CN101507742B

CN101507742B - 一种羽芒菊总黄酮的制备方法及其用途

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Publication number: CN101507742B
Application number: CN2009100969688A
Authority: CN
Inventors: 袁珂
Original assignee: Zhejiang Forestry College
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2029-03-26
Also published as: CN101507742A

Abstract

一种羽芒菊总黄酮的制备方法及其用途，属于黄酮提取制备方法技术领域。以羽芒菊粗粉为原料，用含水乙醇做溶剂进行超声提取，滤液减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液后用活性炭进行超声脱色，除去活性炭后继续进行减压浓缩，浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，用含水乙醇进行梯度洗脱，合并一定比例的含水乙醇洗脱液真空浓缩干燥，即得羽芒菊总黄酮提取物干粉。该制备方法工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，提取物收率高。

Description

一种羽芒菊总黄酮的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于黄酮提取制备方法技术领域，具体为一种羽芒菊总黄酮的制备方法及其用途。

背景技术

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要的生物活性物质，往往具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用，具有很好的开发应用价值。

羽芒菊(Tridaxprocumbens.L)为菊科长柄菊属多年生草本植物。原产于美洲热带地区，后传播于印度、中南半岛及印度尼西亚等国。我国引入海南、广东及台湾等地。甘微，苦寒。羽芒菊全草具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎等方面的作用。关于羽芒菊总黄酮的制备方法及其用途，经文献检索，尚未见研究报道。

近年来从中草药中提取总黄酮的方法多采用水提或有机溶剂提取(包括渗漉提取或回流提取)、有机溶剂萃取、再结合大孔树脂分离富集的方法。其中提取用溶剂多采用一定比例的含水乙醇，再通过乙酸乙酯或正丁醇萃取。采用这些方法往往存在溶剂用量大、提取时间长、操作麻烦、工作效率较低等缺点，分离富集黄酮类成分多采用大孔树脂柱色谱，选用不同性能规格的树脂填料，以不同比例的含水有机溶剂进行梯度洗脱的方法。采用这些方法同样存在操作步骤及洗脱步骤较多，有机溶剂用量大，收率底，生产成本较高的缺点，尤其是提取纯化过程中的加热浓缩环节较多，容易造成有效成分破坏或流失，总黄酮的提取率及转移率不高，且常要用到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇等有害溶剂，对环境造成污染，同时黄酮提取物中常含有一些重金属杂质，且往往超标。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种羽芒菊总黄酮的制备方法的技术方案，其工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，提取物收率高。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)原料处理：将羽芒菊全草粉碎成粗粉，过20～60目筛；

2)提取：将羽芒菊粗粉放入提取容器中，并将其置入超声波提取器中，在40～60℃的条件下每次用6～10倍量50％～70％的含水乙醇做溶剂超声提取2-3次，每次30～60min，抽滤，合并滤液；

3)减压浓缩：将步骤2)的滤液在水浴温度50℃以下真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到浓缩液；

4)脱色及脱脂处理：将步骤3)的浓缩液用粉末状活性炭在50℃以下超声30～50min，抽滤，除去活性炭，滤液备用；

5)减压浓缩：步骤4)的滤液继续在50℃以下，真空度为0.095Mpa的条件下真空薄膜浓缩，得到浓缩液；

6)大孔树脂纯化：将步骤5)的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，再依次用10～70％的含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，洗脱流速为5～15mL·min^-1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并25～60％含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50℃以下真空浓缩、干燥，即得羽芒菊总黄酮提取物干粉。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤2)中：超声提取的温度为45～55℃，优选50～55℃；超声提取时间45～55min，优选50～55min；含水乙醇的用量为羽芒菊粗粉重量的8～10倍，含水乙醇的浓度为55％～65％，优选60％～65％。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中：超声脱色及脱脂处理的时间为35～45min，优选40～45min。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中：粉末状活性炭的用量为羽芒菊粗粉重量的1-3％，优选2-3％。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤6)中：依次用10％含水乙醇、25％、40％、60％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤6)中：洗脱流速为6～12mL·min^-1，优选8～10mL·min^-1。

所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤6)中：所述的大孔吸附树脂为DiaionHP-20大孔吸附树脂，色谱柱的径高比为1∶10～15，优选1∶12～13。

所述方法制得的羽芒菊总黄酮，其特征在于其所具有的在制备抗氧化及抗肿瘤药物中的应用。

上述一种羽芒菊总黄酮的制备方法，利用活性炭脱色脱脂、含水溶剂超声提取和大孔树脂吸附法，得到了纯度较高的羽芒菊总黄酮，其工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，提取物收率高。采用紫外分光光度法测定所得到的总黄酮提取物，提取物中总黄酮的含量为42.60％左右，总黄酮的提取率为8.56％左右，总黄酮的转移率高达76.56％左右。通过微波消解-原子吸收光谱法测定总黄酮提取物中重金属的含量，结果采用该发明方法制备的羽芒菊总黄酮中重金属含量很低，完全符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。经初步活性试验表明，羽芒菊总黄酮具有一定的抗氧化及抗肿瘤活性，具有很好的开发应用价值。

