CN102151293B

CN102151293B - 一种植物提取物的制备方法和用途

Info

Publication number: CN102151293B
Application number: CN2011100801472A
Authority: CN
Inventors: 袁珂; 姜东青; 徐殿宏; 黄雅思
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2031-03-31
Also published as: CN102151293A

Abstract

一种植物提取物的制备方法和用途，属于植物技术领域。包括以下步骤：将少花斑鸠菊原料经粉碎过筛后，采用渗漉提取、真空薄膜浓缩、大孔树脂吸附富集等方法制得少花斑鸠菊提取物。所得的少花斑鸠菊提取物中含有18.6％～31.8％的总酚酸，8.8％～16.9％的总皂苷，3.4％～10.5％的绿原酸以及有益微量元素和必需氨基酸，同时所含的重金属均不超标。该提取物具有很强的抗氧化作用，同时还具有一定的抗肿瘤作用，可用作食品抗氧剂、食品添加剂及药物原料等，该提取物的制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低。

Description

一种植物提取物的制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物技术领域，具体为一种植物提取物的制备方法和用途。

背景技术

植物多酚类化合物是一类广泛存在于天然植物、水果蔬菜等中的次生代谢产物，是一类天然的强还原性物质，在抗氧化和自由基清除方面具有比常用抗氧化剂更强的作用，植物酚酸类还具有多方面的生物活性，尤其在预防心脑血管、癌症以及抗衰老方面发挥着十分重要的作用。

近年来，三萜皂苷类成分的生物活性的多样性和重要性方面备受人们重视，成为中药化学研究的一个热点领域，大量的实验研究表明，三萜及其皂苷类成分具有抗癌、抗菌、抗病毒，降低胆固醇、免疫调节等活性，是具有开发应用前景的一大类化合物。

少花斑鸠菊为菊科斑鸠菊属植物(Vernonia chun ii Chang in Sunyatsenia )，该属植物全世界约35种，我国有30种，主要分布于南部及东南部。该属植物药用价值较高，民间用于治疗感冒咳嗽、风湿痹痛、活血止血和咽喉炎等。我们曾对少花斑鸠菊进行过系统化学成分研究，从中分离鉴定出大量三萜酸类、咖啡酰基奎宁酸类等单体化合物，并通过实验证明具有很好的生物活性，由此显示出了很好的开发应用价值。但经文献检索，还未见有对少花斑鸠菊总酚酸及总皂苷进行提取纯化，获得含有大量总酚酸、总皂苷及微量元素及氨基酸等多种活性成分的少花斑鸠菊提取物的研究报道。　

近年来从中草药中提取酚酸类及皂苷类等较大极性成分的方法多采用一定比例的含水甲醇或含水丙酮进行超声提取、回流提取及冷浸提取来实现，这些提取方法往往具有溶剂用量较大、提取时间较长、操作工序麻烦、工作效率较低等缺点。而分离富集总酚酸及总皂苷类成分多采用提取液浓缩后用正丁醇反复萃取、再结合大孔树脂柱色谱富集纯化。以上操作存在操作步骤及洗脱步骤多，有机溶剂用量大，有效部位的收率较低，生产成本较高等缺点，尤其制备过程中需要对提取液、萃取液或洗脱液进行浓缩，由于加热浓缩环节较多，容易造成有效成分破坏或流失，致使所得提取物的提取率及有效成分的转移率不高，且常要用到高沸点的正丁醇及甲醇等有害溶剂，对环境造成污染，同时提取物中常存在重金属含量超标现象。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种植物提取物的制备方法和用途的技术方案，该提取物的制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，其提取物收率及功效成分的含量高。

所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）原料处理：将干燥的少花斑鸠菊粉碎成粗粉，过40～60目筛；

2）提取：将药材装入渗漉筒中，用30%～70％的含水乙醇浸泡3～6 小时后，用30%～70％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若药材重量为1kg则含水乙醇的用量为10～16升，按流速为10～20 mL· min^-1的速度收集渗漉液；

3）减压浓缩：将渗漉液在水浴温度50℃～80℃，真空度为0.090 Mpa～0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为150～350 mL·min^-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到含2mL浓缩液/每g药材粗粉；

4）大孔树脂纯化：将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，再依次用10%～80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为10～25 mL·min^-1，分别收集3～4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%～70%含水乙醇各部位的洗脱液，

