CN1778324A - 驱虫斑鸠菊有效部位及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种驱虫斑鸠菊有效部位，它是从驱虫斑鸠菊成熟果实用中等极性到强极性溶剂提取得到的。它可使黑色素细胞增殖，酪氨酸酶的活性提高和黑色素含量增高；对免疫系统具有抑制作用；对黑色素瘤有抑制作用。本发明也涉及该驱虫斑鸠菊有效部位的制备方法以及在制备治疗色素代谢疾病如白癜风或白发的药物的用途；在制备抑制免疫系统作用药物的用途和在制备抑制黑色素瘤药物的用途。

Description

驱虫斑鸠菊有效部位及其制备方法和用途

发明领域

本发明涉及一种植物有效部位，具体来说，是驱虫斑鸠菊的有效部位，本发明也涉及该有效部位的制备方法和制药用途。

背景技术

白癜风是常见的一种局限性色素减退性皮肤病，发病率为0.5-2.0％，由于致病原因和发病机理目前尚未明确，国际上至今仍处于易诊难治的状况。该病被世界医学界列为疑难病症之一。目前白癜风的药物治疗方法有补骨脂素联合UVA治疗、皮质激素疗法、凯林联合UVA疗法、金属元素配合PUVA疗法、苯丙氨酸配合UVA疗法以及中药疗法。

驱虫斑鸠菊为菊科植物驱虫斑鸠菊Vernonia anthelmintica Willd的瘦果。于夏秋果实成熟时割取；或分别割取成熟果枝，打下果实，存于阴凉干燥处。原产于印度、巴基斯坦，中国新疆已有长约四百年的栽培历史。主要分布于新疆阿克苏地区。是新疆维吾尔民间治疗白癜风的药物，在70年代新疆药学研究人员将其制成医院制剂，应用于临床治疗白癜风，治愈率为7-20％，有效率大于90％，并且未见毒副作用。但是至今对驱虫斑鸠菊中的有效成分尚不清楚。为此，本发明人进行了进一步的筛选分离工作，发现了驱虫斑鸠菊治疗色素代谢疾病如白癜风的有效部位，从而完成了本发明。

发明目的

本发明的目的是提供一种驱虫斑鸠菊有效部位。

本发明的另外一个目的是提供该驱虫斑鸠菊有效部位的制备方法。

本发明的又外一个目的是提供该驱虫斑鸠菊有效部位在制备色素代谢疾病如白癜风的药物的用途。

发明内容

本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位可以由下列方法但不是唯一方法获得：

将驱虫斑鸠菊成熟果实用中等极性到强极性溶剂加热回流，得到提取液，减压回收，浓缩，得到浓缩液，调pH为2-10，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉，就是本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位。

所述的中等到强极性溶剂优选为乙酸乙酯、乙醇或水，最优选0-60％乙醇。我们对提取溶剂的不同选择测定驱虫斑鸠菊有效部位的得率，见下表1。

                                          表1

提取溶剂	水	10％乙醇	20％乙醇	30％乙醇	40％乙醇	60％乙醇	80％乙醇	95％乙醇
									驱虫斑鸠菊有效部位中黄酮含量(％)	45.77	50.12	53.59	57.58	57.17	55.12	35.34	17.67

所述的pH值优选为7-10，驱虫斑鸠菊有效部位含量最高。

本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位可以与药学上可接受的辅料制备成各种内服或外用剂型。

驱虫斑鸠菊有效部位可使黑色素细胞增殖，酪氨酸的活性提高，黑色素含量增高，驱虫斑鸠菊有效部位对细胞免疫、体液免疫具有抑制作用。驱虫斑鸠菊有效部位对黑色素瘤细胞系SKMel-19，SKMel-23，Mel-2A，MeWo，Bro.表现出了抑制作用。

附图简介

图1---驱虫斑鸠菊有效部位在体外对黑色素细胞增殖的影响

图2---驱虫斑鸠菊有效部位在体外对黑色素含量的影响

图3---驱虫斑鸠菊有效部位在体外对黑色素细胞内酪氨酸酶活性的影响。

图4---不同药物对豚鼠皮肤黑色素细胞的影响

图5---驱虫斑鸠菊在外用氢醌后对豚鼠皮肤黑色素细胞的影响

图6---驱虫斑鸠菊有效部位给药前后豚鼠皮肤黑色素细胞的变化

图7---驱虫斑鸠菊有效部位在体内对小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响

图8---驱虫斑鸠菊有效部位在体内对小鼠B淋巴细胞增殖反应的影响

图9---驱虫斑鸠菊有效部位对SRBC致敏小鼠抗体生成的影响

图10---驱虫斑鸠菊有效部位对小鼠皮肤迟发型变态反应的影响

具体的实施方案

实施例1：

将驱虫斑鸠菊成熟果实用60％乙醇加热回流，得到乙醇提取液，减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，调pH为8，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉，就是本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位。

