的树脂为D101和ADS-F8，二者的质量比为3：1。
萃取第1次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4：1：4，第2次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为2：1：4。
二、含量检测，方法同实施例1。
检测结果：总黄酮醇苷(％)：32.3(其中槲皮素的含量为4.71％、山柰素的含量为4.72％、异鼠李素的含量为2.84％)；银杏内酯(％)：7.9；白果内酯(％)：3.9；银杏酸(百万分之)：未检出；炽灼残渣(％)：0.25；铅(百万分之)：未检出；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：未检出；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：未检出；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。
其中，2.43％芦丁、1.57％山柰酚-3-O-芸香糖苷、1.98％异鼠李素-3-Q-芸香糖苷、1.34％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷、2.90％槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷和2.41％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷。
实施例4：舒血宁注射液
(1)取所述银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；
(2)调节pH至3.6，加热至82℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸7min；
(3)冷却至50℃以下，调节pH4.8，定容，搅拌均匀；
(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。
注射液含量测定方法基本同组合物的，以下与供试品制备有所不同：
1、总黄酮醇苷测定中供试品溶液的制备：精密量取本品10ml，加甲醇16ml，18％盐酸溶液6ml，置水浴中加热回流1.5小时，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2、Rutin、KGR、IGR、KRG、QRcG和KRcG含量的测定
1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相A：：乙腈、流动相B：0.4％磷酸，按下表进行梯度洗脱；
时间(min) A(％) B(％)
0～8 15→15 85→85
8～17 15→17 85→83
17～25 17→17 83→83
25～34 17→20 83→80
34～-40 20→20 80→80
40～70 20→35 80→65
70～70.01 35→15 65→85
平衡时间10min；流速为1.0ml/min；检测波长为360nm；柱温48℃。理论按芦丁峰计算应不低于10000。
2)对照品溶液制备：精密称取芦丁(Rutin)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(KGR)、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷(IGR)、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷(KRG)、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(QRcG)和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(KRcG)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，即得。
3)供试品溶液的制备：取本品作为供试品溶液。
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别计算芦丁(Rutin)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(KGR)、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷(IGR)、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷(KRG)、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(QRcG)和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷(KRcG)的总量。
经检测，含总黄酮醇苷0.91mg/ml，银杏内酯0.23mg/ml，白果内酯0.11mg/ml，银杏酸未检出。
其中，芦丁0.0690mg/ml、山柰酚-3-O-芸香糖苷0.0530mg/ml、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷0.0524mg/ml、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷0.0401mg/ml、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷0.0782mg/ml和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷0.0703mg/ml。
实施例5：舒血宁注射液
(1)取所述银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；
(2)调节pH至3.5，加热至80℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸5-8min；
(3)冷却至50℃以下，调节pH4.7，定容，搅拌均匀；
(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。
经检测，含总黄酮醇苷0.92mg/ml，银杏内酯0.24mg/ml，白果内酯0.10mg/ml，银杏酸未检出。
其中，芦丁0.0599mg/ml、山柰酚-3-O-芸香糖苷0.0563mg/ml、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷0.0567mg/ml、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷0.0416mg/ml、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷0.0794mg/ml和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷0.0655mg/ml。
实施例6：舒血宁注射液