5）减压浓缩及干燥：将合并的洗脱液在50℃～80℃，真空度为0.090 Mpa ～0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为150～350 mL·min^-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60～100目分样筛，即得少花斑鸠菊提取物干粉。

所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2）中：浸泡时间为4～5小时，含水乙醇的浓度为40%～60％，流速为15～18 mL· min^-1。

所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3）中：水浴温度为60℃～70℃，真空度为0.093 Mpa，进液流速为200～300mL·min^-1。

所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为15～20 mL·min^-1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液。

所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、65%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇和65%含水乙醇各部位的洗脱液。

所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5）中：减压浓缩温度为60℃～70℃，真空度为0.093 Mpa，进液流速为200～300 mL·min^-1。

所述的一种植物提取物在制备防治肿瘤制剂中的应用。

所述的大孔吸附树脂为Dianon HP-20大孔吸附树脂。

上述一种植物提取物的制备方法，具有以下有益效果：

1）本发明对少花斑鸠菊采用含水乙醇进行渗漉法提取、真空薄膜闪蒸浓缩，结合大孔树脂吸附来分离富集多酚类及皂苷类活性成分。得到了含有大量总酚酸及总皂苷等活性成分的少花斑鸠菊提取物。该提取方法具有溶剂用量较少、提取效率高，不加热，有利于热敏性成分不受破坏的特点，采用的浓缩技术具有浓缩液受热时间极短、浓缩速度快、效率高，操作简单、使用方便、节能环保等优点。

2）采用该方法能最大限度地将功效成分提取富集完全，得到了含有总酚酸及总皂苷等活性成分的少花斑鸠菊提取物。经测定该提取物干粉的收率达到15.4%～26.5%。经含量测定，提取物中总酚酸的含量达到18.6 ％～31.8％，总皂苷的含量达到8.8％～16.9％，绿原酸的含量达到3.4％～10.5％。除此之外，还含有对人体有益的微量元素及氨基酸。

3）本发明提供的少花斑鸠菊提取物制备工艺简单、操作方便、溶剂用量小，无环境污染，生产成本较低，其提取物收率及功效成分的含量高。

4）通过微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定少花斑鸠菊提取物中重金属的含量，发现采用该方法制备的少花斑鸠菊提取物中重金属含量很低，符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。

5）经初步的体外抗氧化及抗肿瘤活性试验表明，少花斑鸠菊提取物具有一定的抗氧化及抗肿瘤作用，可用作食品抗氧剂及食品添加剂，也可用作药物原料，因此具有很好的应用前景。

本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的百分含量为重量比。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

1）原料处理：将干燥的少花斑鸠菊粉碎成粗粉，过40目筛；

2）提取：将药材装入渗漉筒中，用70％的含水乙醇浸泡4小时后，用70％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，按照材重量为1kg则含水乙醇的用量为12升，按流速为15 mL · min^-1的速度收集渗漉液；

3）减压浓缩：将渗漉液在水浴温度70℃，真空度为0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为250 mL · min^-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到含2mL浓缩液/每g药材粗粉；

4）大孔树脂纯化：将得到的浓缩液通过Dianon HP-20大孔吸附树脂分离富集，先用H₂O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为20 mL · min^-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、60%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液，

5）减压浓缩及干燥：将合并的洗脱液在70℃，真空度为0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为260 mL · min^-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过100目分样筛，即得少花斑鸠菊提取物干粉。

在本发明所述的工艺方法中：

步骤1）中将少花斑鸠菊粗粉过60目筛；

步骤2）中浸泡时间为3小时、5小时或6小时，含水乙醇浓度为30％、40％、50％或60％，若药材重量为1kg则含水乙醇的用量为10升、13升、15升或16升，流速为10 mL· min^-1、12 mL· min^-1、18 mL· min^-1或20 mL· min^-1；

步骤3）中水浴温度50℃、55℃、60℃、65℃、75℃或80℃，真空度为0.090 Mpa，进液流速为150 mL·min^-1、180 mL·min^-1、200 mL·min^-1、300 mL·min^-1或350 mL·min^-1；得到含2mL浓缩液/每g药材粗粉；

步骤4）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水乙醇、15%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、65%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇和65%含水乙醇各部位的洗脱液；洗脱流速为10 mL· min^-1、15 mL· min^-1、18 mL· min^-1、22 mL· min^-1或25 mL· min^-1；