实施例2：

将驱虫斑鸠菊成熟果实用水煎煮，得到提取液，浓缩，得到浓缩液，调pH为7，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉，就是本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位。

实施例3：

将驱虫斑鸠菊成熟果实用95％乙醇加热回流，得到乙醇提取液，减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，调pH为10，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉，就是本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位。

实施例4：

将驱虫斑鸠菊成熟果实用30％乙醇加热回流，得到乙醇提取液，减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，调pH为5，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉，就是本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位。

实施例5

将驱虫斑鸠菊成熟果实用乙酸乙酯加热回流，得到提取液，减压回收，浓缩，得到浓缩液，调pH为2，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉，就是本发明所述的驱虫斑鸠菊有效部位。

试验例1 驱虫斑鸠菊有效部位的体外药效学研究

因白癜风患者皮损区的色素细胞及其功能受损，我们研究了驱虫斑鸠菊原料药对体外培养的人体黑色素细胞的影响。

因白癜风患者皮损区的色素细胞及其功能受损，我们研究了紫铆素对体外培养的人体黑色素细胞的影响。

1.1.实验方案

1.1.1筛选模型：正常人黑色素细胞；

1.1.2.来源：儿童包皮环切手术的多余包皮，无感染。

1.1.3.培养条件：取正常儿童包皮胰酶消化后获得黑色素细胞，在DMEM培养基中添加bFGF，CT，TPA，FCS，双抗等各种因子，5％CO₂，37℃条件下培养7天后进行传代，传代细胞在上述条件下培养48小时后加入不同浓度的药物和对照，测定相关分析指标。

1.1.4.测定方法：细胞增值用MTT法；酪氨酸酶活性测定用多巴染色法；黑色素含量用碱消化法。

1.2.结果

结果表明驱虫斑鸠菊可使黑色素细胞增殖，酪氨酸的活性提高，黑色素含量增高。见图1-3。

实验例2.驱虫斑鸠菊有效部位的体内药效学研究

通过灌胃给药和外擦给药两种方式观察驱虫斑鸠菊制制对棕色豚鼠体内黑色素细胞在基底层所含比例及显微结构的影响。

2.1.实验方案

实验动物：英国短毛豚鼠，新疆实验动物中心提供。

受试药物设置：

驱虫斑鸠菊有效部位(按驱虫斑鸠菊黄酮计)：

高浓度组：288.21mg/kg(按最大耐受量的1/25计算)

中浓度组：144.11mg/kg(按最大耐受量的1/50计算)

低浓度组：72.05mg/kg(按最大耐受量的1/100计算)

阳性对照组：补骨脂注射液(河南医科大学制药厂，豫卫药准字(1985)

第270002号)批号000405

阴性对照组：2.5％氢醌空白对照组；生理盐水

2.2.动物模型的建立

先外用氢醌和补骨脂，观察氢醌、补骨脂注射液对有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞的影响：外用氢醌后，可使有色豚鼠皮肤基底层增厚，使黑色素生成减少这一结果与有关文献相符；使用补骨脂注射液后，可使有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞增加。确定模型成立。见图4。

2.3.不同剂量的驱虫斑鸠菊有效部位对氢醌的拮抗作用

外用氢醌，同时灌服不同剂量的驱虫斑鸠菊有效部位观察不同剂量的驱虫斑鸠菊对氢醌的拮抗作用，来间接反映驱虫斑鸠菊对有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞的影响高、中、低剂量的驱虫斑鸠菊组可以拮抗氢醌的作用，使用药前后有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞无显著性变化(P＞0.05)；但比单用氢醌组有显著性变化(P＜0.01)，其中高、中、低剂量的驱虫斑鸠菊组之问无显著性变化(P＞0.05)。见图5。

2.4.观察不同剂量驱虫斑鸠菊有效部位对有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞的影响：

使用高、中、低剂量的驱虫斑鸠菊组前后有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞有显著性变化(P＜0.05)；高、中、低剂量的驱虫斑鸠菊组之间无显著性差异(P＞0.05)；但在数值上有变化，其中中剂量组对有色豚鼠皮肤基底层黑色素细胞的影响较大；高、中、低剂量的驱虫斑鸠菊组与阳性组比无显著性差异(P＞0.05)。见图6。

实验例3.驱虫斑鸠菊有效部位对小鼠免疫系统的影响

3.1.实验方案

3.1.1.实验模型：培养昆明系小鼠。

3.1.2.动物来源：新疆实验动物中心提供。

3.1.3.受试药物设置：

驱虫斑鸠菊有效部位(按驱虫斑鸠菊黄酮计)：

高浓度组：288.21mg/kg(按最大耐受量的1/25计算)

