CN106755276A - 一种从植物中快速筛选细菌生物膜抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

一种从植物中快速筛选细菌生物膜抑制剂的方法，该方法首先制备植物提取物或者植物柱层析组分，采用结晶紫染色法研究植物提取物或植物柱层析组分抑制有害细菌生物膜的活性；然后采用色谱-质谱联用技术分析植物组分作用细菌前后的成分变化，并进行多元数据统计分析，结合活性验证实验结果，筛选出该植物中抑制细菌生物膜的主要有效成分。本方法能够对植物中抑制生物膜的有效成分进行快速筛选，为天然植物中抗生物膜活性化合物的高通量、快速筛选提供了一种便捷的新途径。

Description

一种从植物中快速筛选细菌生物膜抑制剂的方法

技术领域

本发明属于天然产物领域，本发明涉及从植物中筛选细菌生物膜抑制剂的方法。

背景技术

生物膜是细菌在固体表面生长时采取的一种较为独特的群体生活方式，是高度组织化的多细胞结构。生物膜细菌构成一种自我保护模式，其生理和行为与浮游状态的细菌不同。在食品行业，有害菌生物膜是一个顽固的污染源，会造成食品变质，容易引起公共健康问题。有害菌生物膜是引起各种细菌相关疾病的首要因素，也是人类健康的主要威胁。然而，生物膜细菌对抗生素和杀菌消毒剂的耐药性比浮游的非生物膜细菌强10-1000倍，传统的清洗和消毒疗法对生物膜的控制效率很低。抗生物膜的新成分研究日益受到世人所关注。

大量研究发现，一些天然植物成分对细菌生物膜具有显著的抑制作用，表明植物是筛选天然的生物膜抑制剂的良好资源。但是，大部分植物抗细菌生物膜的有效成分尚未确定，目前，研究植物抗细菌生物膜的物质基础，主要是采用活性筛选、分离纯化的方法。采用溶剂萃取、柱层析、制备液相分离等方法对植物成分进行多步分离，根据分离所得组分抗细菌生物膜的活性，逐步筛选出抗细菌生物膜的活性成分。通过这种方法，能够准确的筛选出抗细菌生物膜的活性成分，并且得出制备这些活性成分的方法。由于天然植物中潜在的生物膜抑制成分很多，而现有方法是采用逐一提取纯化、富集再检验活性的方式，这种模式使得单一植物的研究都需要耗时巨大。需要寻找一种全新的活性成分筛选方法。本发明针对以上问题，基于色谱-质谱联用技术和数据分析探索一种筛选抗细菌生物膜的活性化合物的新途径，以期为研究植物抗生物膜的物质基础提供新思路和新方法。

发明内容

本发明提供的是一种从植物中快速筛选细菌生物膜抑制剂的方法，包括以下步骤：

(1)制备植物提取物或者柱层析组分

可以采用加热搅拌提取、超声波辅助提取、微波辅助提取、酶法提取等方法制备提取物，然后采用大孔树脂、聚酰胺树脂、硅胶等进行柱层析，制备植物柱层析组分。

(2)植物提取物或植物柱层析组分的抑制生物膜活性测定

采用国内外通用的结晶紫染色法，测定植物提取物或者植物柱层析组分的抑制生物膜活性。在超净工作台上，分别加菌液及药物于试管或多孔板等容器中，同时设培养基空白对照，培养数小时。吸掉培养物，用无菌PBS冲洗，用甲醛固定，晾干，然后用1％的结晶紫染色，弃去多余染液后加入95％的乙醇脱色并将溶液移至另一块酶标板，酶标仪570nm进行检测。

(3)分析样品的制备和前处理

第1组样品(植物组分+培养基)：取合适的液体培养基和植物组分混合。

第2组样品(植物组分+培养基+菌液)：分别取适量菌液和植物组分加入到合适的培养基中，并使得第1组和第2组样品中植物组分的终浓度相同。

每个样品都做多个(如3-20个)平行，培养数小时(一般是12-48小时)，将试管等容器中培养好的样品转移至离心管中离心，取上清液；在采用色谱-质谱联用仪器进行测定前，加入三倍体积的乙腈沉淀蛋白质。

(4)仪器分析

选择合适的液相或气相条件和质谱条件，采用液质联用或者气质联用仪器对两组样品进行分析。

(5)数据处理

将液质联用或者气质联用分析检测所得到的图谱，在Masslynx等液质联用数据处理软件或者是其他液质联用、气质联用数据处理软件中对图谱中的峰进行积分处理，处理后得到每个峰的峰面积。得到的包含出峰时间、峰面积、紫外特征、质谱特征的数据矩阵可以进行模式识别。