步骤5）中：减压浓缩温度为50℃、60℃、80℃，真空度为0.093 Mpa，进液流速为150 mL·min^-1、200 mL·min^-1、250 mL·min^-1、300 mL·min^-1或350 mL·min^-1；

其它同实施例1，也能取得本发明所述的有益效果。

以下通过相应的试验对通过本发明制备的提取物进行总酚酸、总皂苷、绿原酸、微量元素及重金属、氨基酸的含量测定。

1）总酚酸的含量测定

测定条件：UV-2102PCS 紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；没食子酸对照品（110831-200302，中国药品生物制品检定所提供），没食子酸的最大吸收波长：765 nm。

标准曲线的绘制：准确称取干燥恒重的没食子酸对照品12.36 mg，用蒸馏水溶解并定容于100 mL量瓶中，制成浓度为0.1236 mg · mL^-1的对照品溶液。分别吸取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL(相当于含没食子酸分别为0、0.1236、0.2470、0.370、0.494、0.6180、0.741 mg) 置于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na₂CO₃溶液定容至10 mL，放置暗处2 h，于765 nm处测定吸光度，试剂为空白参比。以没食子酸质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得没食子酸的回归方程Y=0.032X+0.1234, R²=0.9984。

样品的含量测定：精密称定干燥的少花斑鸠菊提取物干粉（实施例1）适量，用蒸馏水溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL 容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na₂CO₃溶液定容至10 mL，静置20 min后于765 nm处测定吸光值。重复3次测定，根据回归方程换算出样品中总酚酸的含量，计算出少花斑鸠菊提取物中总酚酸的平均含量为18.6 ％～31.8％。

2）总皂苷的含量测定

测定条件：UV-2102PCS 紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；人参皂苷Re对照品（110754-200822, 中国药品生物制品检定所提供），人参皂苷Re的最大吸收波长：560 nm。

标准曲线的绘制：精密吸取60℃减压干燥至恒重人参皂苷Re对照品10.36 mg，置10 ml 容量瓶中，加适量甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.036 mg · mL^-1的对照品溶液。精密吸取对照品溶液40、80、120、160、200 μL分别加入5支干燥具塞试管中，置水浴上挥干溶剂。精密加入新配制的5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL 、高氯酸0.8 mL，于60 ℃恒温水浴中加热15 min ，取出，流水冷却2 min。加冰醋酸5 mL ，摇匀。甲醇溶液随行空白对照。按照分光光度法试验，在560 nm 处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，人参皂苷Re 的质量浓度X为横坐标绘制标准曲线，得人参皂苷Re的线性方程Y =23.456X-1.3489, r = 0.9993。表明人参皂苷Re 进样量在41～207 μg 范围内线性关系良好。

供试品溶液的制备：精密称取干燥的少花斑鸠菊提取物干粉（实施例1）适量，用甲醇溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液置水浴上蒸发甲醇，残渣用5 mL水溶解，用石油醚萃取2 次，每次20 mL，合并石油醚层。用少量水洗石油醚层，水层及洗液合并，在水浴上蒸至近2 mL ,转移到已处理好的Diaion HP-20大孔吸附树脂柱上，加水15 mL洗脱多糖等杂质。弃去洗脱液，再用70 %乙醇20 mL洗脱总皂苷，洗脱液置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5 mL，滤过，弃去初滤液，精密吸取滤液1 mL置具塞试管中，在水浴上蒸去甲醇即得。

样品的含量测定：依上法制备的供试品溶液, 加入新配制的5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL 、高氯酸0.8 mL，于60 ℃恒温水浴中加热15 min ，取出，流水冷却2 min。加冰醋酸5 mL ，摇匀。同标准曲线项下操作。根据回归方程换算出样品中人参总皂苷的含量，计算公式：X=A×100÷(M×V/2×1/5)。式中，X为样品中参总皂苷的含量（以Re计）（g/100g），A为从标准曲线上读得被测样品液中参总皂苷的含量（μg），V为被测样品溶液的体积（ml），M为样品的取样量。由公式计算求得少花斑鸠菊提取物中人参总皂苷的含量为8.8％～16.9％。

3）微量元素及重金属的含量测定

仪器与测定条件：采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定少花斑鸠菊提取物中微量元素及重金属元素的含量。X-Series型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)；MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司)，附RTP-300 Plus温控；Milli-Q Academic超纯水处理器(美国Millipore公司)。硝酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表1。