本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的百分含量为重量比。

附图说明

图1为本发明提取制备的羽芒菊总黄酮与各对照品的TLC色谱图。

具体实施方式

现结合本发明的实施例和活性测定试验，对本发明作进一步说明。

实施例1

1)原料处理：将羽芒菊全草粉碎成粗粉，过40目筛；

2)提取：将羽芒菊粗粉放入提取容器中，并将其置入超声波提取器中，在50℃的条件下每次用8倍量60％的含水乙醇做溶剂超声提取2次，每次45min，抽滤，合并滤液；

4)脱色及脱脂处理：将步骤3)的浓缩液用粉末状活性炭在50℃以下超声40min，粉末状活性炭的用量为羽芒菊粗粉重量的2％，抽滤，除去活性炭，滤液备用；

6)大孔树脂纯化：将步骤5)的浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1∶10，先用H₂O洗脱，再依次用10％、25％、40％、60％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70％丙酮洗脱，洗脱流速为10mL·min^-1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并25-60％含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50℃以下真空浓缩、干燥，即得羽芒菊总黄酮提取物干粉。用H₂O及10％的含水乙醇洗脱除掉水溶性杂质，最后都用70％丙酮洗脱除掉全部杂质，再生大孔吸附树脂。

实施例2

上述步骤1)中：羽芒菊全草粉碎成粗粉，过20目筛；上述步骤2)中：超声提取的温度为40℃，超声提取时间60min，含水乙醇的用量为羽芒菊粗粉重量的10倍，含水乙醇的浓度为70％；步骤4)中：超声脱色及脱脂处理的时间为50min，粉末状活性炭的用量为羽芒菊粗粉重量的3％；步骤6)中：依次用20％、30％、35％、55％、65％的含水乙醇进行梯度洗脱；洗脱流速为15mL·min^-1；色谱柱的径高比为1∶15；合并30-55％含水乙醇各部位的洗脱液；其它步骤同实施例1。

实施例3

在上述步骤2)中：超声提取的温度为60℃；超声提取时间30min；含水乙醇的浓度为50％；步骤4)中：超声脱色及脱脂处理的时间为30min；粉末状活性炭的用量为羽芒菊粗粉重量的1％；步骤6)中：依次用15％、25％、45％、50％、60％的含水乙醇进行梯度洗脱；洗脱流速为5mL·min^-1；合并25-60％含水乙醇各部位的洗脱液；其它步骤同实施例1。

上述步骤2)中：超声提取的温度为45℃、48℃、55℃；超声提取时间为35min、45min、55min；含水乙醇的浓度为55％、65％。步骤4)中：超声脱色及脱脂处理的时间为32min、35min、45min。步骤6)中：洗脱流速为6mL·min^-1、12mL·min^-1、8mL·min^-1。其它步骤与实施例1相同，均能取得相同的技术效果。

上述步骤2)中羽芒菊粗粉每次用6～8倍量的含水乙醇做溶剂的意思是：若羽芒菊粗粉为1kg，则溶剂用量为6～8升。

采用紫外分光光度法测定所得到的总黄酮提取物，提取物中总黄酮的含量为42.60％左右，总黄酮的提取率为8.56％，总黄酮的转移率高达76.56％左右。通过微波消解-原子吸收光谱法测定总黄酮提取物中重金属的含量，结果采用该发明方法制备的羽芒菊总黄酮中重金属含量很低，完全符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。经初步活性试验表明，羽芒菊总黄酮具有一定的抗氧化及抗肿瘤活性，因此具有很好的开发应用价值。

羽芒菊总黄酮外观为浅黄色无定型粉末，将其少量用含水乙醇溶解后进行化学试管反应表明，遇三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色，Molish反应显阳性，表明总黄酮中含有黄酮或黄酮苷。

以下通过相应的试验对通过本发明制备的总黄酮提取物进行含量测定，并对制备的总黄酮提取物进行重金属元素的含量测定。

一、提取物中总黄酮的含量测定：

测定条件：UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)；芦丁对照品(中国药品生物制品检定所提供)，芦丁的最大吸收波长：510nm。

标准曲线的绘制：准确称取干燥恒重的芦丁对照品12.8mg，加60％乙醇溶解并定容置100mL的量瓶中，摇匀得浓度为0.128mg·mL^-1的对照品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml于6只10mL量瓶中，用60％乙醇补充至5mL，各加入0.3mL 5％亚硝酸钠，摇匀，放置5min后再各加入10％硝酸铝0.3mL，摇匀。5min后再加入1mol·L^-1的氢氧化钠溶液4mL，混匀，用60％乙醇稀释至刻度。10min后于510nm处测吸光度，试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得芦丁含量与吸光度之间的回归方程：A＝8.968750C+0.020800，γ＝0.9997。