将经过MarkerLynx 4.1等软件预处理后的二维数据矩阵导入SIMCA-P 11.5等软件中，分别采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等方法进行模式识别，得到得分矩阵图和载荷矩阵图，显示出作用细菌前后两者表现出了明显的类聚模式，能很好的区分开，继续进行进一步分析，并得到各变量的VIP值，根据VIP值可以筛选出影响较大的变量作为候选标记物。选取模型中对分型影响较大的变量，根据VIP值来确定，将这些变量作为候选标志物，并选取抑制细菌后含量变小的变量，这些筛选出的变量(峰)就是可能具有生物膜抑制作用的成分。

(6)筛选出的活性成分活性验证

采用国内外通用的结晶紫染色法，研究这些筛选得出的潜在活性成分抑制细菌生物膜形成的活性，最终选择出具有生物膜抑制活性的化合物，这些成分就是植物提取物或柱层析组分中抑制生物膜的主要活性化合物。

本发明的有益效果是：通过分析植物作用细菌前后的体系中成分变化，并进行一系列数据统计和分析，就可以筛选出植物中抑制生物膜的多个活性化合物。这种方法省去或简化了传统活性成分筛选中需要用到的多次逐步分离纯化和多次活性评价的过程，大大简化了活性成分的筛选过程，省去了大量的人力和物力，有利于显著加快活性成分的筛选速度，大幅提高筛选效率，为天然植物中生物膜抑制成分的快速、便捷筛选提供了一种新的途径。

具体实施方式

实施例1

(1)植物组分制备

首先采用30％乙醇提取牛蒡叶，得到牛蒡叶粗提取物，然后采用大孔树脂柱层析对牛蒡叶提取物进行纯化，得到水洗脱组分、34％乙醇洗脱组分等2个组分。

(2)结晶紫染色法测定植物组分对细菌生物膜的抑制活性

在超净工作台上，分别加铜绿假单胞菌菌液(对数期细菌)及牛蒡叶34％乙醇洗脱柱层析组分于24孔PVC板，并做4个平行，同时设LB空白对照和不加牛蒡叶组分的阴性对照组，培养24小时。培养结束后，吸掉培养物，用无菌PBS洗去浮游菌，向各孔中加入1mL无水甲醇用来固定生物膜15min，将培养板在50℃下晾干，加入500μL 1％的结晶紫染色液于各孔中染色10min，之后用PBS缓冲液进行冲洗，加入95％的乙醇进行脱色，并将溶液移至另一块96孔酶标板，酶标仪570nm进行检测。结果发现，牛蒡叶柱层析组分能够显著抑制细菌生物膜的形成。

(3)分析样品的制备

第1组样品(植物组分+培养基)：取900μL灭菌的LB液体培养基和100μL牛蒡叶34％乙醇洗脱组分，使得牛蒡叶组分的终浓度为2mg/mL。

第2组样品(牛蒡叶34％乙醇洗脱柱层析组分+培养基+铜绿假单胞菌菌液)：分别取100μL菌液和100μL牛蒡叶34％乙醇洗脱组分于灭完菌的800μL培养基中，同样，使得牛蒡叶组分终浓度为2mg/mL。

每个样品都做6个平行，一共有12个样本。将上述的两组样品，在37℃下培养24小时，之后取出进行离心(8000rpm，10min)处理。由于样品中含有蛋白质，所以进行UPLC-MS分析前需要去除蛋白质，采用乙腈沉淀法。采用3倍体积的4摄氏度的乙腈加到样品中进行涡旋30s，4℃静置10min后，12000r/min离心，将上清液转移到EP管中，送样前贮存于-20℃条件下。

(4)UPLC-MS分析

色谱条件：采用Acquity BEH C18分析柱(7μm，50×2.1mm，Waters，USA)，自动进样初始温度为4℃，每次进样5μL，柱温43℃，流速0.53mL/min，流动相组成为：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为纯乙腈，采用梯度洗脱的方式：0-3min，5％-70％B，3-8min，90％B，8-10min，100％B，10-15min，5％-100％B，15-25min，5％B。

质谱条件：质谱采集采用负离子模式，检测参数设置为：离子源温度100℃，毛细管电压3.0Kv，锥孔电压20V，脱溶剂气温度400℃，锥孔气流量50L/h，脱溶剂气流量700L/h，采集时间范围0-25min。