(1)取所述银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；
(2)调节pH至4.0，加热至85℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸5-8min；
(3)冷却至50℃以下，调节pH5.0，定容，搅拌均匀；
(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。
经检测，含总黄酮醇苷0.89mg/ml，银杏内酯0.23mg/ml，白果内酯0.11mg/ml，银杏酸未检出。
其中，芦丁0.0645mg/ml、山柰酚-3-O-芸香糖苷0.0574mg/ml、异鼠李素-3-Q-芸香糖苷0.0582mg/ml、山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷0.0370mg/ml、槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷0.0761mg/ml和山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷0.0678mg/ml。
对比例1
(1)取银杏叶超微粉碎，55℃下超声0.75h，收集提取液，滤渣再用4倍的有机溶剂回流提取1h，收集提取液；
(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.6，静置20h，过滤，加水定容至银杏叶量的6倍体积；
(3)加浓盐酸调节pH为4.6，4800r/min离心；
(4)离心液以1.7BV/h过大孔吸附树脂柱；用1.2BV的纯化水、1.6BV的15％乙醇以3.5BV/h的流速冲洗树脂，用5.5BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡1h，以1.4BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；
(6)加入无水乙醇，使醇含量为86％，加入NaOH溶液调节pH为7.4，冷却静置30h，上清液用陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。
其中，有机溶剂为55％的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，二者的体积比为4：1。
大孔吸附树脂柱中的树脂为D101。
萃取第1次采用的萃取剂中正丁醇和乙酸乙酯的体积比为5：4，第2次采用的萃取剂中正丁醇和丙三醇的体积比为3：1。
含量检测，方法同实施例1，结果如下：
检测结果：总黄酮醇苷(％)：25.9(其中槲皮素的含量为3.44％、山柰素的含量为3.82％、异鼠李素的含量为3.06％)；银杏内酯(％)：6.1；白果内酯(％)：2.7；银杏酸(百万分之)：2.4；炽灼残渣(％)：0.60；铅(百万分之)：1；镉(千万分之)：未检出；砷(千万分之)：1；汞(千万分之)：未检出；铜(百万分之)：5；正己烷(％)：未检出；苯(％)：未检出；甲苯(％)：未检出；对二甲苯(％)：未检出；邻二甲苯(％)：未检出；苯乙烯(％)：未检出；1，2-二乙基苯(％)：未检出；二乙烯苯(％)：未检出。
实验例1：对大鼠在体血栓形成的影响试验
(一)动物
S.D大鼠，雌雄各半，体重300～350g。
(二)药物
S4:实施例4制备得到的舒血宁注射液，
D1:对比例1的银杏叶提取物配制形成的银杏叶注射液。
(三)仪器
BT-87-3被实验性体内血栓形成测定仪，包头医学院生产。
(四)方法
1、分组
将大鼠随机分为4组：空白对照组(给予生理盐水)、溶媒对照组、S4用药组(40mg/kg,相当于人用剂量的22倍)、D1用药组(40mg/kg,相当于人用剂量的22倍)。每组10只。
2、各大鼠由舌下狰脉注射试验药物(容量0.2ml/鼠)。给药后30分钟以戊巴比妥钠(30mg/kg，ip)麻醉。分离右侧颈动脉，采用BT-87-3型实验性体内血栓形成测定仪，在其近端置刺激电极，在其远端置测温器，以2.0mA直流电刺激3分钟后，记录其堵塞时间(OT)，即血栓形成时间。
3、计算给药后的血栓形成时间延长率，即：
(给药组的血栓形成时间-空白对照组的血栓形成时间)/空白对照组的血栓形成时间×100。结果如表2所示。
表1
组别 血栓形成时间(s) 延长％
空白对照组 680.6±95.8
溶煤对照组 607.8±222.3* 10.7
S4用药组 1559.3±735.1** 129.1
D1用药组 1385.0±698.7** 103.5
D1用药组 1407.3±708.2** 109.3
x土SD；n＝10；与空白对照组比较：*p<0.05:**p<0.01
从表1可以看出，本发明的S4静脉注射可明显延长大鼠体内血栓形成时间，其效果优于D1。
实验例2：对冠心病心绞痛的作用
1、病例：120例住院患者均符合1979年WHO制定的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》，根据卫生部1993年制定的中药新药治疗胸痹(冠心病心绞痛)的临床研究指导原则，确定中医证型和冠心病心绞痛轻重分级标准。
轻度：有较典型的心绞痛发作，但疼痛不重，有时需含硝酸甘油；
中度：每天有数次较典型的心绞痛发作，每次持续数分钟至10分钟，一般都需含服硝酸甘油；
较重度：每天有多次典型发作，影响日常生活活动，每次发作持续时间较长，需多次含服硝酸甘油；
重度：疼痛发作次数及程度均比较严重者。
随机分为2组，治疗1组60例，男32例，女28例，平均年龄(56.3±9.3)岁，平均病程(6.8±7.1)年；治疗2组60例，男31例，女29例，平均年龄(55.7±8.7)岁，平均病程(7.0±6.8)年。
2、治疗方法：
治疗1组给予5％葡萄糖注射液250ml+实施例6 20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天；
治疗2组给予5％葡萄糖注射液250ml+市售注射液20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天。
3、观察指标：每天观察2次，了解临床症状、体征、舌象、脉象及有关反应，心率、血压等一般体格检查项目，并做详细记录。用药前后各查一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，三大常规化验及心、肝、肾功能检查，常规12导联心电图。
心绞痛症状疗效评定标准按轻度、中度、分别评定：
轻度：症状消失或基本消失为显效；疼痛发作次数、程度及持续时间明显减轻为有效；症状基本与治疗前相同为无效；疼痛发作次数、程度及持续时间有所加重(或达到“中度、较重度”标准)为加重。
中度：症状消失或基本消失为显效；症状减轻到“轻度”标准为有效；症状基本与治疗前相同为无效；疼痛发作次数、程度及持续时间有所加重(或达到“较重度”标准)为加重。
心电图疗效评定标准：显效：心电图恢复到“大致正常”或达到“正常心电图”；有效：ST段降低，以治疗后回升0.05mv以上，但未达到正常标准，在主要导联倒置T波变浅(达25％以上者)，或T波由平坦变为直立，房室或室内传导阻滞改善者；无效：心电图基本与治疗前相同；加重：ST段较治疗前降低0.05mv以上，在主要导联倒置T波加深(达25％以上者)或直立T波变平坦，平坦T波变倒置，以及出现异位心律、房室传导阻滞或室内传导阻滞。