样品的含量测定：精密称定干燥的羽芒菊提取物干粉适量，用60％乙醇溶解并定容至25mL量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10mL量瓶中，添加60％乙醇溶液使体积约为5mL，按照上述绘制芦丁标准曲线的方法，依次加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠溶液，混匀，用60％乙醇稀释至刻度。静置20min后测定吸光度。重复3次测定，并根据标准曲线换算出样品中总黄酮的含量，计算出羽芒菊提取物中总黄酮的平均含量为42.60％左右，总黄酮的提取率为8.56％左右，总黄酮的转移率高达76.56％左右。

二、总黄酮提取物中重金属元素的含量测定：

测定条件及标准溶液：采用微波消解-原子吸收光谱法测定羽芒菊总黄酮提取物中重金属元素的含量。仪器：Spectr AA 220型火焰原子吸收分光光度计(FAAS)，SpectrAA 220Z型石墨炉原子吸收分光光度计(GFAAS)(美国Varian公司)，PE3030型氢化物原子吸收分光光度计(美国PE公司)，附国产空心阴极灯(威格拉斯北京仪器有限公司)。MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司)，附RTP-300Plus温控。各元素标准溶液均由浓度为1000μg·mL^-1的国家标准溶液(国家标准物质研究中心)稀释得到。HNO₃、HClO₄为优级纯，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

仪器工作条件：FAAS法空气流速为6.0/(L·min^-1)，乙炔流速为1.5/(L·min^-1)；GFAAS：载气流速为3.0/(L·min^-1)，交流横向塞曼背景校正。仪器工作条件见表1。

表1仪器工作条件

样品的微波消解：取各种样品，预先置于红外灯下干燥至恒重。精密称取样品粉末各1g，置于聚四氟乙烯微波消解罐的内罐中，各加入HNO₃-HClO₄(5∶1)混合液10mL，轻微振荡静置20min，加H₂O 6mL后摇匀，放入微波消解仪中，按表2中的微波消解程序进行消解。消解完毕后冷却至室温，取出内罐将消解液转移并定容到100mL容量瓶中，同时备一份空白溶液做对照。

表2微波消解程序

样品测定结果：采用原子吸收分光光度法，其中Cr、Cu采用FAAS法测定，Pb、Cd采用GFAAS法测定，而As采用氢化物AAS法测定。测定结果表明，羽芒菊总黄酮提取物中，重金属微量元素Cu的含量为18.27μg·g^-1，Cr的含量为0.88μg·g^-1，Cd的含量为0.15μg·g^-1，Pb的含量为1.68μg·g^-1，As的含量为0.26μg·g^-1。

铜、铬、镉、铅、砷属重金属及砷盐，为有害元素，被人体吸收后可引起蓄积性中毒。铜虽为人体必需元素，但过量也有害。这些重金属及砷盐的限量指标主要依据《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》来评价。参照此标准，即Cu≤20.0μg·g^-1，Cd≤0.3μg·g^-1，Pb≤5.0μg·g^-1，As≤2.0μh·g^-1，此标准中没有铬的标准，因此参照绿色食品标准(Cr≤1.0μg·g^-1)。上述试验测定结果表明，羽芒菊总黄酮提取物中的重金属含量低微，完全符合药用植物及其制剂进出口绿色行业标准及绿色食品标准。

图1为本发明实施例1～3中提取制备出的羽芒菊总黄酮与各对照品的TLC色谱图；薄层板为0.3％CMC-Na-硅胶GF₂₅₄板，展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水(7∶2∶2)，显色剂：(1)5％茴香醛-硫酸溶液喷洒，105℃烘烤3～6分钟；(2)紫外灯(254nm)下观察荧光；(3)2％FeCl₃-2％K₃Fe(CN)₆喷洒，105℃烘烤2～5分钟。

TLC色谱图中：1为8，3′二羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮，2为实施例1的总黄酮，3为8，3′二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-β-D-葡萄糖黄酮苷，4为实施例2的总黄酮，5为8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷，6为实施例3的总黄酮。

为进一步说明羽芒菊总黄酮在医药领域中的作用，下面通过部分活性试验结果来说明。

1、抗氧化试验结果：

目前用于评价植物抗氧化能力的方法有硫氰酸盐(thiocyanate)法、硫代巴比妥酸(TBA)法等。但这些方法手续繁琐费时，所用试剂或仪器的费用较高，1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)是一种稳定的有机自由基，通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。近年来，国内外已有人初步利用DPPH溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定，并被证明是一种灵敏、简单易行的有效方法。本试验采用DPPH分光光度法用以评价羽芒菊总黄酮提取物的抗氧化能力。