表1 ICP-MS工测定条件及工作参数

工作参数	设定值	工作参数	设定值
				正向功率/(W)	1200	采样深度	130
扫描模式	跳峰	冷却气流量/( L· min^-1)	13.02
				扫描次数	100	辅助气流量/( L· min^-1)	0.70
驻留时间/(μs)	10000	雾化气流量/( L· min^-1)	0.84
				采样时间/(s)	49	进样时间/(s)	45
样品提升率/(mL·min^-1)	1.0	清洗时间/(s)	60

样品的预处理及微波消解：精密称取少花斑鸠菊提取物粉末（实施例1）0.1 g ( 称准至0.0001 g) ，置于聚四氟乙烯微波消解罐的内罐中，加入5 mL浓硝酸，轻微振荡静置0.5 h，放入微波消解仪中，按微波消解程序进行消解，消解完毕后冷却至室温，取出内罐将消解液转移并定容到50 mL容量瓶中，同时备一份空白溶液做对照，见表2。

表2 微波消解程序

消解程序	功率/W	升温时间/min	控制压力/kPa	温度/℃	持续时间/min
						1	1200	5	340	120	2
2	1200	3	689	150	3
						3	1200	3	1000	180	6

标准溶液的配制及线性范围：铁、锰、锌、铜、铬、砷、镉、铅标准贮备溶液(美国SPEX CertiPrep Inc.)，浓度为10 mg · L^-1，分别储存于聚乙烯塑料瓶中，然后根据测定的需要配成适当浓度的混合标准溶液（含1％硝酸）。

用逐步稀释法从标准储备液中移出一定量的标准溶液，用高纯水稀释配制成标准溶液，铁、锰、锌、铜、铬、砷、镉、铅、铜元素的标准系列浓度均为2.0、5.0、10.0、20.0 μg · L^-1，标准溶液中含1％HNO₃。分别加入内标溶液，在选定的优化条件下，采用ICP-MS进行测定，标准溶液进入ICP-MS后，仪器给出了各元素的工作曲线及线性关系。8种元素的线性回归方程、线性相关系数、线性范围及检出限如下表3。

表3 线性方程和相关系数

元素	线性回归方程	线性相关系数	线性范围(μg · L^-1)	检出限(μg · L^-1)
					Fe	Y=1.06×10² X+1.07×10³	0.999 3	0～1000	1.05×10^-3
Mn	Y=5.85×10³X+5.45×10²	0.999 8	0～1000	3.47×10^-2
					Zn	Y=6.30×10² X+6.26×10²	0.999 4	0～1000	2.36×10^-4
Cr	Y=3.53×10² X+1.21×10³	0.999 8	0～1000	0.20
					As	Y=4.57×10² X+9.57×10^-1	0.999 7	0～1000	5.65×10-2
Cd	Y=9.48×10² X+4.11	0.999 8	0～1000	5.13×10-3
					Pb	Y=1.02×10⁴ X+9.80×10²	0.999 8	0～1000	1.57×10-2
Cu	Y=6.54×10² X+2.57×10²	0.999 6	0～1000	7.53×10^-2

样品测定结果：仪器点火，泵入高纯水，检测各元素的空白计数，然后泵入2 μg · L^-1的混合标准溶液，检测仪器的灵敏度。上述各步正常且仪器稳定后，即可按照仪器的工作参数开始测定。将消解好的样品溶液依次吸入ICP-MS仪，测定溶液中的各元素含量，同时测定样品空白以及标准溶液，结果样品(实施例1) 中Fe的含量为325.6 μg · g^-1；Mn的含量为194.25 μg · g^-1；Zn的含量为43.82 μg · g^-1；Cu的含量为15.76 1μg · g^-1；Cr的含量为0.78 μg · g^-1；As的含量为0.096 μg · g^-1； Cd的含量为0.194 μg · g^-1；Pb的含量为1.26 μg · g^-1。

以上数据表明，少花斑鸠菊提取物中含有较多对人体有益的微量元素铁、锰、锌，铜，而对人体有害的重金属铬、镉、铅、砷的含量极低，均符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。

4）氨基酸的含量测定

测定仪器及工作条件：Agilent 1100高效液相色谱仪，包括四元梯度泵，自动进样器，柱温箱和紫外检测器，Agilent色谱工作站，（美国Agilent公司）。色谱条件：HP Hypersil ODS色谱柱（4.6 mm×125 mm，5 μm）。采用梯度洗脱，流动相A：20 mmol醋酸钠溶液，流动相B：20 mmol醋酸钠溶液:甲醇:乙腈(1:2:2)(v/v)，洗脱程序（0 min：8 %B；17 min：50%B；20 min：100%B；24 min：0%B）。检测波长338 nm，62 nm (Pro)，流速1.0 mL · min^-1；柱温40℃。