4、结果
实验期间未见任何不良反应。
4.1NO、NOS、SOD、MDA变化情况：见表2。
表2：治疗前后NO、NOS、SOD、MDA比较
注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较#P＜0.05。
从表2可以看出：
一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)：与治疗前相比，治疗1组的NO、NOS、SOD显著增加(P＜0.01)，治疗2组的NO、NOS、SOD明显增加(P＜0.05)；与治疗2组相比，治疗1组的NO、NOS、SOD明显增加(P＜0.05)；
丙二醛(MDA)：与治疗前相比，治疗1组的MDA显著减少(P＜0.01)，治疗2组的MDA明显减少(P＜0.05)；与治疗2组相比，治疗1组的MDA明显减少(P＜0.05)。
4.2心绞痛临床疗效比较：见表3。
表3：心绞痛疗效比较
例数 显效 有效 无效 加重
1组 60 18 41 1 0
2组 60 11 33 16 0
从表3可以看出：从有效来说，治疗1组的心绞痛效果明显优于治疗2组；从总有效率来说，治疗1组治疗心绞痛的总有效率为98.3％，治疗2组的总有效率为73.3％，治疗1组的总有效率优于治疗2组。
4.3心电图疗效比较：见表4。
表4：心电图疗效比较
组别 例数 显效 有效 无效 加重
1组 60 7 36 17 0
2组 60 5 26 29 0
从表4可以看出：从有效来说，治疗1组的心电图疗效有效和显效(36+7)明显优于治疗2组(26+5)；从总有效率来说，治疗1组治疗心绞痛的总有效率为71.7％，治疗2组的总有效率为51.7％，治疗1组心电图疗效的总有效率优于治疗2组。
4.4动态心电图缺血性ST-T改变时间比较：见表5。
表5：动态心电图缺血性ST-T改变时间比较
组别 例数 治疗前 治疗后
1组 60 130.93±17.85 32.17±5.11**#※
2组 60 129.87±18.06 64.94±7.52*
注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较#P＜0.05。
从表5可以看出：与治疗前相比，治疗1-2组心电图缺血性ST-T改变时间有不同程度的减少(P＜0.05，P＜0.01)；与治疗2组分别相比，治疗1组心电图缺血性ST-T改变时间明显减少(P＜0.05)。
5、实验小结：本发明提供的注射液可以治疗心绞痛，效果优于市售产品。
以上对本发明实施例所提供的一种由银杏叶组合物制备的舒血宁注射液及其制备方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种银杏叶组合物，其特征在于，以占所述组合物的质量百分比计，包括25-44％总黄酮醇苷，7-17％银杏内酯，2-5％白果内酯，银杏酸小于5ppm。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以质量百分比计，所述银杏叶组合物中包括，2.02-2.66％芦丁、1.20-1.67％山柰酚-3-O-芸香糖苷、1.21-1.98％异鼠李素-3-Q-芸香糖苷、1.23-1.76％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-葡萄糖苷、2.57-3.87％槲皮素-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷和1.95-2.65％山柰酚-3-O-鼠李糖-2-O-(6-O-对羟基反式桂皮酰)-葡萄苷。
3.根据权利要求1或2所述的银杏叶组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取银杏叶超微粉碎，加入提取剂，50-60℃下超声提取0.5-1h，收集提取液，滤渣再用3-5倍的有机溶剂回流提取0.5-1.5h，收集提取液；
(2)合并提取液，用NaOH溶液调节pH为7.5-8.0，静置12-24h，过滤，加水定容至银杏叶量的5-6倍体积；
(3)加浓盐酸调节pH为4.5-5.0，4500-5000r/min离心；
(4)离心液以1.6-1.8BV/h过大孔吸附树脂柱；用1-1.5BV的纯化水、1.5-2BV的15％乙醇以3.0-4.0BV/h的流速冲洗树脂，用5-6BV的80％乙醇加入树脂柱内浸泡0.5-1h，以1.3-1.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)洗脱液经减压浓缩得浓缩液，浓缩液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯组成的萃取剂萃取，萃取次数为2次；浓缩至4g/ml；
(6)加入无水乙醇，使醇含量为85-88％，加入NaOH溶液调节pH为7.3-7.5，冷却静置24-36h，上清液用陶瓷膜超滤，浓缩，干燥，得银杏叶组合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取剂为浓度为6-10wt％碳酸氢钠和3-5wt％的乙酸钠的混合溶剂，所述提取剂与银杏叶的质量比为4-5：1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为50-60％的乙醇和二氯甲烷的混合溶液，二者的体积比为3-4：1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述树脂为D101和ADS-F8，二者的质量比为2-3：1。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述萃取第1次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为4-5：1：4-5，第2次采用的萃取剂中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的体积比为2-3：1：4-5。
8.一种由权利要求1或2所述的组合物制备舒血宁注射液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取所述银杏叶组合物，经0.22μm滤膜过滤至配剂罐中，加注射用水稀释；
(2)调节pH至3.5-4.0，加热至80-85℃，加入药用炭，搅拌均匀，煮沸5-8min；
(3)冷却至50℃以下，调节pH4.7-5.0，定容，搅拌均匀；
(4)取样检测，符合规定后经0.3μm滤膜过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，取样检测，合格后，灌装，充氮气，经115℃灭菌30min，送检，包装。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述舒血宁注射液采用5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水注射液，稀释250ml或500ml后使用。
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