(5)数据处理和活性验证

UPLC-MS分析检测所得到的图谱，在Masslynx软件中直接对总离子色谱图中的峰进行积分处理，处理后得到每个峰的峰面积。这个包含出峰时间、相应峰面积和质谱特征等的数据矩阵直接可以进行模式识别。

数据导出后，得到一个12个样品×2850个变量的原始数据矩阵。去掉数据矩阵中的缺失值并筛选峰面积减少的变量，最后得到一个12个样品×1205个变量的数据矩阵进行模式识别。PCA分析后显示牛蒡叶组分作用菌液前后存在显著性的区别，进而通过PLS-DA分析，根据VIP值进行筛选，选取VIP＞1.2的变量作为候选标志物。最终共筛选出47个含量显著减少的成分，这些成分都是潜在的生物膜抑制成分。根据化合物的保留时间、质谱、紫外特征，将这些信息与标准品、文献、相关数据库等进行比对分析，鉴定这些筛选出的含量显著减少的化合物的结构。

然后，将鉴定出来的化合物进行抑制生物膜活性的测定，结果表明，鉴定出的化合物中，绿原酸、熊果酸、咖啡酸、芦丁和对香豆酸这5个化合物具有显著生物膜抑制活性。因此最终筛选出，绿原酸、熊果酸、咖啡酸、芦丁和对香豆酸这5种成分是牛蒡叶中抑制生物膜的主要活性化合物。

因此，通过分析牛蒡叶抑制前后细菌生物膜代谢组的变化，并进行一系列数据统计和分析，完成结构鉴定，就可以筛选出牛蒡叶中抑制生物膜的多个活性化合物。这种方法省去或简化了传统活性成分筛选中需要用到的多次逐步分离纯化和多次活性评价的过程，大大简化了活性成分的筛选过程，省去了大量的人力和物力，有利于显著加快活性成分的筛选速度，大幅提高筛选效率，为植物中生物膜抑制成分的快速、便捷筛选提供了一种新的途径。

实施例2

(1)植物组分制备

鱼腥草干品粉碎，采用30％乙醇提取12h，得到的混合液先进行离心，抽滤除去滤渣，将提取液在50℃下旋转蒸发，进行浓缩得到浓缩液。

将鱼腥草浓缩液加入处理后的HPD100大孔树脂中进行柱层析，分别用3倍柱体积的纯水、30％乙醇溶液进行柱层析洗脱，收集洗脱液。取30％乙醇洗脱液，旋转蒸发浓缩后置于真空干燥箱中干燥，得到的样品即为30％乙醇洗脱的鱼腥草柱层析组分，备用。

(2)结晶紫染色法测定植物组分对细菌生物膜的抑制活性

在超净工作台上，分别加大肠杆菌菌液(对数期细菌)及鱼腥草30％乙醇洗脱柱层析组分于24孔PVC板并做4个平行，同时设LB空白对照和不加鱼腥草组分的阴性对照组，培养24小时。培养结束后，吸掉培养物，用无菌PBS洗去浮游菌，向各孔中加入1mL无水甲醇用来固定生物膜15min，将培养板在50℃下晾干，加入500μL 1％的结晶紫染色液于各孔中染色10min，之后用PBS缓冲液进行冲洗，加入95％的乙醇进行脱色，并将溶液移至另一块96孔酶标板，酶标仪570nm进行检测。结果发现，鱼腥草柱层析组分能够显著抑制细菌生物膜的形成。

(3)样品的制备

第1组样品(植物组分+培养基)：取900μL灭菌的LB液体培养基和100μL鱼腥草30％乙醇洗脱组分，使得鱼腥草组分的终浓度为0.5mg/mL。

第2组样品(鱼腥草30％乙醇洗脱柱层析组分+培养基+大肠杆菌菌液)：分别取100μL菌液和100μL鱼腥草30％乙醇洗脱柱层析组分于灭完菌的800μL的培养基中，同样，使得鱼腥草组分终浓度为0.5mg/mL。

每个样品都做6个平行，一共有12个样本。将上述的两组样品，在37℃下培养24小时，之后取出进行离心(8000rpm，10min)处理。由于样品中含有蛋白质大分子，所以进行UPLC-MS分析前需要去除蛋白质，采用乙腈沉淀法。采用3倍体积的4摄氏度的乙腈加到样品中进行涡旋30s，4℃静置10min后，12000r/min离心，将上清液转移到EP管中，送样前贮存于-20℃条件下。