标准溶液的配制：各元素标准溶液均由浓度为1000 μg · mL^-1的国家标准溶液(国家标准物质研究中心) 稀释得到，各种氨基酸标准品均为生化试剂。HNO₃、HCl为优级纯，乙睛和甲醇为色谱纯,实验用水为超纯水，衍生试剂及其他试剂均为分析纯。

样品中氨基酸的含量测定：精密称取样品粉末（实施例1）约10 mg，置水解装置中，加6 mo l · L^-1的HCl溶液10 mL，于105℃烘箱中水解24 h。真空抽去多余的氯化氢气体，0.45 μm微膜过滤。以邻苯二甲醛(OPA)柱前自动衍生化后，采用高效液相色谱仪测定。少花斑鸠菊中17种氨基酸的含量测定结果如下表4。

表4 少花斑鸠菊中氨基酸的含量测定结果

氨基酸	含量(%)	氨基酸	含量(%)
				天冬氨酸Asp	0.4123	丙氨酸Ala	0.2256
谷氨酸Glu	0.4651	缬氨酸Val*	0.2423
				丝氨酸Ser	0.2215	蛋氨酸Met*	0.0054
组氨酸His	0.1156	苯丙氨酸Phe*	0.1934
				甘氨酸Gly	0.1867	异亮氨酸Lso*	0.2234
苏氨酸Thr	0.1921	亮氨酸Leu*	0.3125
				精氨酸Arg	0.1721	赖氨酸Lys*	0.2086
酪氨酸Tyr	0.0903	脯氨酸Pro	0.2244
				半胱氨酸Cys	0.0031

注：*人体必需氨基酸

实验结果表明，少花斑鸠菊提取物中含有丰富的人体必需氨基酸，具有一定的营养保健价值，

5）抗氧化活性实验

DPPH是一种稳定的有机自由基, 通过检测生物试剂对DPPH 自由基的清除能力可以体现其抗氧化性的强弱。近年来利用DPPH 溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定，并被证明是一种灵敏、简单易行的有效方法。本试验采用DPPH分光光度法用以评价少花斑鸠菊提取物的抗氧化能力。

DPPH·在溶液中可生成具有典型紫色的稳定溶液，并在517nm 处有强烈吸收。当它与自由基清除剂作用时，由于清除剂与DPPH孤对电子配对而使其在517nm处的吸光度减小，使溶液的典型紫色变浅，其吸光度的变化与其所接受的电子成定量关系。即吸光度越小，自由基清除剂清除自由基的能力越强，因而可用分光光度法进行定量分析。

实验条件：Tecan Infinite M200酶标仪（瑞士）；UV-2102 PCS紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；101-3电热鼓风恒温干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；R201B旋转蒸发仪（上海申胜生物科技有限公司）。1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）购自sigma公司，酶标板： 96微孔板，其他试剂均为分析纯。

DPPH溶液的配制：准确称取DPPH试剂6.3 mg，用95%乙醇溶解，并定量转入10 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，摇匀得质量浓度为0.63 mg· mL^-1 的DPPH 贮备液，置于冰箱中冷藏备用。在使用前，采用95 %的乙醇将DPPH贮备液稀释成质量浓度为63 μg · mL^-1的稀释液。

供试品溶液的制备：分别精确称取通过本发明方法得到的少花斑鸠菊提取物干粉（实施例1）64 mg，用95%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中。然后分别取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL用95%乙醇定容于10 mL量瓶中，配置成浓度为0.064 mg · mL^-1, 0.128 mg · mL^-1，0.192 mg · mL^-1，0.256 mg · mL^-1，0. 320 mg · mL^-1的供试品溶液，将得到的供试品溶液置于4℃冰箱中保存待用。