中浓度组：144.11mg/kg(按最大耐受量的1/50计算)

低浓度组：72.05mg/kg(按最大耐受量的1/100计算)

阳性对照组：补骨脂注射液(河南医科大学制药厂，豫卫药准字(1985)

第270002号)批号000405

阴性对照组：生理盐水

3.2.结果

由于目前病因研究多支持白癜风的发病与免疫系统有关，发现白癜风患者体内有特异性抗体存在。进行驱虫斑鸠菊有效部位对小鼠免疫系统影响的研究，结果显示：驱虫斑鸠菊对免疫系统具有抑制作用。见图7--10。

实验例4驱虫斑鸠菊有效部位在体外对黑色素瘤细胞的影响

由于驱虫斑鸠菊有效部位可使黑色素细胞增殖，我们考察了其在体外对黑色素瘤细胞系的影响。

4.1.筛选模型：黑色素瘤细胞系SKMel-19，SKMel-23，Mel-2A，MeWo，Bro；

4.2.来源：德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学研究中心。

4.3.培养条件：在DMEM培养基中添加FCS，双抗等各种因子，5％CO₂，37℃条件下培养24小时后加入不同浓度的药物和对照，测定相关分析指标。

4.4.测定方法：细胞增值用MTT法。

4.5.结果

驱虫斑鸠菊有效部位可对黑色素瘤细胞系SKMel-19，SKMel-23，Mel-2A，MeWo，Bro表现出了不同程度的抑制作用。

实验例5

驱虫斑鸠菊有效部位一般药理学实验资料的研究，对给药后小鼠的心、肝、脾、肾、肠进行了病理分析，并观察其活动，未见明显异常。对麻醉猫的血压、呼吸频率、心率均无明显影响。

急性毒性实验表明：给药剂量相当于临床拟用药量120倍，昆明普系小鼠末出现明显异常反应，观察7天，动物末见死亡。最大耐受量实验表明：给药剂量相当于临床拟用药量360倍，观察7天仍未见死亡，小鼠出现自发活动减少等症状。病理学检查显示小鼠肝脏细胞出现肿胀，可见多处灶性坏死，分裂相增多，脾窦内可见散在多核巨细胞浸润。小鼠口服驱虫斑鸠菊有效部位MTD＞19.23g/kg。

Claims (14)

1.驱虫斑鸠菊有效部位，它可以由下列方法获得：将驱虫斑鸠菊成熟果实用中等极性到强极性溶剂加热回流，得到提取液，减压回收，浓缩，得到浓缩液，调pH为2～10，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液浓缩干燥得到浸膏粉。

2.根据权利要求1所述的驱虫斑鸠菊有效部位，它可以由下列方法获得，其中中等极性到强极性溶剂为乙酸乙酯、乙醇或水。

3.根据权利要求2所述的驱虫斑鸠菊有效部位，它可以由下列方法获得，其中0-60％的乙醇。

4根据权利要求1～3中任何一个所述的驱虫斑鸠菊有效部位，它可以由下列方法获得，其中pH为7～10。

5.驱虫斑鸠菊有效部位的制备方法，它包括下列步骤：

将驱虫斑鸠菊成熟果实用中等极性到强极性溶剂加热回流，得到提取液，减压回收，浓缩，得到浓缩液，调pH为2～10，离心分离，得到上清液，将上清液通过大孔吸附树脂依次用水和乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，得到浓缩液，用石油醚脱脂，分离醚层和水层，将水溶液干燥得到浸膏粉。

6.根据权利要求5所述的驱虫斑鸠菊有效部位制备方法，其中中等极性到强极性溶剂为乙酸乙酯、乙醇或水。

7.根据权利要求6所述的驱虫斑鸠菊有效部位制备方法，其中0-60％的乙醇。

8.根据权利要求5～7中任何一个所述的驱虫斑鸠菊有效部位制备方法，其中pH为7～10。

9.权利要求1～4中任何一个所述的驱虫斑鸠菊有效部位在制备增殖黑色素细胞、提高酪氨酸酶的活性和增高黑色素含量药物的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述的药物为治疗色素代谢疾病的药物。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述的药物为治疗白癜风的药物。

12.根据权利要求10所述的用途，其中所述的药物为治疗白发的药物。

13.权利要求1～4中任何一个所述的驱虫斑鸠菊有效部位在制备抑制免疫系统作用药物的用途。

14.权利要求1～4中任何一个所述的驱虫斑鸠菊有效部位在制备抑制黑色素瘤药物的用途。

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