(4)UPLC-MS分析

色谱条件：进样量为5μL，用Waters Acquity UPLC/Q-TOF Micro MS系统，BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm)，柱温：40℃，流动相：A，0.1％甲酸乙腈溶液；B，0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱。

质谱条件：离子源：电喷雾电离(ESI)(-)，毛细管电压：2.5kV，锥孔电压：25V，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度：400℃，离子碰撞能量16eV。

(5)数据处理和活性验证

U3PLC-MS分析检测所得到的图谱，在Masslynx软件中对谱图中的峰进行积分处理，处理后得到每个峰的峰面积。这个包含出峰时间、相应峰面积和质谱特征等的数据矩阵直接可以进行模式识别。本次处理得到的矩阵中包括了12个样品中成分的保留时间和相应的峰面积、荷质比(分子特征)以及荷质比的规范化信号强度等。随后，对处理后的数据进行多元统计分析，PCA分析后显示鱼腥草组分作用菌液前后存在显著性的区别，进而通过PLS-DA分析，根据VIP值进行筛选，选取VIP＞1.5的变量作为候选标志物。并结合峰面积的显著降低筛选峰，最终共筛选出56个含量显著减少的成分，这些成分都是潜在的生物膜抑制成分。根据化合物的保留时间、质谱、紫外特征，将这些信息与标准品、相关数据库进行比对分析，鉴定这些筛选出的含量显著减少的化合物的结构。

然后，将鉴定出来的化合物进行抑制生物膜活性的测定，结果表明，鉴定得出的槲皮苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮素这4种化合物具有显著的生物膜抑制活性。因此最终筛选出，槲皮苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮素这4种成分是鱼腥草中抑制生物膜的主要活性化合物。

Claims (1)

1.一种从植物中快速筛选细菌生物膜抑制剂的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备植物提取物或者柱层析组分

采用加热搅拌提取、超声波辅助提取、微波辅助提取、酶法提取等方法制备提取物，然后采用大孔树脂、聚酰胺树脂、硅胶等进行柱层析，制备植物柱层析组分。

(2)植物提取物或柱层析组分的抑制生物膜活性测定

采用国内外通用的结晶紫染色法，测定植物提取物或者植物柱层析组分的抑制生物膜活性。在超净工作台上，分别加菌液及药物于试管等容器中，同时设培养基空白对照，培养数小时。吸掉培养物，用无菌PBS冲洗，用甲醛固定，晾干，然后用1％的结晶紫染色，弃去多余染液后加入95％的乙醇并将溶液移至另一块酶标板，酶标仪570nm进行检测。

(3)分析样品的制备和前处理

第1组样品(植物组分+培养基)：取合适的液体培养基和植物组分混合。

第2组样品(植物组分+培养基+菌液)：分别取适量菌液和植物组分于合适的培养基中，并使得第1组和第2组样品中植物组分的终浓度相同。

每个样品都做多个(如3-20个)平行，恒温培养数小时(一般是12-48小时)，将试管或其他培养容器中培养好的样品转移至离心管中离心，取上清液，在采用色谱-质谱联用仪器进行测定前，加入三倍体积的乙腈沉淀蛋白质。

(4)仪器分析

选择合适的色谱条件和质谱条件，采用液质联用或者气质联用仪器对两组样品进行分析。

(5)数据处理

将液质联用或者气质联用分析检测所得到的图谱，在Masslynx等软件或者是其他液质联用、气质联用数据处理软件中对色谱质谱图中的峰进行积分处理。得到的这个包含出峰时间、峰面积、紫外特征、质谱特征的数据矩阵可以进行模式识别。

将经过软件预处理后的二维数据矩阵导入SIMCA-P 11.5等软件中，分别采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等方法进行模式识别，得到得分矩阵图和载荷矩阵图等，显示出植物组分处理细菌前后的两组样品表现出了明显的类聚模式，并能很好的区分开，说明两者有较大的差异，并得到各变量的VIP值，根据VIP值可以筛选出影响较大的变量作为候选标记物。选取模型中对分型影响较大的变量，根据VIP值来确定，将这些变量作为候选标志物；并选取抑制细菌后含量变小的变量，这些筛选出的变量(峰)对应的化合物就是可能具有生物膜抑制作用的成分。

(6)筛选出的活性成分活性验证

采用国内外通用的结晶紫染色法，研究步骤(5)中筛选出来的潜在活性成分抑制细菌生物膜形成的活性，最终选择出具有生物膜抑制活性的化合物，这些成分就是植物提取物或柱层析组分中抑制生物膜的主要活性化合物。