(1)实验条件：测定温度为37℃；震动：30s震动方向水平；DPPH溶液的配制：将DPPH溶于无水乙醇配制成浓度为0.15m mol·L^-1的溶液；Tecan Infinite M200酶标仪(瑞士)；酶标板：96孔板。

(2)供试品溶液的配制：取羽芒菊总黄酮提取物干粉25mg，用无水乙醇溶解并定容于25mL量瓶中。然后分别用无水乙醇稀释定容于量瓶中，配制成浓度分别为200μ·mL^-1、100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、12.5μg·mL^-1的供试品溶液。

(3)测定结果：用点样用移液枪等体积加入DPPH的乙醇溶液，不同浓度供试品溶液，不同浓度供试品溶液与DPPH溶液的混合液分别点样，分别平行点样三次，反应30min。用Infinite M 200酶标仪测定吸光度，测定波长为517nm，测定结果见表3。

表3清除率试验结果

供试品溶液浓度(μg·mL^-1)	12.5	25	50	100	200
						清除率(％)	32.89	74.47	78.34	86.54	88.12

表中数据显示，羽芒菊总黄酮对DPPH的清除率较高，表明羽芒菊中的总黄酮具有一定的抗氧化活性，且在配制浓度范围内随浓度升高抗氧化能力增强。

2、抗肿瘤试验结果

本试验通过细胞毒性试验(CCK-8试剂)研究羽芒菊总黄酮提取物对人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的增殖抑制率，以判断羽芒菊总黄酮提取物的抗肿瘤活性大小。

(1)实验条件：试验用试药：Cell counting kit/CCK-8试剂盒，培养基，胎牛血清，青霉素和链霉素，胰蛋白酶，实验用肿瘤细胞；Tecan Infinite M200酶标仪(瑞士)；酶标板：96孔板。

(2)样品溶液的配制：精密称取一定量羽芒菊总黄酮提取物干粉，用DMSO溶解后用无菌水稀释，使DMSO的含量为5％。将原溶液用含5％DMSO的无菌水稀释成6个浓度梯度。

(3)肿瘤细胞的培养：试验选用的人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞用RPMI-1640培养基+10％胎牛血清常规传代培养。

(4)抑制率测定：将2种肿瘤细胞胰蛋白酶消化后接种在96孔板上。37℃、5％CO₂温箱培养12h后更换新的培基，并加入样品溶液，使样品的最后浓度为：10.36、20.72、41.44、75.00、150.0、300.0μmol·L^-1。温箱继续培养48h。吸出培基，每孔加入一定量含有10％CCK-8的培基，温箱继续培养6h，然后在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔(培养基、0.5％DMSO生理盐水)，对照孔(细胞、培养基、0.5％DMSO生理盐水)。测定样品在不同浓度下对2种肿瘤细胞的增殖抑制率，试验结果见表4。

表4不同浓度的总黄酮提取物对肿瘤细胞的增殖抑制率试验结果

样品浓度(μmol·L^-1)	10.36	20.72	41.44	75.00	150.0	300.0
							对人乳腺癌细胞的增殖抑制率(％)	10.12	21.23	36.15	65.36	86.26	87.35

对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制率(％)

8.45

16.87

28.34

61.67

90..56

91.08

由表4可以看出，总黄酮提取物对人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的增殖均具有一定的抑制作用，抑制强度随化合物浓度的增大而增强，且这种增长趋势随浓度的不断增加趋于平缓。

经初步活性试验表明，羽芒菊总黄酮具有一定的抗氧化及抗肿瘤活性，具有很好的开发应用价值。

Claims

1.一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)原料处理：将羽芒菊全草粉碎成粗粉，过20～60目筛；

2.如权利要求1所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤2)中：超声提取的温度为45～55℃，超声提取时间45～55min，含水乙醇的用量为羽芒菊粗粉重量的8～10倍，含水乙醇的浓度为55％～65％。

3.如权利要求1所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中：超声脱色及脱脂处理的时间为35～45min。

4.如权利要求1所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中：粉末状活性炭的用量为羽芒菊粗粉重量的1-3％。

5.如权利要求1所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤6)中：依次用10％含水乙醇、25％、40％、60％、70％的含水乙醇进行梯度洗脱。

6.如权利要求1所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤6)中：洗脱流速为6～12mL·min^-1。

7.如权利要求1所述的一种羽芒菊总黄酮的制备方法，其特征在于步骤6)中：色谱柱的径高比为1∶10～15。

8.如权利要求1所述方法制得的羽芒菊总黄酮在制备抗氧化及抗肿瘤药物中的应用。