测定方法与结果：用点样用移液枪在96孔酶标板中分别加入不同浓度的供试品溶液200 μL和DPPH试液100 μL。样品加入后震荡30s， 23℃保温20 min后，用Infinite M 200酶标仪在517 nm波长下测定其吸光值(Ap)，同时测定不加DPPH的样品空白吸光值 (Ac) 和加DPPH但不加样品的吸光值(Amax)。样品测定过程中用Trolox作阳性对照，并以此换算出被测样品总的抗氧化能力，测定结果表示为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox浓度。称该方法为TEAC(Trolox)法。TEAC值表示的是Trolox的浓度，Trolox浓度越大，表明清除自由基能力越强。以Trolox (X)浓度为横坐标，以测得的自由基清除率(Y)为纵坐标绘制标准曲线，Y=15.183X+11.563，r=0.9976。自由基的清除率= 1- (Ap-Ac)/Amax ×100%。计算结果实施例1的样品对DPPH清除能力的TEAC值为146.82 (mg GAE/g DW)，结果表明供试样品对DPPH自由基具有较强的清除率，且清除率随供试样品溶液浓度的增大而提高。实验结果表明本发明制备的少花斑鸠菊提取物具有较强的抗氧化活性。

6）抗肿瘤活性实验

本试验通过细胞毒性试验(CCK-8试剂)研究少花斑鸠菊提取物对人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的增殖抑制率，以判断少花斑鸠菊提取物的抗肿瘤活性大小。

实验条件：试验用仪器试药：Cell counting kit/CCK-8试剂盒（日本株式会社同仁化学研究所Dojindo公司）；RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；青霉素和链霉素（美国Sigma公司）；胰蛋白酶（美国AMRESCO公司），实验用肿瘤细胞（上海细胞库）；Tecan Infinite M200酶标仪（瑞士）；酶标板：96孔板。

样品溶液的配制：精密称取一定量少花斑鸠菊提取物干粉（实施例1），用DMSO溶解后用无菌水稀释，使DMSO的含量为5%。将原溶液用含5%DMSO的无菌水稀释成6个不同的浓度梯度。

肿瘤细胞的培养：试验选用的人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞用RPMI-1640的培养基+10%胎牛血清常规传代培养。

抑制率测定：将2种肿瘤细胞胰蛋白酶消化后接种在96孔板上。35℃、5%CO₂温箱培养10 h后更换新的培基，并加入样品溶液，使样品的最后浓度为：20.32、50.30、100.43、150.0、223.0、300.0 μmol · L^-1。温箱继续培养48 h。吸出培基，每孔加入一定量含有10％CCK-8的培基，温箱继续培养6 h，然后在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔（培养基、0.5%DMSO生理盐水），对照孔(细胞、培养基、0.5%DMSO生理盐水)。测定样品在不同浓度下对2种肿瘤细胞的增殖抑制率，抑制率(%)＝（1－A_样品孔/A_对照孔）×100％，试验结果如下表5。

表 5 不同浓度的少花斑鸠菊提取物对肿瘤细胞的增殖抑制率试验结果

供试样品浓度（μmol · L^-1）	20.32	50.30	100.43	150.0	223.0	300.0
							对人乳腺癌细胞的增殖抑制率(%)	17.49	22.54	51.46	69.19	77.32	80.87
对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制率(%)	11.66	25.17	42.85	68.69	73..56	86.08

由表5可以看出：少花斑鸠菊提取物对人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞的增殖均具有一定的抑制作用，抑制强度随化合物浓度的增大而增强。

经相应实验表明，少花斑鸠菊提取物具有一定的抗氧化及抗肿瘤活性，因此具有很好的开发应用价值，可用作食品抗氧剂、食品添加剂及开发药物的原料。

Claims

1.一种植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2）提取：将药材装入渗漉筒中，用30%～70％的含水乙醇浸泡3～6 小时后，用30%～70％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，按照药材重量为1kg则含水乙醇的用量为10～16升的比例，按流速为10～20 mL· min^-1的速度收集渗漉液；

2.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2）中：浸泡时间为4～5小时，含水乙醇的浓度为40%～60％，流速为15～18 mL· min^-1。

3.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3）中：水浴温度为60℃～70℃，真空度为0.093 Mpa，进液流速为200～300mL·min^-1。

4.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为15～20 mL·min^-1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并30%含水乙醇、40%含水乙醇、50%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液。

5.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：先用H₂O洗脱，再依次用10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、65%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，合并35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇和65%含水乙醇各部位的洗脱液。

6.如权利要求1所述的一种植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5）中：减压浓缩温度为60℃～70℃，真空度为0.093 Mpa，进液流速为200～300 mL·min^-1。

7.如权利要求1所述的一种植物提取物在制备防治肿瘤制剂中的应用。